宋 偉, 劉開永, 陳莉君, 王 鈺, 倪亞超, 胡亞蓉, 賈學(xué)穎, 韓 芳, 劉宇欣, 周典兵

(1. 人口健康與優(yōu)生安徽省重點(diǎn)實驗室(安徽醫(yī)科大學(xué)), 安徽 合肥 230032; 2. 合肥海關(guān)技術(shù)中心,安徽 合肥 230022; 3. 安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 安徽 合肥 230032)

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用量較高[1,2],長期食用含有農(nóng)藥殘留的食品是農(nóng)藥在人體內(nèi)逐漸蓄積的一大重要途徑[3]。日常生活中攝入帶有微量農(nóng)藥殘留的食物雖然不能直接導(dǎo)致明顯傷害,但通過在人體內(nèi)的代謝、吸收和富集,會對健康造成潛在的威脅,如癌變、神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)和畸變等[4-6]。

尿液常作為農(nóng)藥低劑量暴露的被監(jiān)測生物樣本,在一般人群研究中,現(xiàn)場尿樣收集相對方便,目前國內(nèi)外已有很多學(xué)者針對人體尿液中農(nóng)藥殘留開展了相關(guān)研究。Luiz等[7]利用槍頭式分散固相微萃取技術(shù),結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法研究建立了人群尿液中殺線威、殘殺威、克百威、3-羥基克百威、西維因、甲硫威、特丁硫磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷、毒死蜱和硫丹等11種農(nóng)藥的測定方法,檢出限為0.76～1.52 μg/L,定量限為2.5～5.0 μg/L。Fierová等[8]將QuEChERS與固相萃取技術(shù)相結(jié)合,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了人體尿液中磷酸二乙酯等15種農(nóng)藥代謝物的定性定量檢測方法,并對20份南非兒童尿樣進(jìn)行了監(jiān)測。Iqbal等[9]使用改良的QuEChERS法提取,氣相色譜-質(zhì)譜測定,建立了人群血液和尿液中9種農(nóng)藥的測定方法,農(nóng)藥種類涉及有機(jī)磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯等多類農(nóng)藥,定量限均達(dá)到0.01 mg/L。金玉娥等[10]采用酸水解,液液萃取,液相色譜C18柱分離,大氣壓化學(xué)電離源質(zhì)譜檢測,建立了人尿中3種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥代謝物3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid)和順式-、反式-3-(2,2-二氯乙烯基)-2,2-二甲基環(huán)丙烷-1-羧酸的定量方法,3種代謝物的檢出限為0.20 μg/L。

有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、新煙堿類農(nóng)藥及活性代謝物的大量使用已造成不同人群多種途徑的普遍暴露[11-15]。以每年市場監(jiān)督管理局發(fā)布的食用農(nóng)產(chǎn)品抽檢信息統(tǒng)計來看,蔬菜、水果、茶葉等食品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)時有報道,涉及多類農(nóng)藥。目前針對人體尿樣中農(nóng)藥及代謝物殘留的檢測方法多集中于針對幾種或者幾類農(nóng)藥殘留的測定,而針對人尿液中農(nóng)藥殘留高通量檢測方法的研究還較少。

本實驗以人尿液為研究對象,參考當(dāng)前食品農(nóng)藥使用情況相關(guān)文獻(xiàn)報道[16-20]、市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品抽檢監(jiān)測信息及實驗室農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲備情況,從有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、新煙堿類、甲氧基丙烯酸酯類等多個類別農(nóng)藥中選取118種常見農(nóng)藥,以QuEChERS前處理技術(shù)為凈化手段,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,建立了尿液中118種農(nóng)藥的快速篩查方法。本法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn),為人尿液中農(nóng)藥的高通量快速測定提供了可靠的監(jiān)測技術(shù),以期為后續(xù)健康風(fēng)險評估提供重要技術(shù)手段及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1290-6460超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司); Vortex-Genie 2渦旋混勻器(美國Scientific Industries公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國TEDIA公司);甲酸(LC-MS級,美國ACS公司);甲酸銨、鹽酸、無水MgSO4、NaCl(分析純,上海國藥集團(tuán));C18、N-丙基乙二胺(PSA)(美國Agilent公司);實驗用水均為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm); 118種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥98%(天津阿爾塔科技有限公司)。尿液樣品來自于安徽醫(yī)科大學(xué)。本研究方案通過安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會論證審查(批準(zhǔn)號:20189999)。

1.2 樣品前處理

移取試樣5 mL于50 mL塑料離心管中,加入1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0。再加入10 mL乙腈,加蓋渦旋振蕩2 min后加入5 g無水MgSO4、 1 g NaCl,再加蓋渦旋振蕩1 min,以8 000 r/min離心5 min,將6 mL上層清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中,加入300 mg C18、300 mg PSA和900 mg無水MgSO4,渦旋1 min后以8 000 r/min離心5 min,收集3 mL上清液于玻璃離心管中,在40 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈?隨后用300 μL初始流動相復(fù)溶,過0.22 μm有機(jī)相濾膜,供UHPLC-MS/MS分析。

1.3 UHPLC-MS/MS條件

1.3.1色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);流動相:A相為0.01%甲酸水溶液(含2 mmol/L甲酸銨), B相為0.01%甲酸甲醇溶液(含2 mmol/L甲酸銨)。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 5%B; 0.5～1.5 min, 5%B～20%B; 1.5～2.5 min, 20%B～50%B; 2.5～8.0 min, 50%B～80%B; 8.0～9.0 min, 80%B～98%B; 9.0～11.0 min, 98%B; 11.0～11.5 min, 98%B～5%B; 11.5～15.0 min, 5%B。流速:0.3 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離源(ESI),正負(fù)離子切換模式;鞘氣溫度:320 ℃;鞘氣流速:11 L/min;霧化氣壓力:276 kPa;干燥氣溫度:350 ℃;干燥氣流速:10 L/min;毛細(xì)管電壓:4 000 V。動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(DMRM)模式:其他參數(shù)見表1。

表1 118種農(nóng)藥的母離子、子離子、碎裂電壓、碰撞能量及保留時間

1.4 數(shù)據(jù)庫的建立

本實驗將118種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述儀器分析條件進(jìn)樣,獲得該條件下的母離子、碎裂電壓、子離子、碰撞能量、保留時間,利用MassHunter軟件建立118種農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

為提高前處理工作效率,實驗采用QuEChERS 法進(jìn)行提取、凈化。尿液基質(zhì)主要成分為水分,除此之外還含有蛋白質(zhì)、葡萄糖、尿酸、尿素以及無機(jī)鹽等內(nèi)源性物質(zhì)[21],這些內(nèi)源性物質(zhì)一方面會對痕量農(nóng)藥殘留目標(biāo)物的分析造成干擾,另一方面也會對色譜柱及質(zhì)譜造成損害,需要有效的提取、凈化方法去除雜質(zhì)干擾。目前,農(nóng)藥殘留檢測前處理方法常用的提取試劑主要有乙腈、乙酸乙酯、丙酮等。其中乙酸乙酯與水較易分離,但對于強(qiáng)極性農(nóng)藥,其無法從含水基質(zhì)中萃取完全。丙酮雖然可以從樣品中很好地提取出殘留農(nóng)藥,但同時也會提取出大量內(nèi)源性干擾物質(zhì),另外其水溶性過強(qiáng),難與基質(zhì)中的水分分開,增加了分離難度。乙腈具有蛋白質(zhì)沉淀作用,對尿液中的脂質(zhì)溶解度低,利于在提取多組分農(nóng)藥的同時減少內(nèi)源性基質(zhì)干擾,另外其極性較大,穿透能力強(qiáng),能夠提取的農(nóng)藥范圍寬、種類多,因此選用乙腈作為提取試劑。

尿液的pH值對于農(nóng)藥的提取效果有一定影響,文獻(xiàn)報道有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥、苯氧乙酸類除草劑等在堿性條件下容易發(fā)生水解[22,23]。實驗分別考察了3.0、5.0、7.0、9.0 4種pH條件下118種農(nóng)藥的提取效果,其中甲硫威砜、甲硫威亞砜在pH 9.0的條件下回收率低于20%。在尿液樣品中加入鹽酸使尿液保持酸性有利于防止部分農(nóng)藥因尿液堿化而分解,抑制苯氧羧酸類除草劑等農(nóng)藥電離,提高溶劑提取率?？傮w來看,pH 5.0條件下118種農(nóng)藥的提取回收率優(yōu)于pH 3.0。綜合考慮,實驗最終采用加入1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)尿樣pH至5.0,再加入乙腈提取。

QuEChERS樣品前處理方法常用的鹽析劑包括NaCl、無水MgSO4等。其中加入NaCl可以調(diào)節(jié)溶液的極性從而影響液液分配,有利于極性農(nóng)藥的萃取。無水MgSO4與水發(fā)生水合作用釋放熱量,可以使萃取溶液的溫度達(dá)到40～45 ℃,有利于農(nóng)藥的萃取。通過對比,單獨(dú)使用5 g NaCl時,有機(jī)相與水相能夠分離,但部分農(nóng)藥提取回收率低于80%;單獨(dú)使用5 g無水MgSO4時,水分不能完全除去且與有機(jī)相不能有效分離。而在聯(lián)合使用5 g無水MgSO4及1 g NaCl時,更加有利于有機(jī)相與水相的分離和農(nóng)藥的提取,118種農(nóng)藥的回收率均高于80%。綜合考慮,實驗選用5 g無水MgSO4和1 g NaCl作為除水鹽析劑。

2.2 凈化方法的選擇

目前常見的QuEChERS凈化吸附劑包括C18、PSA、石墨化炭黑(GCB)及無水MgSO4,其中C18對脂類、甾醇等非極性化合物有較強(qiáng)的吸附作用,PSA可通過氨基的弱離子交換作用和極性基質(zhì)成分形成氫鍵,從而吸附和消除糖類、色素、有機(jī)酸及金屬離子等雜質(zhì),GCB主要用于去除甾醇和弱極性色素,但對非極性和具有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥也有一定的吸附,無水MgSO4一般作為除水劑[24-27]。實驗發(fā)現(xiàn)PSA、C18、MgSO4對所選取的118種農(nóng)藥化合物沒有明顯的吸附作用,在尿樣提取液中加入C18、PSA和無水MgSO4,可獲得良好的凈化效果,而GCB對于多菌靈等非極性和具有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥吸附明顯。取6 mL提取液,對比150 mg C18+150 mg PSA+900 mg無水MgSO4、 300 mg C18+300 mg PSA+900 mg無水MgSO4、 600 mg C18+600 mg PSA+900 mg無水MgSO43種吸附劑組合的凈化效果,結(jié)果見圖1。結(jié)果表明,在使用300 mg C18+300 mg PSA+900 mg無水MgSO4的條件下,基質(zhì)干擾可得到有效降低,且118種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)均低于20%,滿足實驗要求;而使用600 mg C18+600 mg PSA+900 mg無水MgSO4的吸附劑組合時,26%的農(nóng)藥受到吸附影響,回收率有一定降低。最終凈化方法選用300 mg C18+300 mg PSA+900 mg無水MgSO4作為吸附劑。

圖 1 經(jīng)不同吸附劑組合凈化后兩個基質(zhì)效應(yīng)水平的農(nóng)藥比例Fig. 1 Pesticide percentages at two levels of matrix effects (MEs) purified by different adsorbent combinations

2.3 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

本實驗選用ZORBAX Eclipse Plus C18作為分離柱,有機(jī)相為0.01%甲酸甲醇溶液(含2 mmol/L甲酸銨),水相為0.01%甲酸水溶液(含2 mmol/L甲酸銨)。在流動相中加入0.01%甲酸能夠顯著提高各農(nóng)藥的響應(yīng)值,加入2 mmol/L甲酸銨后能夠減少色譜峰拖尾,獲得更好的峰形。通過優(yōu)化,采用1.3節(jié)中梯度洗脫條件,118種農(nóng)藥實現(xiàn)了良好的分離,各化合物的保留時間見表1。

分別采用正離子掃描模式(ESI+)和負(fù)離子掃描模式(ESI-)對118種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子掃描。除氟蟲腈、氟蟲腈砜在負(fù)離子掃描模式下得到準(zhǔn)分子離子峰外,其余農(nóng)藥采用正離子掃描模式均可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。進(jìn)一步對118種農(nóng)藥的子離子、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后的質(zhì)譜分析參數(shù)詳見表1。利用MassHunter軟件建立118種農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫,調(diào)取數(shù)據(jù)庫信息建立DMRM方法。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評價

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除了目標(biāo)分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響。使用ESI作為電離源時,容易出現(xiàn)離子化抑制現(xiàn)象,常常對分析物的電離有顯著的干擾,并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。實驗分別用溶劑和空白基質(zhì)溶液配制1、2.5、5、10、25、50 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以峰面積對相應(yīng)的質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后比較這兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的差異,從而判斷基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱。計算公式:基質(zhì)效應(yīng)=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100%。結(jié)果如表2所示,118種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)均為基質(zhì)抑制效應(yīng),且基質(zhì)效應(yīng)均小于20%,采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液即可進(jìn)行定量。

表2 尿液中118種農(nóng)藥的決定系數(shù)(r2)、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)(n=6)

2.5 方法的線性關(guān)系、定量限、回收率和精密度

配制1、2.5、5、10、25、50 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,在已建立的分析條件下進(jìn)行測定,以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,118種農(nóng)藥的決定系數(shù)均大于0.999(見表2),表明線性關(guān)系良好。以空白尿液樣品加標(biāo),按本方法前處理后分析檢測,當(dāng)樣品中農(nóng)藥含量大于0.10 μg/L時,儀器信噪比均大于3,當(dāng)樣品中農(nóng)藥含量大于0.50 μg/L時,儀器信噪比均大于10,因此確定檢出限為0.10 μg/L,定量限為0.50 μg/L。

向空白尿液樣品中添加118種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,添加水平分別為0.50、1.00、5.00 μg/L,然后按照1.2節(jié)和1.3節(jié)方法進(jìn)行提取、凈化和檢測。每個水平重復(fù)6次試驗,118種農(nóng)藥的平均回收率為70.2%～104%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～9.3%(見表2)。

2.6 實際樣品的檢測

應(yīng)用本文所建立的方法對10份尿液樣品進(jìn)行檢測,將檢出的色譜峰保留時間、離子豐度比分別與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時間、離子豐度比相比較,經(jīng)確證,共檢出6種農(nóng)藥,保留時間偏差均在±0.1 min之內(nèi),離子豐度比偏差均在±20%內(nèi),檢測結(jié)果見表3,代表性MRM圖譜如圖2所示。

表3 10份尿液樣品的檢測結(jié)果

由于樣品來自同一區(qū)域,10份尿樣檢出農(nóng)藥比較集中,以新煙堿類農(nóng)藥為主,其中10份尿樣均檢出農(nóng)藥噻蟲胺,2份尿樣的農(nóng)藥含量小于定量限,其余尿樣的農(nóng)藥含量分布在0.52～3.65 μg/L。9份尿樣檢出農(nóng)藥噻蟲嗪,其中4份尿樣含量小于定量限,其余尿樣的農(nóng)藥含量分布在0.83～1.31 μg/L。2份尿樣檢出農(nóng)藥呋蟲胺,其中1份尿樣的農(nóng)藥含量小于定量限,1份尿樣的農(nóng)藥含量為0.61 μg/L。1份尿樣檢出農(nóng)藥啶蟲脒,含量為0.58 μg/L。另外尿樣3共檢出5種農(nóng)藥,除檢出新煙堿類農(nóng)藥外,還檢測到異丙隆和烯酰嗎啉,分別為0.53 μg/L和0.72 μg/L。噻蟲嗪、噻蟲胺是高效低毒殺蟲劑,噻蟲嗪也可以代謝轉(zhuǎn)化為噻蟲胺。尿液中檢出噻蟲嗪、噻蟲胺頻次較高與當(dāng)前食用農(nóng)產(chǎn)品生長過程中該類農(nóng)藥使用情況關(guān)聯(lián)性較高,如近些年市場監(jiān)管部門抽檢公布的食用農(nóng)產(chǎn)品抽檢不合格信息中[28-30],香蕉、辣椒、姜、豇豆等果蔬中噻蟲嗪、噻蟲胺不合格情況時有發(fā)生,有的甚至超標(biāo)嚴(yán)重,需引起重視。

圖 2 尿液樣品中6種農(nóng)藥的代表性MRM色譜圖Fig. 2 Representative MRM chromatograms of six pesticides in urine samples

3 結(jié)論

本實驗建立了檢測尿液中118種農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。樣品中農(nóng)藥采用乙腈提取,以C18、PSA、無水MgSO4為凈化吸附劑經(jīng)QuEChERS法凈化,采用UHPLC-MS/MS檢測,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明,該方法可以同時對尿液中118種農(nóng)藥進(jìn)行快速篩查及準(zhǔn)確測定。該方法快速、準(zhǔn)確,分析通量高,可以為人尿液中多農(nóng)藥殘留的快速篩查和準(zhǔn)確定性定量提供方法依據(jù)。