茍 偉,陳 山,何 薇

布氏桿菌病(brucellosis)是一種由布氏桿菌屬細菌引起的疾病,是由動物傳播的最廣泛的人獸共患病之一。人類通常通過直接接觸被感染動物、食用或飲用被污染的動物產(chǎn)品或吸入空氣中病原體而感染[1-2]。大多數(shù)病例由食用來自感染山羊或綿羊的未經(jīng)高溫消毒的羊奶或奶酪引起。寧夏也是主要的高發(fā)區(qū),嚴重威脅著當(dāng)?shù)厝嗣竦慕】礫3]。目前臨床上主要采取三聯(lián)的方式治療布氏桿菌,服藥周期長,副作用明顯,亟特研發(fā)有效的疫苗用于布氏桿菌病的防治。

布氏桿菌質(zhì)蛋白是細胞包膜完整性和毒力的分子決定因素。布氏桿菌周質(zhì)蛋白(Brucellaperiplasmic protein,EipB)的缺失會導(dǎo)致布布氏桿菌細胞膜完整性的受損以及影響布氏桿菌在小鼠脾臟的定植[4],還有研究報道EipB蛋白參與布氏桿菌穩(wěn)態(tài)的維持[5]。但關(guān)于EipB作為疫苗候選分子的研究鮮有報道。本研究擬利用生物信息學(xué)方法分析,預(yù)測EipB蛋白的抗原表位,選出抗原性較高的2條T、B細胞表位通過血藍蛋白進行連接,探討T-B聯(lián)合細胞表位誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫效應(yīng),為研制基于EipB的布氏桿菌病疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠脾臟淋巴細胞分離液購自于天津灝洋生物有限公司;流式抗體購自于美國BD公司(貨號:15978);ELISA二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG)均購自于美國Abcam公司;胎牛血清購自于四季青公司;PBS購自于武漢賽維爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基酸序列的獲取 使用NCBI數(shù)據(jù)庫檢索并獲得EipB蛋白質(zhì)的氨基酸序列,結(jié)果如表1,其登錄號為WP_021585242.1。

1.2.2 EipB蛋白的理化性質(zhì)分析 使用在線網(wǎng)站Expasy網(wǎng)站中的ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)程序,分析EipB蛋白的理化性質(zhì)。

1.2.3 EipB蛋白信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測 使用在線預(yù)測網(wǎng)站SignalP-5.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽序列;使用在線預(yù)測軟件TMHMM-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0)預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.4 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測 使用在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測(https://www.novopro.cn/tools/secondary-structure-prediction.html)EipB蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。使用在線預(yù)測網(wǎng)站SWISS-MODEL分析EipB的三維結(jié)構(gòu)。

1.2.5 蛋白質(zhì)親/疏水性預(yù)測 使用在線預(yù)測軟件ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)網(wǎng)站中的Hopp&woods算法預(yù)測EipB蛋白的親/疏水性。

1.2.6 EipB蛋白抗原表位的預(yù)測 使用ABCpred數(shù)據(jù)庫預(yù)測EipB的B細胞表位;使用IEDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測EipB的CD4+T和CD8+T細胞表位肽。使用Vaxijen在線網(wǎng)站對表位肽的抗原性進行預(yù)測。

1.2.7 T-B優(yōu)勢表位和CpG的合成 委托上海生工進行合成,連接方式為EVRGDAKLEGGKTVVE-KLH-TTTFEGADGKNFRFV,純度為95%,兩條細胞表位肽與KLH之間通過巰基連接。CpG ODN是一種佐劑,其氨基酸通過氫鍵相連接。CpG佐劑與EVRGDAKLEGGKTVVE-KLH-TTTFEGADGKNFRFV之間無需連接,免疫時,將20 μg聯(lián)合表位與20 μg溶解后的CpG混勻后即可使用。

1.2.8 實驗分組及免疫方式 20只6～8周雌性C57小鼠,隨機分成4組:PBS組、KLH+CpG組、CpG佐劑組、T-B+CpG組;PBS組小鼠腹部皮下注射100 μL PBS;KLH+CPG組小鼠腹部皮下注射20 μg KLH蛋白和20 μg CpG佐劑;CPG組小鼠腹部皮下注射20 μg CpG佐劑; T-B+CpG組小鼠腹部皮下注射20 μg T-B聯(lián)合表位和20 μg CpG、所有小鼠均采用腹部皮下多點免疫方式進行免疫,總共免疫3次,隔周免疫1次。

1.2.9 ELISA檢測 10μg/mL T-B聯(lián)合表位肽包被酶標板,置于4 ℃過夜,PBST洗板5次。5%的脫脂牛奶封閉1 h,PBST洗板5次;按照1∶500稀釋血清,每孔100 μL加入酶標板中,在37 ℃烘箱孵育2 h,PBST洗板5次;按照1∶10 000稀釋二抗,每孔100 μL,在37 ℃烘箱孵育1 h,PBST洗板7次,進行DAB顯色,在450 nm處讀取數(shù)值。

1.2.10 流式細胞術(shù)檢測 將1×106個淋巴細胞置于流式管中,使用含10%血清的PBS洗滌2次,加入CD3、CD4、CD8和IFN-γ流式抗體各1 μL,在4 ℃冰箱染色30 min,用含10%血清的PBS洗滌2次,重懸后上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1 EipB蛋白的理化性質(zhì) 該蛋白是由279個氨基酸組成,等電點為6.03,呈弱堿性,分子量為31 067.12,蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為11.8,為穩(wěn)定蛋白,見表1。

2.2 EipB蛋白信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測 經(jīng)過預(yù)測分析,表明該蛋白在26-27氨基酸之間含有1個信號肽序列,結(jié)果如圖1A。在1-30氨基酸之間含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域,如圖1B所示。

A:EpiB蛋白信號肽預(yù)測;B:EpiB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 EipB蛋白空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測

2.3.1 EipB蛋白二、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 EipB蛋白二級結(jié)構(gòu)中含有α-螺旋(Alpha helix)、β-轉(zhuǎn)角(β-turn)、延伸鏈(Extended strand)、無規(guī)則卷曲(Random coil)等結(jié)構(gòu),以α-螺旋為主 (圖2A)。EipB蛋白的三維結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步盤曲折疊形成的三維空間結(jié)構(gòu)(圖2B-D)。

A:EipB蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;B-D:EipB蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)示意圖

2.4 EipB蛋白親/疏水性預(yù)測 經(jīng)過在線軟件預(yù)測EipB蛋白含有較多的疏水結(jié)構(gòu)域,位于40-52,80-93、98-108、111-148、157-167、177-186、192-213、223-232、244-254、256-275。含有多個親水結(jié)構(gòu)域,分布在5-39、53-79、149-156、168-176、187-191、214-221、233-243,這些部位是形成抗原表位的關(guān)鍵區(qū)域。該蛋白在第228位賴氨酸處取得最大值1.822,即該蛋白在此處疏水性最強;在第219個蘇氨酸處取得最小值-1.544,即該蛋白在此處親水性最強,見圖3。

圖3 EipB蛋白親疏水性預(yù)測

2.5 EipB抗原表位的預(yù)測

2.5.1 EipB蛋白B細胞表位的預(yù)測 利用ABCpred在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測了閾值大于0.5且氨基酸長度位16aa的B細胞表位肽,總共有21條,所在氨基酸區(qū)域為54-60、243-259、77-93、121-137、174-190、158-174、64-80、230-246、202-218、148-164、91-107、133-149、13-29、35-51、168-184、98-114、194-210、257-273、23-39、250-266、112-128、185-201、224-240、83-99、263-279、105-121,結(jié)果見表2。

表2 EipB蛋白B細胞表位預(yù)測

2.5.2 CD4+T細胞表位的預(yù)測 使用在線預(yù)測網(wǎng)站SYFPEITHI預(yù)測EipB蛋白HLA-DRB1*0401限制性(15 aa)輔助性T細胞(helper T cell,Th)表位,篩選出預(yù)測分值>15的肽段,其序列見表3。

表3 EipB HLA-DRB1*0401限制性Th表位

2.5.3 CD8+T細胞表位的預(yù)測 利用在線預(yù)測網(wǎng)站SYFPEITHI預(yù)測EipB蛋白的HLA-A0201限制性(9 aa)細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell,CTL)表位,篩選出預(yù)測分值>15的表位肽總共有39條,其序列見表4。

表4 EipB蛋白CD8+T細胞表位的預(yù)測

2.6 T-B聯(lián)合表位誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答水平 ELISA檢測免疫小鼠血清中IgG、IgM、IgA及IgE抗體的變化,結(jié)果表明,PBS組、CpG組和KLH+CpG組免疫小鼠血清中無法檢測到T-B聯(lián)合細胞表位特異性抗體的含量;與PBS組相比,T-B+CpG組小鼠血清中IgG、IgM、IgA及IgE顯著上升(PIgG=0.001,PIgM=0.001,PIgA=0.003,PIgE=0.004),見圖4。

A:IgG抗體的變化;B:IgM抗體的變化;C:IgA抗體的變化;D:IgE抗體的變化。①P<0.05,②P<0.01,③P<0.005,④P<0.001,ns:P>0.05。

2.7 T-B聯(lián)合表位誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答水平 給予各組淋巴細胞10 μg/mL T-B細胞表位肽刺激培養(yǎng)1 d,流式細胞術(shù)檢測細胞因子的產(chǎn)生情況。結(jié)果表明,PBS組、CpG組和KLH+CpG組小鼠淋巴細胞給予T-B表位刺激,無法產(chǎn)生IFN-γ細胞因子;T-B+CpG免疫組小鼠給予T-B聯(lián)合表位刺激后,IFN-γ表達顯著上升(P=0.003),見圖5。

A:CD4+T產(chǎn)生IFN-γ的流式圖;B:IFN-γ表達的變化。①P<0.05,②P<0.01,③P<0.005,④P<0.001,ns:P>0.05。

3 討 論

布氏桿菌病是一種嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病。臨床上主要采用“三聯(lián)”的方式治療,該種治療方式給患者帶來了嚴重的副作用。免疫預(yù)防認為是控制傳染病的有效方法[6]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有保護力的候選分子已有多種[7],但均未進入臨床試驗,因此亟待研發(fā)有效的布氏桿菌疫苗。EipB蛋白是細胞包膜完整性和毒力的分子決定因素。研究表明EipB的缺失會使布氏桿菌胞膜完整性遭到破壞,易于布氏桿菌感染。同時EipB蛋白參與維持布氏桿菌胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),為其提供一個相對穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境[4-5]。

抗原表位是疫苗分子中發(fā)揮主要作用的功能基團,根據(jù)功能的不同分為能被TCR識別的T細胞表位和能夠被BCR識別的B細胞表位[8-9]?？乖肿覤細胞表位一般分布在親水性較高且位于轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域[10-11]。本研究利用ABCpred等軟件預(yù)測了EipB蛋白含有21條B細胞優(yōu)勢表位肽。利用在線預(yù)測網(wǎng)站SYFPEITHI預(yù)測了EipB蛋白的細胞毒性抗原表位(CTL)細胞表位和CD4+T細胞表位,CTL細胞表位主要由人類白細胞抗原I類分子(HLA-I,主要為HLA-A0201)識別[12],總共有39條;CD4+T細胞表位主要是由人類白細胞抗原II類分子(HLA-II,主要為HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0701)所識別,主要有56條。因此,預(yù)測蛋白T細胞表位時常綜合分析HLA-A0201、HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0701限制性表位。但是這些表位肽是否能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答尚不明確。KLH是存在于節(jié)肢動物和軟體動物血淋巴中的含銅蛋白[13],廣泛的作為載體用于表位肽疫苗的研究。本研究選取了2條抗原性最高的抗原表位通過KLH進行連接,與CpG佐劑聯(lián)用免疫小鼠,結(jié)果表明T-B免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的IgG、IgM、IgA以及IgE抗體,并能夠誘導(dǎo)CD4+T細胞分泌IFN-γ細胞因子,這就表明T-B能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液和細胞免疫應(yīng)答,這也為后續(xù)EipB表位肽疫苗的轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

細胞膜是細胞內(nèi)外交換的通道,同時也維持細胞形態(tài)。EipB是布氏桿菌周質(zhì)中發(fā)揮主要作用的蛋白質(zhì),其缺失能夠使細胞膜完整性遭到破壞。但關(guān)于EipB作為疫苗候選分子的研究上鮮有報道。本研究擬利用生物信息學(xué)方法分析,預(yù)測EipB蛋白的抗原表位,選取2條抗原性較高的T、B抗原表位通過KLH進行連接,免疫小鼠后驗證其免疫學(xué)效應(yīng),為研制基于EipB的布氏桿菌疫苗提供依據(jù)。

利益沖突：無