謝 淵,遲瑛琳,陶曉燕,于鵬程,劉 茜,劉淑清,朱武洋

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)引起的一種以恐水恐風(fēng)、咽肌痙攣、進行性癱瘓等為特征的高致死性的人獸共患病[1]。目前狂犬病已在150多個國家被發(fā)現(xiàn),每年報道人狂犬病死亡數(shù)居高不下,嚴(yán)重危害人類健康。RABV可在哺乳動物間循環(huán)傳播且可感染人類,一旦出現(xiàn)臨床癥狀將導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的死亡[2-4]。截至目前,仍然缺乏有效的狂犬病治療方案和抗病毒藥物,傳統(tǒng)的密爾沃基療法和被動免疫療法等也存在爭議[5]。因此,有效的狂犬病治療方案和抗狂犬病藥物篩選成為狂犬病防治工作的重心。

加利地韋(Galidesivir,BCX4430)是一種腺苷類似物,可以直接破壞病毒RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)進而表現(xiàn)出抗病毒活性。作為一種直接作用的抗病毒活性分子,BCX4430主要用于治療高致病性病毒引起的感染[6]。研究表明,BCX4430在埃博拉病毒(Ebla virus,EBOV)感染過程中呈現(xiàn)出較好的抗病毒活性[7],對新型冠狀病毒感染具有一定的抗病毒效果,在抗新型冠狀病毒治療中具有較高的潛力[8]。本實驗主要研究BCX4430對不同狂犬病病毒感染的體外抑制作用,從而為狂犬病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細胞和病毒 實驗所需的倉鼠腎細胞BHK-21和小鼠神經(jīng)瘤母細胞N2a均由本實驗室保存; 實驗所用的毒株CVS-11是經(jīng)典的RABV毒株,是CVS毒株經(jīng)由細胞馴化培養(yǎng)后的固定毒株,由本實驗室保存;實驗所用的RABV街毒株SC16是在四川病死犬腦內(nèi)分離而后經(jīng)由鼠腦傳代和細胞適應(yīng)后的毒株,由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 BCX4430批號為HY-104077,購自MCE公司,-80 ℃保存?zhèn)溆谩MEM 細胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、雙抗和胰酶均購自GIBCO公司,4 ℃保存?zhèn)溆?RABV的N蛋白熒光抗體購自日本Fujirebio公司,-20 ℃保存?zhèn)溆?GoTaq probe-1-StepRT-qPCR試劑盒購自promega公司,-20 ℃保存?zhèn)溆?細胞增殖檢測試劑盒(Counting Kit,CCK8)購自東仁化學(xué)科技有限公司,-20 ℃保存?zhèn)溆?。實驗所用的儀器為日本奧林巴斯CXX4I型倒置光學(xué)顯微鏡、日本奧林巴斯IX51 型熒光顯微鏡、ABI QuantStudio 5熒光定量PCR儀、FLUOstar Omega 415-2683酶標(biāo)儀和細胞計數(shù)儀。

1.2 方 法

1.2.1 藥物對細胞活力的毒性測定 N2a及BHK-21細胞貼壁后,分別加入終濃度為0 μmol/L(DMSO對照組)、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L的BCX4430處理24 h、48 h和72 h,設(shè)置3次重復(fù)實驗組,處理結(jié)束后加入10%總體積的CCK-8試劑,在培養(yǎng)箱中孵育1 h,用酶標(biāo)儀測定其在450 nm波長處的OD值,應(yīng)用計算公式得出各實驗組的細胞存活率,進而分析不同濃度藥物及處理時間對細胞活力的影響。計算公式為:[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100%。

1.2.2 病毒滴度測定 準(zhǔn)備檢測板和稀釋板,在稀釋板的兩行中加入200 μL DMEM,然后分別在第一孔加入50 μL病毒原液,而后進行5倍梯度稀釋,每次混勻7～10次,混勻后從稀釋板各轉(zhuǎn)100 μL至檢測板相應(yīng)孔內(nèi),將N2a細胞和BHK-21細胞消化后每孔加入100 μL 細胞懸液,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,然后棄細胞上清液,用80%冷丙酮固定感染細胞,最后采用直接免疫熒光法并通過熒光顯微鏡觀察記錄熒光灶,根據(jù)Reed-Muench方法計算病毒滴度[9-10]。

1.2.3 實時熒光定量PCR對RABV 滴度的測定 CVS-11和SC16感染N2a細胞和BHK-21細胞后,加入不同濃度BCX4430處理72 h,收集細胞樣本并提取RNA,測定RNA 濃度,而后參照GoTaq探針一步法試劑盒說明書,加入特異性探針和引物等反應(yīng)體系,按照相應(yīng)的反應(yīng)條件利用實時熒光定量PCR法檢測各試驗組中RABV的mRNA 水平。

1.2.4 BCX4430對狂犬病病毒復(fù)制的抑制作用 將N2a細胞和BHK-21細胞按照一定比例接種于12孔細胞培養(yǎng)板,待細胞貼壁后加入CVS-11和SC16,感染1 h后分別加入終濃度為0 μmol/L(DMSO對照組)、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L 的BCX4430處理細胞24 h、48 h和72 h,采用直接免疫熒光法進行熒光灶讀數(shù),對病毒滴度進行測定,每組設(shè)立3次重復(fù)實驗。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS 17.0和GraphPad Prism 9.0軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行分析,組間比較采用多樣本方差分析,組間兩兩比較采用SNK法,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BCX4430對N2a及BHK-21細胞的毒性作用 CCK-8細胞毒性實驗結(jié)果(圖1)表明,濃度為500 μmol/L以內(nèi)的BCX4430處理N2a及BHK-21細胞24 h、48 h、72 h,細胞均未見明顯的細胞毒性作用,故本實驗選擇的安全作用濃度為500 μmol/L以內(nèi)。

圖1 不同濃度BCX4430對BHK-21細胞和N2a細胞存活率的影響

2.2 病毒的滴度測定 根據(jù)計算公式可得,在BHK-21細胞系感染中CVS-11滴度為105.21FFU/mL,SC16的滴度為105.06FFU/mL;在N2a細胞系感染中CVS-11滴度為105.86FFU/mL,SC16的滴度為105.43FFU/mL,本實驗確立CVS-11及SC16感染兩種細胞系的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為1。

2.3 BCX4430在RABV感染不同階段抑制病毒復(fù)制 為了確定BCX4430對RABV感染不同階段對病毒的抑制效果,用CVS-11病毒感染N2a細胞,預(yù)加藥4 h、2 h、1 h、0 h分別加入250 μmol/L的BCX4430(圖2A),結(jié)果表明與對照組相比,預(yù)加藥4 h、2 h、1 h加入BCX4430對病毒的抑制效果不明顯,抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F4-0 h=0.952,F2-0 h=0.521,F1-0 h=0.325,均P>0.05),而在病毒感染后加入BCX4430可以明顯抑制病毒的復(fù)制(F0-24 h=267.47,P<0.01)(圖2B),病毒感染各階段的mRNA的相對表達水平檢測結(jié)果也表現(xiàn)出類似的趨勢(F4-0 h=6.725,F2-0 h=3.46,F1-0 h=4.32,均P>0.05;F0-24 h=283.59,P<0.01)(圖2C)。

A:CVS-11感染N2a細胞不同階段加入BCX4430示意圖;B:各處理階段病毒滴度;C:各處理階段mRNA相對表達水平(* P<0.05,** P<0.01)。

2.4 BCX4430體外抑制狂犬病病毒的復(fù)制 CVS-11和SC16毒株感染BHK-21細胞,加入不同濃度(50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L)BCX4430處理24 h、48 h和72 h后,結(jié)果顯示與對照組相比,不同濃度的BCX4430均可有效抑制狂犬病病毒在BHK-21細胞上的復(fù)制,250 μmol/L和500 μmol/L的抑制效果最明顯且抑制率達90%以上(F250 μmol/L=253.61,F500 μmol/L=271.09,均P<0.01)(圖3)。CVS-11和SC16毒株感染N2a細胞后,BCX4430對病毒的抑制效果和BHK-21細胞趨于一致,250 μmol/L和500 μmol/L的抑制效果最明顯且抑制率均達到90%以上(F250 μmol/L=261.63,F500 μmol/L=273.21,均P<0.01)(圖4)。結(jié)果表明BCX4430可以有效抑制RABV的復(fù)制水平且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,250 μmol/L和500 μmol/L的BCX4430抑制效果最明顯,且在病毒感染48 h后抑制效果最佳(F250 μmol/L=234.85,F500 μmol/L=254.68,均P<0.01),病毒感染72 h,BCX4430仍可以有效抑制RABV的復(fù)制(F250 μmol/L=247.17,F500 μmol/L=282.89,均P<0.01)。250 μmol/L和500 μmol/L BCX4430均無明顯的細胞毒性,因此后期實驗確定BCX4430最適濃度為250 μmol/L,最適處理時間為48 h。

A:CVS-11感染BHK-21細胞不同濃度BCX4430處理24 h病毒滴度;B:CVS-11感染BHK-21細胞不同濃度BCX4430處理48 h病毒滴度;C:CVS-11感染BHK-21細胞不同濃度BCX4430處理72 h病毒滴度;D:SC16感染BHK-21細胞不同濃度BCX4430處理24 h病毒滴度;E:SC16感染BHK-21細胞不同濃度BCX4430處理48 h病毒滴度;F:SC16感染BHK-21細胞不同濃度BCX4430處理72 h病毒滴度。(* P<0.05,** P<0.01)

A:CVS-11感染N2a細胞不同濃度BCX4430處理24 h病毒滴度;B:CVS-11感染N2a細胞不同濃度BCX4430處理48 h病毒滴度;C:CVS-11感染N2a細胞不同濃度BCX4430處理72 h病毒滴度;D:SC16感染N2a細胞不同濃度BCX4430處理24 h病毒滴度;E:SC16感染N2a細胞不同濃度BCX4430處理48 h病毒滴度;F:SC16感染N2a細胞不同濃度BCX4430處理72 h病毒滴度。(* P<0.05,** P<0.01)

2.5 BCX4430抑制狂犬病病毒mRNA的表達 以MOI=1的CVS-11和SC16分別吸附BHK-21細胞和N2a細胞,分別加入終濃度為250 μmol/L的BCX4430、50 μmol/L的利巴韋林和1 000 μmol/L的T-705處理細胞48 h后,結(jié)果表明BCX4430對CVS-11的抑制率和利巴韋林相當(dāng),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(FN2a=0.53,FBHK-21=0.62,均P>0.05),優(yōu)于T-705(FN2a=287.06,FBHK-21=262.83,均P<0.01),BCX4430對SC16的抑制效果與CVS-11趨于一致(圖5、圖6)。同時,對各處理組狂犬病病毒mRNA的相對表達水平進行檢測,結(jié)果表明BCX4430可以有效降低狂犬病病毒mRNA的表達,與利巴韋林的抑制效果類似,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(FN2a=0.39,FBHK-21=0.44,均P>0.05),均優(yōu)于T-705(FN2a=263.72,FBHK-21=252.38,均P<0.01)(圖5和圖6),與前期實驗結(jié)果一致[12]。

A:CVS-11感染BHK-21細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 結(jié)果;B:SC16感染BHK-21細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 結(jié)果;C:CVS-11感染BHK-21細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 病毒滴度;D:SC16感染BHK-21細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h病毒滴度;E:CVS-11感染BHK-21細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 病毒mRNA相對表達水平;F:SC16感染BHK-21細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 病毒mRNA相對表達水平。(* P<0.05,** P<0.01)

A:CVS-11感染N2a細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 結(jié)果;B:SC16感染N2a細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 結(jié)果;C:CVS-11感染N2a細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 病毒滴度;D:SC16感染N2a細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 病毒滴度;E:CVS-11感染N2a細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 病毒mRNA相對表達水平;F:SC16感染N2a細胞BCX4430、T-705和利巴韋林處理48 h 病毒mRNA相對表達水平。(* P<0.05,** P<0.01)

3 討 論

狂犬病在全球仍然廣泛存在,作為可防不可治的動物源性傳染病,其致死率高達100%,嚴(yán)重威脅人類健康,給全球經(jīng)濟造成負(fù)擔(dān)。截至目前,仍然缺乏特異性藥物和有效方案治療狂犬病,但抗病毒藥物篩選已經(jīng)成為狂犬病防治工作的重要組成部分。研究報道,利巴韋林、T-705、干擾素 α、異丙肌苷(Isoprinosine,IPS)金剛烷胺、五沒食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose,PGG)和雷帕霉素酶(TMR-001)等藥物表現(xiàn)出良好的體外抗狂犬病病毒作用[4,13-15],但在使用條件和使用方案等方面均存在一定的局限性。此外也有研究表明,瑞德西韋在一定程度上可以阻斷RABV吸附從而抑制病毒的復(fù)制[16],霉菌毒素T-2對RABV吸附具有一定的干擾作用進而降低病毒的復(fù)制水平[17],脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)對RABV的吸附和進入均具有抑制作用,對RABV的抑制效果存在一定的劑量依賴性[18]。

BCX4430是一種新型的腺苷類似物,被設(shè)計用于抑制靶向病毒RdRp活性。研究報道,在各種實驗性感染的情況下,肌肉注射、腹膜注射或口服給藥后BCX4430均表現(xiàn)出良好的耐受性。同時,在療效研究過程中,BCX4430也表現(xiàn)出良好的抗病毒作用,并且沒有出現(xiàn)任何的全身毒性或局部不良反應(yīng)[19]。此外,也有研究表明BCX4430在抑制多種RNA病毒(MERS-CoV、EBOV、MARV、SARS-CoV、ZIKV和YFV)感染過程中表現(xiàn)出廣譜作用[20-21]。本實驗初步研究了BCX4430對BHK-21和N2a細胞的毒性作用,結(jié)果表明BCX4430濃度在500 μmol/L內(nèi)對兩種細胞系無明顯的細胞毒性。同時,病毒感染前不同階段和病毒感染后分別加入BCX4430處理,結(jié)果表明預(yù)加藥對病毒的抑制作用不顯著,病毒感染后加入BCX4430可以有效抑制病毒的復(fù)制。CVS-11和SC16毒株感染BHK-21和N2a細胞后,加入不同濃度的BCX4430分別處理24 h、48 h和72 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCX4430可以有效抑制RABV的復(fù)制水平且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,250 μmol/L的BCX4430抑制效果最佳,病毒感染48 h的抑制作用最明顯,且在病毒感染后期也表現(xiàn)出較好的抑制效果。此外,基于利巴韋林和T-705對RABV抑制效果的研究[22-24],本實驗將利巴韋林、T-705和BCX4430對RABV的抑制效果進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCX4430表現(xiàn)出與利巴韋林相似的抗RABV作用,對RABV的抑制效果強于T-705。

抗狂犬病藥物篩選已然成為狂犬病防治的重心,本實驗結(jié)果表明,體外條件下BCX4430可以有效抑制RABV的復(fù)制,且細胞毒性較小,安全性較高,可以作為治療狂犬病的潛在藥物,為抗狂犬病藥物的進一步研發(fā)提供參考。

利益沖突：無