胡 貝, 李麗霞, 丁曉萍, 劉 紅, 黃 偉, 呂 穩(wěn), 李曉健

(湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院, 湖北省藥品質(zhì)量檢測(cè)與控制工程技術(shù)研究中心, 湖北 武漢 430075)

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[1]是國家及省級(jí)化妝品監(jiān)督抽檢工作的檢驗(yàn)和判定依據(jù),其中列出的禁用原料按是否具有功效分為兩類:一類在化妝品中不具有功效,且不太可能以原料或雜質(zhì)的形式出現(xiàn)在化妝品中;另一類在化妝品中具有一定的功效,如具有美白祛斑、抗菌消炎、抗過敏、改善紅血絲、舒緩助眠和增加香味等功能。目前,許多禁用原料在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中尚無檢測(cè)方法,但已有學(xué)者檢出了非法添加標(biāo)準(zhǔn)方法以外的禁用原料[2-4],因此,化妝品禁用原料的篩查范圍亟待擴(kuò)展,篩查維度也亟需加大。

目前,化妝品中多類別禁用原料的同時(shí)檢測(cè)方法主要有液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[5-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]。液相色譜-高分辨質(zhì)譜法可以獲得精確的質(zhì)量數(shù),為目標(biāo)化合物乃至未知物分析提供全面的數(shù)據(jù)[12],但儀器價(jià)格昂貴,檢驗(yàn)成本高,在方法推廣上有一定難度。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),能快速、準(zhǔn)確地定量化妝品中的禁用原料,在化妝品中性激素類[13-15]、抗感染類[16,17]、抗組胺類[18-19]、鎮(zhèn)痛類[20]等藥物的檢測(cè)方面均有應(yīng)用,是目前化妝品禁用原料檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法建立和日常監(jiān)督檢驗(yàn)的首選方法。

本文基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,通過優(yōu)化前處理和儀器條件,建立了化妝品中87種禁用原料的分析方法。87種禁用原料分別為33種性激素類、20種抗感染類、15種抗組胺類、7種香豆素類、4種鎮(zhèn)靜催眠類、4種解熱鎮(zhèn)痛類、2種致敏類藥物及2種具有收縮血管作用的藥物。本方法適用于3類常見化妝品基質(zhì)(水基類、乳液膏霜類和油基類)的檢測(cè),可為化妝品中禁用原料的快速風(fēng)險(xiǎn)篩查和高效日常監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Acquity UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S質(zhì)譜儀(美國Waters公司); HMV-50A多管漩渦混合器(上海珂淮儀器有限公司); LC-250超聲波清洗器(山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司); ST16臺(tái)式離心機(jī)(德國Thermo Fisher Scientific公司); Milli-Q純水機(jī)(美國Millipore公司)。

甲醇和乙腈(色譜純,德國默克公司);正己烷(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682中規(guī)定的一級(jí)水。87種禁用原料標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院、德國Dr. Ehrenstorfer公司、壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心、上海義淮生物有限公司、廣州佳途科技股份有限公司、上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司、上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司、上海源葉生物科技有限公司、天津阿爾塔科技有限公司和美國Stanford Chemicals公司,純度為95.0%～99.9%(CAS號(hào)見表1)。

表1 87種禁用原料的CAS號(hào)、保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

分別準(zhǔn)確稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.01 mg)置于10 mL容量瓶中,加入乙腈溶解(其中在乙腈中溶解較差的洛美沙星、司帕沙星、氟甲喹、麻保沙星、達(dá)氟沙星和加替沙星可以加入少量甲酸促進(jìn)溶解),定容至刻度并搖勻,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于-20 ℃下冷凍保存。

1.2.2單標(biāo)溶液

使用時(shí)準(zhǔn)確移取20 μL各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,分別置于不同的10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容并搖勻,配制成質(zhì)量濃度為2 mg/L的各單標(biāo)中間溶液。再準(zhǔn)確移取1 mL各單標(biāo)中間溶液分別置于不同的10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容并搖勻,配制成質(zhì)量濃度為200 μg/L的各單標(biāo)溶液。

1.2.3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液

使用時(shí)準(zhǔn)確移取0.1 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容并搖勻,配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液;再準(zhǔn)確移取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容并搖勻,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用前,用空白基質(zhì)提取液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成所需質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

水基類和乳液膏霜類:稱取0.2 g樣品(精確至0.000 1 g)置于10 mL具塞比色管中,加入2 mL乙腈渦旋分散均勻后,再加入50%乙腈水溶液至近刻度,超聲提取20 min,靜置至室溫;之后用50%乙腈水溶液定容至刻度,搖勻,以8 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜,濾液作為供試品溶液備用。

油基類:稱取0.2 g樣品(精確至0.000 1 g)置于15 mL具塞離心管中,加入2 mL正己烷渦旋分散均勻后,再加入3 mL 70%乙腈水溶液渦旋2 min,以8 000 r/min離心5 min;用膠頭滴管移取下層溶液至10 mL具塞比色管中,再在上層正己烷層加入3 mL 70%乙腈水溶液渦旋2 min,以8 000 r/min離心5 min,用膠頭滴管移取下層溶液至同一10 mL具塞比色管中,加入50%乙腈水溶液定容至刻度,搖勻,過0.22 μm有機(jī)濾膜,濾液作為供試品溶液備用。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:CORTECS C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm);流動(dòng)相:A為乙腈,B為0.1%甲酸水溶液;柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣體積:2 μL。梯度洗脫程序:0～2 min, 5%A; 2～4 min, 5%A～20%A; 4～13 min, 20%A～35%A; 13～16 min, 35%A; 16～18 min, 35%A～45%A; 18～26 min, 45%A～90%A; 26～31 min, 90%A; 31～31.1 min, 90%A～5%A; 31.1～33 min, 5%A。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源,正、負(fù)離子掃描;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;毛細(xì)管電壓:3.2 kV(正離子)和3.0 kV(負(fù)離子);脫溶劑氣流速:900 L/h;脫溶劑氣溫度:450 ℃;錐孔氣流速:150 L/h。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS條件優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用電噴霧電離,分別將87種禁用原料的單標(biāo)溶液(200 μg/L)注入離子源,在正、負(fù)離子掃描模式下對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描。正離子模式下,目標(biāo)化合物均產(chǎn)生[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰;負(fù)離子模式下,目標(biāo)化合物均產(chǎn)生[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰。確定準(zhǔn)分子離子峰后對(duì)錐孔電壓(CV)進(jìn)行優(yōu)化,再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,選取豐度較高且干擾較小的2個(gè)子離子分別作為定性、定量離子,其中響應(yīng)較高的離子作為定量離子。再分別優(yōu)化2個(gè)子離子的碰撞能量(CE),經(jīng)優(yōu)化后得到的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5,6,8-11]及國家標(biāo)準(zhǔn)[1],同時(shí)分離激素類、抗感染類、抗組胺類和解熱鎮(zhèn)痛類藥物等多個(gè)類別禁用原料的流動(dòng)相體系中,水相多采用含有不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸水溶液。本研究考察了0.1%甲酸水溶液和甲醇、0.1%甲酸水溶液和乙腈、0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈3種流動(dòng)相體系對(duì)待測(cè)物峰形及響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示,在流動(dòng)相體系為0.1%甲酸水溶液和乙腈的條件下,87種目標(biāo)物的響應(yīng)最好,且87種禁用原料中母離子和子離子質(zhì)荷比相同或相近的組分均可得到分離,87種禁用原料的總離子流色譜圖見圖1。

圖 1 87種禁用原料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of mixed standard solution of the 87 prohibited ingredients

圖 2 乳液膏霜類基質(zhì)中87種禁用原料在不同提取溶劑下的加標(biāo)回收率(n=6)Fig. 2 Spiked recoveries of the 87 prohibited ingredients with different extraction solvents in cream matrix (n=6)Compound Nos. 1-87 were the same as those in Table 1.

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1水基類、乳液膏霜類樣品

提取溶劑的選擇 本研究所涉及的87種禁用原料中,大部分禁用原料在乙腈中有較好的溶解性。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[13-15,17,20-25],本研究以乳液膏霜類樣品為典型基質(zhì),先加入適量1 mg/L的87種禁用原料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(加標(biāo)水平均為2倍定量限(LOQ)),之后分別考察了用乙腈、50%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液提取及先用乙腈提取再加水定容的4種提取方式對(duì)目標(biāo)物提取效率的影響。結(jié)果顯示,使用乙腈和70%乙腈水溶液提取時(shí),由于溶劑效應(yīng),部分出峰時(shí)間較早的化合物色譜峰變寬,峰形對(duì)稱性差。比較了用50%乙腈水溶液提取和先用乙腈提取再加水定容兩種提取方式下目標(biāo)物的加標(biāo)回收率,結(jié)果如圖2所示。在兩種提取方式下,87種禁用原料的加標(biāo)回收率分別為91.7%～116.2%和81.8%～115.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.7%～8.4%和1.2%～8.2%。使用50%乙腈水溶液進(jìn)行提取時(shí)不僅回收率更高,且操作簡便、快捷,更符合化妝品快速篩查的目的,因此,選擇50%乙腈水溶液作為水基類和乳液膏霜類樣品的提取溶劑。

提取時(shí)間的選擇 以乳液膏霜類樣品為典型基質(zhì),考察了不同超聲提取時(shí)間(10、20、30 min)對(duì)87種禁用原料提取效率的影響。結(jié)果表明,以50%乙腈水溶液為提取溶劑、超聲提取20 min的條件下,絕大多數(shù)化合物可達(dá)最大提取效率。因此,實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取時(shí)間為20 min。

圖 3 油基類基質(zhì)中87種禁用原料在不同提取溶劑下的加標(biāo)回收率(n=6)Fig. 3 Spiked recoveries of the 87 prohibited ingredients with different extraction solvents in oil matrix (n=6)Compound Nos. 1-87 were the same as those in Table 1.

2.2.2油基類樣品

提取溶劑的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)[13,14]報(bào)道,本研究在空白油基類化妝品中先加入適量1 mg/L的87種禁用原料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(加標(biāo)水平均為2倍LOQ),之后分別考察了不同體積分?jǐn)?shù)(50%、70%、80%)的乙腈水溶液作為提取溶劑時(shí)對(duì)87種禁用原料提取效率的影響。結(jié)果如圖3所示,使用50%乙腈水溶液提取時(shí),丙酸睪酮和苯丙酸諾龍的加標(biāo)回收率僅為49.6%和42.4%;使用70%和80%乙腈水溶液提取時(shí),87種禁用原料的加標(biāo)回收率分別為83.6%～114.9%和78.3%～115.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%～9.1%和0.8%～8.0%。由此可見,70%乙腈水溶液的提取效率更高,且在該提取溶劑下出峰時(shí)間較早的化合物的峰形對(duì)稱性更好。因此,選擇70%乙腈水溶液作為油基類樣品的提取溶劑。

提取次數(shù)的選擇 實(shí)驗(yàn)分別考察了渦旋提取1、2、3次對(duì)87種禁用原料提取效率的影響。僅提取1次時(shí),依美斯汀、丙酸諾龍、醋酸氯睪酮、丙酸睪酮和苯丙酸諾龍5個(gè)組分的回收率均小于80%;分別提取2次和3次時(shí),87種禁用原料的加標(biāo)回收率為83.7%～115.8%和82.0%～112.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.9%～8.6%和0.6%～8.0%,由此可見,提取2次時(shí)已經(jīng)能夠滿足87種禁用原料篩查測(cè)定的要求。因此,為節(jié)省檢測(cè)時(shí)間,選擇渦旋提取次數(shù)為2次。

圖 4 水基類、乳液膏霜類和油基類樣品中87種禁用原料的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 4 Matrix effects of the 87 prohibited ingredients in toner, cream and oil matricesCompound Nos. 1-87 were the same as those in Table 1.

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

實(shí)驗(yàn)分別考察了3類化妝品基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME),并采用ME=基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的計(jì)算方法對(duì)目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià);其中,ME>1表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME<1表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng);ME值越接近1,表示基質(zhì)效應(yīng)的影響越小,反之,則表明基質(zhì)效應(yīng)的影響越大[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3類化妝品基質(zhì)經(jīng)溶劑提取后均有部分共萃取基質(zhì)被提取,水基類、乳液膏霜類和油基類基質(zhì)的ME分別為0.58～1.82、0.68～7.15和0.89～1.55(圖4),均存在較明顯的基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此,為了降低基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響,本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

本實(shí)驗(yàn)利用空白基質(zhì)(水基類、乳液膏霜類和油基類基質(zhì))提取液對(duì)87種禁用原料的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋,配制成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。以待測(cè)物的質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標(biāo)、定量離子對(duì)的峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果顯示,3種化妝品基質(zhì)中目標(biāo)化合物在各自的線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。以信噪比≥3計(jì)算檢出限(LOD),以信噪比≥10計(jì)算LOQ, 87種禁用原料的LOD為0.07～0.38 μg/g,LOQ為0.21～1.15 μg/g。3種化妝品基質(zhì)中87種禁用原料的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ見表2。

2.5 回收率和精密度

在水基類、乳液膏霜類和油基類的空白樣品中分別添加低、中、高(1倍LOQ、2倍LOQ、10倍LOQ)3個(gè)水平的87種禁用原料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)所建立的方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定6次,并計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表3所示,水基類、乳液膏霜類和油基類樣品中87種禁用原料的回收率分別為84.8%～115.4%、82.0%～114.9%和81.7%～112.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.4%～9.1%、0.4%～9.1%和0.6%～9.9%。以上結(jié)果表明,所建立的化妝品中87種禁用原料的高通量檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠,可用于實(shí)際樣品的分析。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用所建立的方法對(duì)日常監(jiān)督抽檢中的349批化妝品進(jìn)行分析,在8批樣品中檢出了禁用原料。其中,有2批樣品檢出甲氧芐啶,檢出含量分別為53.6 mg/g和15.0 mg/g;此外,1批樣品檢出特比萘芬,1批樣品檢出萘甲唑啉,3批樣品檢出7-甲氧基香豆素,1批樣品檢出7-甲基香豆素,檢出含量均大于LOD、小于LOQ。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,非法添加《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)標(biāo)準(zhǔn)方法以外的禁用原料的現(xiàn)象已經(jīng)較為普遍。因此,本方法的建立有利于加強(qiáng)化妝品安全監(jiān)管,為化妝品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和高通量篩查提供技術(shù)支撐。

3 結(jié)論

本研究建立了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定化妝品中8類共87種禁用原料的方法。所建立的方法操作簡單、高效,定性、定量準(zhǔn)確,適用于水基類、乳液膏霜類和油基類3類常見化妝品基質(zhì)的測(cè)定。本研究在進(jìn)一步規(guī)范化妝品市場(chǎng)、服務(wù)化妝品安全監(jiān)管等方面具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。