趙沙沙 房振兵 陳波 潘高峰 潘秀才 趙紅 田永宏

摘要? 為了優(yōu)化粳稻花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，提高粳稻雜交組合的花藥培養(yǎng)效率，選用2種碳源麥芽糖、蔗糖設(shè)置不同處理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對10個粳稻F4雜交組合進行花藥培養(yǎng)。結(jié)果表明，粳稻花藥培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加蔗糖花藥培養(yǎng)效果要優(yōu)于麥芽糖。然后用優(yōu)化的誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基對6個粳稻不同世代雜交組合進行花藥培養(yǎng)，其中組合J118表現(xiàn)出較好的愈傷組織誘導(dǎo)率（9.90%）和綠苗分化率（14.48%），花藥培養(yǎng)力最高（1.43%）。因此，J118是花藥培養(yǎng)再生能力強的雜交組合，可作為單倍體育種、基因定位與克隆和遺傳轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)材料，對提高花培育種效率和加速新品種育成具有重要意義。

關(guān)鍵詞? 粳稻；花藥培養(yǎng)；碳源；基因型；花藥培養(yǎng)力

中圖分類號? S511.2+2? 文獻標識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）01-0029-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.01.007

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Effects of Different Carbon Sources and Genotypes on Anther Culture Efficiency of Japonica Rice

ZHAO Sha-sha，F(xiàn)ANG Zhen-bing，CHEN Bo et al

（Xiangyang Academy of Agricultural Sciences，Xiangyang，Hubei 441057）

Abstract? In order to optimize the Japonica rice anther culture system and improve the anther culture efficiency of Japonica rice hybrid combinations，two carbon sources maltose and sucrose were selected in this study to set up induction medium of different treatments for anther culture of 10 Japonica rice F4 hybrid combinations.The results showed that the induction medium with sucrose was more effective than maltose in Japonica rice anther culture.Then six Japonica rice hybrid combinations of different generations were cultured with optimized callus induction medium，in which combination J118 showed better callus induction rate （9.90%） and green seedling differentiation rate （14.48%），and the highest anther culture ability （1.43%）.Therefore，J118 was a hybrid combination with strong regeneration ability in anther culture，which could be used as the basic material suitable for haploid breeding，gene mapping and cloning，genetic transformation research.It was of great significance to improve the efficiency of anther culture breeding and accelerate the breeding of new varieties.

Key words? Japonica rice;Anther culture;Carbon source;Genotype;Anther culture ability

基金項目? ?湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心重大科技研發(fā)項目（2020-620-000-002-01）；湖北省重點研發(fā)計劃項目（2020BBB053）。

作者簡介? 趙沙沙（1987—），女，河南洛陽人，助理研究員，碩士，從事水稻花培育種研究。*通信作者，正高級農(nóng)藝師，從事水稻育種和栽培技術(shù)研究。

收稿日期? 2023-02-10

水稻是我國最主要的糧食作物之一，有60%以上人口以稻米為主食［1］?，F(xiàn)代生物育種技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合，可以快速改良水稻品質(zhì)、產(chǎn)量、抗病、抗逆性和生育期等重要農(nóng)藝性狀，對培育水稻新品種、促進水稻產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有十分重要的意義。通過花藥培養(yǎng)技術(shù)可以快速獲得水稻單倍體，提高育種選擇效率，縮短育種周期［2］，在提供豐富的育種變異材料和開展遺傳轉(zhuǎn)化研究等方面具有巨大的潛力和優(yōu)勢。隨著研究的不斷深入，花藥培養(yǎng)技術(shù)逐步完善，已經(jīng)成為生物技術(shù)育種中較為成熟、實用、有效的育種新技術(shù)［3］。

評價花藥培養(yǎng)效率的2個主要指標是愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率，雖然水稻花培育種有許多優(yōu)勢，但花藥培養(yǎng)效果并不理想，主要原因在于愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率偏低。完善和優(yōu)化水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，提高愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率，適度擴大花培后代群體，對開展水稻花藥培養(yǎng)育種工作起著十分關(guān)鍵的作用［4］。愈傷組織誘導(dǎo)率受碳源的影響很大，在早期研究中，水稻花藥培養(yǎng)一般用蔗糖作為標準碳源，適宜濃度為3%～6%［5］。隨后研究表明，在水稻花藥培養(yǎng)過程中，以麥芽糖代替碳源具有更好的花藥培養(yǎng)效果［6］。

水稻花藥培養(yǎng)效率受材料基因型、花粉發(fā)育狀態(tài)、基本培養(yǎng)基、碳源、激素配比以及培養(yǎng)條件等多種因素的相互影響，其中基因型是最關(guān)鍵因素［7］。沈錦驊等［8］對比分析了不同類型的水稻材料，發(fā)現(xiàn)花藥培養(yǎng)力由高到低依次為糯稻、粳稻、秈粳雜交稻、秈稻，且同一類型的不同水稻材料之間也有明顯差異。相對于秈稻而言，粳稻類型更容易被誘導(dǎo)，愈傷組織誘導(dǎo)率一般都會在10%，最高可達40%，目前花藥培養(yǎng)技術(shù)在粳稻育種工作中已經(jīng)取得了良好應(yīng)用［9］。然而由于花藥培養(yǎng)對基因型有很大的依賴性，不同粳稻材料之間的花藥培養(yǎng)力及其配合力也有很大差異。苗立新等［10-11］研究表明，水稻雜交F1代的愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率一般會介于雙親之間而偏向母本，如果雙親的花培效率高，則雜交F1的也會較高。因此，評價、篩選花藥培養(yǎng)力高且綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻基因型作為花培育種的材料具有現(xiàn)實性和必要性。

鑒于此，筆者對粳稻花藥培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基的碳源進行了篩選和優(yōu)化，同時利用優(yōu)化的花藥培養(yǎng)技術(shù)體系對粳稻不同世代雜交組合花藥培養(yǎng)效果進行了評價，以篩選出高花藥培養(yǎng)力的優(yōu)良粳稻品系，作為單倍體育種、基因定位與分離克隆和遺傳轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)材料，對提高花培育種效率和加速新品種育成具有重要意義。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

供試水稻材料分為2類，一類是部分粳稻F4雜交組合，用于誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化，2020年正季種植于襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院團山基地，10個粳稻組合編號分別為J20、J29、J31、J37、J49、J85、J99、J141、J171、J289；另一類是部分粳稻不同世代F1、F2、F4雜交組合，用于DH系的創(chuàng)制，2021年正季種植于襄陽市農(nóng)科院團山基地，編號分別為F1：93、F2：39、J34、J118、J127、J179，每個編號對應(yīng)的不同雜交組合如表1所示。

1.2? 花藥培養(yǎng)方法

1.2.1? 幼穗取材和低溫預(yù)處理。

當(dāng)植株處于孕穗期時，晴天08：00—10：00在田間選取大多數(shù)花粉發(fā)育處于單核靠邊期（即大孢子發(fā)育晚期）的幼穗，器官形態(tài)指標主要表現(xiàn)為：劍葉與下一葉的葉枕距為5～10? cm，苞大而不破，此時穎殼大多數(shù)呈黃綠色，寬度已接近成熟大小，花絲長度為穎殼的1/3～1/2。將帶苞葉幼穗用75％的酒精棉擦拭消毒后，再用干凈的濕潤紗布包好，放入保鮮袋中密封保存，8 ℃低溫條件下處理7～11 d。

1.2.2? 花藥接種。

用75％乙醇對預(yù)處理后的稻穗消毒，然后在超凈工作臺上剝除苞葉，選取合適的帶枝小穗放在50 mL離心管中，加入75％乙醇浸泡30～60 s后倒掉，用無菌水沖洗1次，再加入新配制的3%次氯酸鈉溶液完全浸沒小穗，放在渦旋振蕩

儀上振蕩25 min充分消毒，倒掉次氯酸鈉溶液用無菌水沖洗4～5次，最后用無菌濾紙吸干水分后開始接種。在超凈工作臺上用剪穎抖藥法將花藥接種至不同誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上，每個組培瓶接種100～200個花藥，數(shù)據(jù)分析時按照每瓶150個來統(tǒng)計。然后將組培瓶置于光照培養(yǎng)箱或組培室中，在26～28 ℃的條件下進行暗培養(yǎng)，接種30～60 d內(nèi)統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3? 愈傷組織分化。

將已長出的1.0～2.0 mm、表面光滑、淡黃緊湊的新鮮愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，每個組培瓶放置5個。先暗培養(yǎng)3 d，然后在26～28 ℃、1 500～2 000 lx、12～16 h/d光照條件下分化培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)分化后30～40 d內(nèi)統(tǒng)計綠苗分化率。

1.2.4? 生根培養(yǎng)。

愈傷組織分化成綠苗后，待綠苗長至3～5 cm，將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，每個組培瓶中放置1株花培苗。在26～28 ℃、1 500～2 000 lx、12～16 h/d光照條件下培養(yǎng)，直至綠苗長出1.5～2.5 cm的白根，株高10 cm以上。打開瓶蓋加水至培養(yǎng)基上1～2 cm煉苗，3 d后將根部培養(yǎng)基清洗干凈，移栽至大田，返青后進行常規(guī)田間管理。

1.3? 培養(yǎng)基

1.3.1? 誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化。

用10個粳稻F4雜交組合對誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基進行篩選，用不同碳源麥芽糖、蔗糖設(shè)置不同處理的培養(yǎng)基。碳源均添加50 g/L，其余成分和配比參照向發(fā)云等［12］的研究結(jié)論，以N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加激素配比為KT 1.0 mg/L +2，4-D 2.0 mg/L + NAA 3.0 mg/L，600 mg/L脯氨酸，3.0 g/L植物凝膠，pH調(diào)節(jié)為5.7～5.9。

1.3.2? 分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。

用于DH系創(chuàng)制的6個不同世代雜交組合用篩選出的最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基進行愈傷組織的誘導(dǎo)，分化培養(yǎng)基同樣參照向發(fā)云等［12］的研究結(jié)論，以MS為基本培養(yǎng)基，添加激素配比為KT 2.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L，30 g/L蔗糖，3.0 g/L植物凝膠，pH調(diào)節(jié)為5.7～5.9。生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA 1.0 mg/L，30 g/L蔗糖，3.0/L植物凝膠，pH調(diào)節(jié)為5.7～5.9。

1.4? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析? 采用Microsoft Excel 2019整理數(shù)據(jù)，計算愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率以及綠苗產(chǎn)率，以評價不同試驗材料花藥培養(yǎng)的效果。計算公式如下：

愈傷誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的花藥數(shù)接種總花藥數(shù)× 100%

綠苗分化率=分化出綠苗的愈傷組織數(shù)接種愈傷組織總塊數(shù)×100%

綠苗產(chǎn)率（花藥培養(yǎng)力）=愈傷誘導(dǎo)率×綠苗分化率×100%

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行雙因子方差分析、多重比較分析以及相關(guān)性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同碳源處理對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

選取10個粳稻F4雜交組合的合適幼穗，花藥分別接種到含有蔗糖、麥芽糖2種碳源的誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上，研究不同碳源處理對粳稻材料愈傷組織誘率的影響。由表2可知，在20個處理中，僅有2個處理未誘導(dǎo)出愈傷組織，其他18個處理均誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為0.07%～47.87%，其中J31用含蔗糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的誘導(dǎo)率最高，可以達到47.87%，J29在含麥芽糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，僅為0.07%。用蔗糖處理10個雜交組合的平均誘導(dǎo)率為18.73%，用麥芽糖處理的平均誘導(dǎo)率為8.66%，二者之間存在顯著差異。10個粳稻材料在進行花藥培養(yǎng)的過程中，除了J20、J29、J85用含麥芽糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理花藥培養(yǎng)效果優(yōu)于含蔗糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其余7個材料均是蔗糖處理優(yōu)于麥芽糖。因此對于大多數(shù)粳稻材料而言，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加蔗糖花藥培養(yǎng)效果要好于麥芽糖，理想的誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為N6+蔗糖50 g/L+脯氨酸600 mg/L+KT 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+植物凝膠3.0 g/L，pH調(diào)節(jié)為5.7～5.9。

2.2? 不同基因型對花藥培養(yǎng)效果的影響

用優(yōu)化后的最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基對6個粳稻不同世代F1、F2、F4雜交組合進行花藥培養(yǎng)，研究不同基因型對水稻花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)和綠苗分化的影響。

由圖2可知，不同粳稻材料愈傷組織誘導(dǎo)率為1.07%～15.05%，綠苗分化率為2.48%～33.85%，花藥培養(yǎng)力為0.10%～1.43%，基因型間差異明顯。F1：93的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可以達到15.05%，其次為F2：39、J118、J127、J34，而J179的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，僅為0.13%。將誘導(dǎo)出來的愈傷組織轉(zhuǎn)移到相同的分化培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)，結(jié)果表明，綠苗分化率最高的是J34，可以達到33.85%，最低的是F2：39，只有2.48%。組合J118表現(xiàn)出較好的愈傷組織誘導(dǎo)率（9.90%）和綠苗分化率（14.48%），相應(yīng)地花藥培養(yǎng)力也最高（1.43%），適合用于花藥組織培養(yǎng)，可以作為水稻花藥培養(yǎng)的橋梁材料。部分水稻材料花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)、綠苗分化和白苗情況見圖1。

相關(guān)分析表明，6個不同世代雜交組合中，愈傷組織誘導(dǎo)率較高的組合，綠苗分化率較低，二者之間呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.51。

3? 結(jié)論與討論

篩選高花藥培養(yǎng)力基因型在水稻花培育種中極為重要。一般認為，花藥培養(yǎng)力由強到弱為糯稻>粳稻>秈粳雜交稻>秈稻，相對而言粳稻更容易被誘導(dǎo)出愈傷組織，但是不同粳稻材料之間的花藥培養(yǎng)效果也有很大差異。該研究選用2種碳源麥芽糖、蔗糖設(shè)置不同處理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，試圖篩選出適合粳稻花藥培養(yǎng)的碳源，完善和優(yōu)化水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，提高粳稻花藥培養(yǎng)效率。再對6個粳稻不同世代雜交組合進行花藥培養(yǎng)，篩選、評價高花藥培養(yǎng)力的優(yōu)良粳稻品系，以期為創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)資源和水稻花培育種提供基礎(chǔ)材料。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的碳源影響粳稻的花藥培養(yǎng)效果。該研究發(fā)現(xiàn)在花藥培養(yǎng)過程中，除了組合J20、J29、J85用含麥芽糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理花藥培養(yǎng)效果優(yōu)于含蔗糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其余粳稻材料均是蔗糖處理優(yōu)于麥芽糖，認為大部分粳稻材料在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加蔗糖花藥培養(yǎng)效果要好于麥芽糖。張連平等［13］的研究也得出了同樣的結(jié)論。朱永生等［14］的研究證明混合使用蔗糖和麥芽糖（3%蔗糖+3%麥芽糖）花培效果更佳。使用混合碳源的效果要好于單一碳源，可能是混合碳源滿足了誘導(dǎo)愈傷組織過程中不同發(fā)育階段糖類代謝的不同需求［15］。李三和等［4］則認為秈稻花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷階段添加麥芽糖效果要好于蔗糖，并且誘導(dǎo)出的愈傷組織具有較好的分化效果。

用優(yōu)化后的最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基對6個粳稻不同世代雜交組合進行花藥培養(yǎng)，均可誘導(dǎo)出愈傷組織，并且分化出花培再生植株。其中，組合J118表現(xiàn)出較好的愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率，花藥培養(yǎng)效果最好，是適合作為水稻花藥培養(yǎng)的優(yōu)良品系。在后續(xù)的研究中，應(yīng)在農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻品系中不斷地發(fā)掘花藥培養(yǎng)力高的材料，通過雜交等手段把高培養(yǎng)力基因型導(dǎo)入到優(yōu)良親本或組合中進行花藥培養(yǎng)，從而獲取較大量的花培后代群體。對獲得的花培后代群體進行田間農(nóng)藝性狀考察，結(jié)合分子標記輔助選擇技術(shù)鑒定品質(zhì)和抗性，期望獲得具有一定育種價值的育種新材料。研

究也觀察到，愈傷組織誘導(dǎo)率較高的組合，綠苗分化率較低。因此，評價花藥培養(yǎng)效果時，只注重較高的愈傷組織誘導(dǎo)率是不夠的，還要考慮較好的綠苗分化率，才能更好地篩選出適合花藥培養(yǎng)的優(yōu)良水稻基因型。

目前，花藥培養(yǎng)技術(shù)是創(chuàng)制DH系和豐富育種變異材料的有效手段［16］。但是大部分水稻的花藥培養(yǎng)效率依然很低，遠遠不能滿足育種需求。因此，應(yīng)加強水稻花藥培養(yǎng)中關(guān)鍵技術(shù)和遺傳機理的研究，完善和優(yōu)化水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，提高花藥培養(yǎng)效率，為花藥培養(yǎng)技術(shù)在水稻種質(zhì)資源創(chuàng)制和新品種培育上的廣泛應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。此外，在已有的綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻品系中篩選、評價高花藥培養(yǎng)力的基因型，對于提高水稻花培育種效率具有重要意義。

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