林玉蓮,張維璐,多吉歐珠,賀 真,陸振華,次仁潘多,趙 哲,李 麗,龍 泳

亞東縣位于西藏自治區(qū)南部,與印度和不丹相鄰,南北落差達(dá)5 000多米,自然生態(tài)環(huán)境優(yōu)良,畜牧養(yǎng)殖為當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟產(chǎn)業(yè)。亞東縣年平均氣溫僅1.1 ℃,牲畜是蜱蟲的最佳供暖供血者。蜱蟲可以攜帶并傳播多種病原體,嚴(yán)重影響著牧民和牲畜的健康。蜱蟲的形態(tài)學(xué)鑒定由于蜱蟲種類繁多、結(jié)構(gòu)相似和同種個體遺傳變異性等多種原因,僅在屬的分類上更具有準(zhǔn)確的判斷,而細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COX I)、線粒體16S rDNA和12S rDNA基因已經(jīng)能在種水平上對蜱類進行鑒定[1-2]。萊姆病、Q熱、斑點熱、土拉是西藏自治區(qū)人群感染媒介疾病調(diào)查的重點,在畜牧養(yǎng)殖發(fā)達(dá)的個別地區(qū)人和牲畜處于高感染率情況[3]。本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)鑒定2021年亞東縣采集蜱蟲的種類,篩查蜱蟲可能攜帶的病原體,研究它們的分子發(fā)育系統(tǒng),并進一步通過血清學(xué)研究亞東縣居住人群萊姆病、Q熱、斑點熱、土拉的感染情況,為當(dāng)?shù)刂贫缑郊膊》揽卮胧┨峁┮罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 核酸提取 取經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定分類后的蜱蟲,3～5只分組,每組先經(jīng)生理鹽水沖洗3次,再用上海凈信公司生產(chǎn)的組織破碎儀(Tissnelyser-48L)進行研磨;采用天隆科技有限公司提供的核酸提取試劑盒,磁珠法提取研磨液中的蜱蟲核酸。

1.2 PCR擴增與測序 應(yīng)用oligo7對文獻中查找的蜱蟲鑒定引物和斑點熱群立克次體、伯氏疏螺旋體、土拉熱弗朗西氏菌、貝氏柯克斯體擴增引物進行綜合評價,選擇蜱蟲細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COX I)、線粒體16S rDNA、12S rDNA基因的3對引物由北京擎科生物科技有限公司合成,其余引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。以提取的全蜱基因組DNA為模板,Thermo Fisher Scientific公司提供DreamTaq PCR Master Mix (2X)和Water,nuclease-free,PCR擴增目的基因。COX I、16S rDNA、12S rDNA擴增條件分別為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,45 ℃/50 ℃/50 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。斑點熱群立克次體、伯氏疏螺旋體、土拉熱弗朗西氏菌、貝氏柯克斯體擴增條件分別為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,第1輪50 ℃,第2輪52 ℃/第1輪50 ℃,第2輪52 ℃/第1輪60 ℃,第2輪60 ℃/55℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃10 min。瓊脂糖凝膠電泳陽性樣本的PCR產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司測序,表1。

1.3 基因序列的同源性及遺傳進化分析 利用DNA Star軟件對測得序列進行拼接和矯正,與GenBank中查詢的相似序列進行同源性分析,利用MEGA 7.0軟件基于ClustalW程序?qū)Λ@得的基因序列與GenBank中前一百條相似的不同種類序列和常見種類代表序列進行比對,采用MEGA 7.0默認(rèn)參數(shù),進行鄰近法(Neighbor-joining method,NJ),Bootstrap values設(shè)置為1 000,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 人血清萊姆病、Q熱、斑點熱、土拉抗體ELISA檢測 采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),具體實驗依據(jù)試劑盒說明書,對2021年亞東縣居住人群的184份血清分別進行萊姆病、Q熱、斑點熱、土拉lgG抗體篩查。ELISA試劑盒購自上海科順生物科技有限公司和上?？撇┤鹕锟萍加邢薰?。讀取全自動酶標(biāo)儀(科華ST-360)450 nm波長下吸光度(OD值),判斷標(biāo)本中是否存在病原體抗體。應(yīng)用EXCEL、SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蜱蟲COX I、16S rDNA、12S rDNA基因序列的同源性與遺傳進化分析 西藏亞東縣采集的硬蜱分屬兩類,其中一類硬蜱COX I、16S rDNA、12S rDNA基因序列與GenBank中擬蓖硬蜱Ixodesnuttallianus核苷酸相似性分別為99.5%、97.57%、99.12%;另一類硬蜱COX I、16S rDNA基因序列與GenBank中卵形硬蜱Ixodesovatus核苷酸相似性分別為88.29%、95.75%,其中16S rDNA基因序列與GenBank中Ixodessp.KH-2019(登錄號為LC498630.1)核苷酸相似性達(dá)99.26%,該序列來源自不丹國家。血蜱COX I、16S rDNA、12S rDNA基因序列與GenBank已知西藏血蜱Haemaphysalistibetensis核苷酸相似性分別為96.04%、96.17%、97.47%,與尼泊爾血蜱Haemaphysalisnepalensis核苷酸相似性分別為95.92%、97.13%、96.66%。

蜱蟲COX I 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分為血蜱和硬蜱兩大進化主支,血蜱和硬蜱各自成簇,本研究測得的COX I序列(樣本標(biāo)號YD2021-T1)與源自西藏自治區(qū)日喀則市的擬蓖硬蜱Ixodesnuttallianus(登錄號為NC_062062.1)序列遺傳距離較近,同源性較高;COX I序列(樣本標(biāo)號YD2021-T2)與卵形硬蜱Ixodesovatus(登錄號為OM317739.1、OP244858.1)聚類為一支。尼泊爾血蜱Haemaphysalisnepalensis(登錄號為NC_064124.1)與西藏血蜱Haemaphysalistibetensis(登錄號為OM049539.1、OM368296.1)先聚類為一支,再與本研究測得COX I序列(樣本標(biāo)號YD2021-T3)聚類為一支,圖1。

注:“△”表示本研究從2021年西藏亞東縣收集的23只蜱蟲中擴增得到的COX I 基因。

蜱蟲16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹的兩大進化主支均包含了血蜱和硬蜱,但是在分支上各自的聚類成簇,說明血蜱屬和硬蜱屬在分子水平上具有一定的生物多樣性。研究測得16S rDNA序列(樣本標(biāo)號YD2021-T2)與源自不丹的Ixodes sp.KH-2019(登錄號為LC498630.1)序列進化距離較近,同源性較高,圖2。

蜱蟲12S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分為三大進化主支,本研究測得的2個12S rDNA序列(樣本標(biāo)號YD2021-T1、YD2021-T3)先聚類為一支,再與血蜱和硬蜱聚類成發(fā)育樹主干,研究測得的序列與下載的相似序列遺傳距離較遠(yuǎn),圖3。

注:“△”表示本研究從2021年西藏亞東縣收集的23只蜱蟲中擴增得到的12S rDNA 基因。

2.2 4種蜱媒病原體擴增情況及斑點熱群立克次體gltA基因序列的同源性和遺傳進化分析 2021年西藏亞東縣收集的23只蜱蟲,伯氏疏螺旋體、土拉熱弗朗西氏菌、貝氏柯克斯體序列PCR擴增后,電泳條帶均呈陰性結(jié)果;斑點熱群立克次體gltA基因擴增后,電泳陽性條帶與gltA基因目的片段長度大致相同在381 bp位置。經(jīng)測序獲得的序列與GenBank已知CandidatusRickettsiatarasevichiae核苷酸相似性96.77%,與Rickettsiaraoultii核苷酸相似性96.76%,與Rickettsiacanadensis核苷酸相似性95.35%,與Rickettsiaendosymbiont of Eucoryphus brunneri核苷酸相似性95.35%。系統(tǒng)發(fā)育樹可分為4個進化主支,其中CandidatusRickettsiatarasevichiae(登錄號為KP207593.1)與Rickettsiaraoultii(登錄號為KM279355.1)先聚類為一支后,再與研究測得序列(YD2021)聚類為一支,然后再與Rickettsiacanadensis(登錄號為AB297809.1)、Rickettsiaendosymbiont of Eucoryphus brunneri(登錄號為JQ925624.1)聚類,遺傳距離較近,說明它們都有較高的同源性,圖4。

注:“△”表示本研究從2021年西藏亞東縣收集的23只蜱蟲中擴增得到的斑點熱群立克次體gltA基因。

2.3 亞東縣居住人群184份血清萊姆病、Q熱、斑點熱、土拉的感染情況 亞東縣居住人群184份血清萊姆病、Q熱、斑點熱、土拉抗體陽性率分別為6.52%、12.50%、8.70%、10.87%。萊姆病抗體男性陽性率4.04%,女性陽性率9.41%,陽性男女性別比為0.50∶1,女性陽性率大于男性,男性和女性陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.164,P>0.05);萊姆病抗體藏族陽性率4.50%,漢族陽性率8.96%,陽性藏族和漢族比為0.83∶1,漢族陽性率大于藏族,藏族和漢族陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.763,P>0.05),表2。

表2 2021年亞東縣人血清四種蜱媒疾病抗體檢測情況

Q熱抗體男性陽性率8.08%,女性陽性率17.65%,陽性男女性別比為0.53∶1,女性陽性率大于男性,男性和女性陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.827,P>0.05);Q熱抗體藏族陽性率12.61%,漢族陽性率11.94%,陽性藏族和漢族比為1.75∶1,藏族陽性率大于漢族,藏族和漢族陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.017,P>0.05),表2。

斑點熱抗體男性陽性率13.13%,女性陽性率3.53%,陽性男女性別比為4.33∶1,男性陽性率大于女性,男性和女性陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.311,P<0.05);斑點熱抗體藏族陽性率6.31%,漢族陽性率13.43%,陽性藏族和漢族比為0.78∶1,漢族陽性率大于藏族,藏族和漢族陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.594,P>0.05),表2。

土拉抗體男性陽性率16.16%,女性陽性率4.71%,陽性男女性別比為4.00∶1,男性陽性率大于女性,男性和女性陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.195,P<0.05);土拉抗體藏族陽性率7.21%,漢族陽性率17.91%,陽性藏族和漢族比為0.67∶1,漢族陽性率大于藏族,藏族和漢族陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.799,P<0.05),表2。

將亞東縣居住人群共分為7個年齡組,統(tǒng)計各年齡組感染陽性率,4種蜱媒疾病抗體高陽性率分布在20～60歲年齡段,為主要感染人群,1～10歲年齡段的人群感染陽性率較高,而11～20歲和≥61歲年齡段的人群感染陽性率較低,4種蜱媒疾病檢測人群的各年齡段感染陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見表2。

3 討 論

2021年西藏亞東縣采集的23只蜱蟲在形態(tài)學(xué)初步鑒定下,大致分為硬蜱屬和血蜱屬兩類。本研究基于蜱標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼系統(tǒng),細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COX I)、線粒體16S rDNA和12S rDNA基因,利用DNA標(biāo)記技術(shù)進行了種的分類鑒定?？紤]到單個DNA條形碼在蜱種鑒定上可能存在的問題,比如我們在大量的蜱類鑒定實驗過程中發(fā)現(xiàn),從蜱標(biāo)本中提取12S rDNA基因的效率不高,COX I、16S rDNA、12S rDNA基因都可能針對某些類群蜱種鑒定不具優(yōu)勢[1]。本研究選取了3個DNA條形碼引物對同一樣本進行擴增,COX I基因從蜱標(biāo)本中提取效率最高,引物質(zhì)量最好,表現(xiàn)在電泳目標(biāo)條帶寬大明亮而無雜帶,而12S rDNA基因常常因為提取困難而擴增失敗,所以需要綜合分析讓蜱蟲分類結(jié)果更準(zhǔn)確。

經(jīng)過綜合分析,2021年亞東縣收集的蜱蟲可分為3類,擬蓖硬蜱Ixodesnuttallianus、卵形硬蜱Ixodesovatus和西藏血蜱Haemaphysalistibetensis,血蜱不排除為尼泊爾血蜱Haemaphysalisnepalensis的可能,因為西藏血蜱和尼泊爾血蜱具有較高的同源性。另外,本研究測得的亞東縣蜱蟲16S rDNA序列(樣本標(biāo)號YD2021-T2)與源自不丹的Ixodessp.KH-2019(登錄號為LC498630.1)序列核苷酸相似性達(dá)99.26%,遺傳距離也很接近,可認(rèn)為它們具有高度同源性。不丹與亞東縣相鄰,蜱類可隨著氣候環(huán)境的融合和動物的遷徙而實現(xiàn)基因交流。查閱既往研究發(fā)現(xiàn),擬蓖硬蜱、卵形硬蜱和西藏血蜱在亞東縣均有活躍[9],亞東縣暫未見尼泊爾血蜱的報道,且西藏血蜱在西藏廣泛存在[10]。

本研究基于斑點熱群立克次體gltA基因擴增出的序列,與CandidatusRickettsiatarasevichiae、Rickettsiaraoultii、Rickettsiacanadensis和RickettsiaendosymbiontofEucoryphusbrunneri的核苷酸相似性在96.77%、96.76%、95.35%、95.35%,在遺傳距離上也較接近,同源性較高,很難判斷擴增所得序列的具體種類。Rickettsiaendosymbiont ofEucoryphusbrunneri是一種立克次體屬細(xì)菌共生體,細(xì)菌共生體雖然在公共衛(wèi)生意義上尚不清楚,但是在蜱類中非常普遍,許多可歸屬于人類病原體類,包括斑點熱群[11]。本研究PCR試驗基于gltA基因可能過于保守,無法區(qū)分近源種,可結(jié)合基因組測序數(shù)據(jù)進行分析。

為進一步了解亞東縣四種媒介病原體的流行情況,本研究對亞東縣居住人群184份血清進行了萊姆病、Q熱、斑點熱、土拉抗體篩查,結(jié)果顯示感染率分別為6.52%、12.50%、8.70%、10.87%。張啟恩[12]1995年發(fā)表的結(jié)果顯示,萊姆病陽性率為5.19%(30/578),Q熱陽性率為10.94%(7/64);張雪蓮等[9]2009年調(diào)查結(jié)果,萊姆病陽性率為4.00%(4/100),Q熱陽性率為12.00%(12/100)。研究結(jié)果對比,亞東縣萊姆病和Q熱人群感染陽性率均有上升。由于3項調(diào)查在時間上相隔較長,很多原因都可能導(dǎo)致人群感染陽性率的改變,比如全球氣候變暖、人口流動、土地利用變化、城市化和國際貿(mào)易等驅(qū)動因素都可能促進蜱媒疾病的傳播流行[13]。

亞東縣人群檢測的4種蜱媒疾病中,斑點熱和土拉抗體陽性率在性別上,男性均大于女性,土拉抗體陽性率在民族上,漢族大于藏族差異有統(tǒng)計學(xué)意義。有研究表明,人群對4種疾病普遍易感,無種族、年齡和性別上的差異,但是感染率的高低與接觸感染源、接觸途徑和時間長短有關(guān)[14-15]。本次研究在性別上陽性率差異的原因,可能是亞東縣居住人群中男性的林、牧作業(yè)量要大于女性,男性的蜱暴露幾率大于女性且保護意識較低,機會感染率更高。亞東縣20～60歲年齡段人群為萊姆病、Q熱、斑點熱、土拉的主要感染人群,同時是畜牧養(yǎng)殖的主要作業(yè)人群,受教育程度相對較低,保護意識薄弱,蜱暴露高風(fēng)險人群,有必要做好個人防護;1～10歲年齡段的人群感染陽性率較高,提示要關(guān)注低年齡段感染媒介疾病的風(fēng)險,建立好免疫屏障[16]。

利益沖突：無