劉龍?jiān)?王曉權(quán),2,孫 松,白中穩(wěn),戴若萌,何曉麗

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院,安徽 合肥 238000;2.合肥師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 合肥 230000;3.合肥遠(yuǎn)志醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司,安徽 合肥 230000)

三黃洗劑收載于《中醫(yī)外科學(xué)》,處方由大黃、黃柏、黃芩、苦參四味中藥組成,具有清熱止癢、保護(hù)收斂的作用,治療各種急性無滲出性皮炎、單純性皮膚瘙癢。其臨床主要用于治療小兒皮膚念珠菌病、皮膚濕疹樣病變、帶狀皰疹、急性生陰部濕疹、尋常型膿皰瘡、尖銳濕疣、皮炎、濕疹、癤病、蚊蚤叮咬,伴有紅腫焮癢,或有少量滲液等[1-4],臨床療效確切,應(yīng)用于臨床多年,是多家醫(yī)院的院內(nèi)制劑。通過文獻(xiàn)調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)關(guān)于三黃洗劑的制法較為傳統(tǒng),現(xiàn)代提取工藝研究較少,阻礙其進(jìn)一步開發(fā)利用。

Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法(Box-Behnken design-response surface methodology,BBD-RSM)是近年來廣泛應(yīng)用的多實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的方法[5-9],通過建立多元回歸方程擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系。相較于單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn),響應(yīng)面法優(yōu)點(diǎn)在于利用最少的實(shí)驗(yàn)組數(shù)對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,有效地提升了提取效率。

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)確定三黃洗劑提取條件的基礎(chǔ)上,以小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的質(zhì)量濃度為考察指標(biāo),用熵權(quán)法結(jié)合BBD-RSM法對三黃洗劑的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以期實(shí)現(xiàn)三黃洗劑中有效成分的高效提取,為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試藥與儀器

大黃、黃柏、黃芩、苦參(購于安徽省中醫(yī)院);大黃素(批號110756-201913)、鹽酸小檗堿(批號110713-202015)、黃芩苷(批號110715-202223)、漢黃芩苷(批號112002-201702)、苦參堿(含量測定用,批號110805-202010),對照品來自于中國食品藥品檢定研究院;甲醇色譜純(美國阿斯頓化學(xué)技術(shù)有限公司),磷酸(成都市科隆化學(xué)品有限公司),乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),純化水(娃哈哈集團(tuán)(杭州)有限公司)。

Waters2695-2996高效液相色譜儀(Waters有限公司);ChromCore C18(250 mm×4 mm,5 μm)色譜柱(北京英萊克科技發(fā)展有限公司);HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華電器有限公司);梅特勒-托利多分析天平MF-MS105梅特勒-托利多集團(tuán));GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);RS-FS1401粉碎機(jī)(合肥榮事達(dá)小家電有限公司);WE-H3-18K臺式高速離心機(jī)(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

將大黃、黃柏、黃芩、苦參分別粉碎,過3號篩,浸出物測定時(shí)過2號篩,備用。

1.2.2 對照品溶液的制備

1.2.2.1 小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素

精密稱取小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的對照品適量,加入甲醇后進(jìn)行超聲處理,直至完全溶解,制成質(zhì)量濃度分別為0.816、0.544、0.808、0.086 mg/mL的混合對照品溶液,0.48 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得[10]。

1.2.2.2 苦參堿

精密稱取苦參堿對照品適量,加甲醇超聲處理至完全溶解,制成質(zhì)量濃度為1.046 0 mg/mL的苦參對照品溶液,使用0.48 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得苦參堿對照品溶液[11-12]。

1.2.2.3 供試品溶液

取制備的樣品粉末各2 g于錐形瓶中,加乙醇溶液100 mL,搖晃使藥粉全部潤濕,恒溫水浴鍋中加熱提取,提取液以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min后,取上層清液,用0.48 μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即為苦參供試品溶液。

1.2.2.4 陰性對照溶液制備

按照比例分別稱取三黃洗劑處方的大黃、黃柏、黃芩、苦參這四味藥材各3份,制成不含大黃、不含黃芩、不含黃柏、不含苦參的陰性樣品,并按“1.2.2.3”步驟操作,制得陰性樣品溶液。

1.3 小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素含量測定

1.3.1 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B);洗脫梯度:(0～20 min,10%A→37%A;20～30 min,37%A;30～31 min,37%A→38%A;31～36 min,38%A;36～50 min,38%A→65%A;50～80 min,65%A→100%A),體積流量1.0 mL/min;檢測波長265 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL[13-17]。

1.3.2 專屬性考察

按照“1.3.1”色譜條件,精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL注入高效液相色譜儀,分析溶劑、混合標(biāo)準(zhǔn)品、供試品溶液和陰性對照品溶液在波長264 nm條件下的HPLC色譜圖。

1.3.3 線性考察

精密吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL,按“1.3.1”中色譜條件進(jìn)樣測定。以質(zhì)量濃度對色譜峰的峰面積進(jìn)行線性回歸,繪制小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 精密度考察

取“1.2.2.1”中同一混合對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣5次,計(jì)算RSD。

1.3.5 穩(wěn)定性考察

按照“1.2.2.3”方法制備供試品溶液,于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣,計(jì)算RSD。

1.3.6 加樣回收率考察

精密量取已知質(zhì)量濃度的6份樣品溶液各2 mL,置10 mL容量瓶中,加入適量混合對照品溶液,混合均勻,按“1.2.2.3”方法制備供試品溶液,按“1.3.1”中色譜條件進(jìn)樣檢測,以峰面積為統(tǒng)計(jì)指標(biāo),分別計(jì)算各成分的平均回收率和RSD。

1.4 苦參堿含量測定

1.4.1 色譜條件

ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈-[0.01 mol/L乙酸銨溶液(濃氨試液調(diào)pH為 8.1)](V∶V=3∶2)為流動(dòng)相A,0.01 mol/L乙酸銨溶液(濃氨試液調(diào)pH為8.1)為流動(dòng)相B,洗脫梯度(0～20 min,10%A→30%A;20～40 min,30%A→40%A;40～50 min,40%A→60%A),體積流量1.0 mL/min,檢測波長225 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL[18]。

1.4.2 專屬性考察

按照“1.4.1”中色譜條件,精密吸取溶劑、對照品溶液、供試品溶液各10 μL 注入液相色譜儀,觀察供試品溶液中待測成分與對照品在相同的保留時(shí)間是否有對應(yīng)的色譜峰。

1.4.3 線性關(guān)系

按照“1.2.2.2”方法,精密稱取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇稀釋,以峰面積Y對苦參堿質(zhì)量濃度作回歸方程。

1.4.4 精密度考察

取“1.2.2.2”步驟的對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣5次,計(jì)算峰面積的RSD。

1.4.5 穩(wěn)定性考察

按照“1.2.2.3”方法制備供試品溶液,于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣,計(jì)算峰面積的RSD。

1.4.6 加樣回收率考察

精密量取已知含量的6份樣品溶液各2 mL,置于10 mL容量瓶中,加入適量的混合對照品溶液,混合均勻,按“1.2.2.3”中方法制備供試品溶液,按“1.4.1”中色譜條件進(jìn)樣,計(jì)算平均回收率和RSD。

1.5 提取工藝研究

1.5.1 綜合評分計(jì)算

熵權(quán)法[19-21]是根據(jù)多項(xiàng)指標(biāo)所提供的信息確定各指標(biāo)的權(quán)重。信息熵Ej表示體系的混亂程度。熵值越小,其權(quán)重越高,在綜合評價(jià)中所起作用也越大,具體計(jì)算方法如下:

①用公式(1)對數(shù)據(jù)歸一化處理。

(1)

②利用公式(2)、(3)、(4)計(jì)算出各指標(biāo)的信息熵Ej。

(2)

k=1/lnm,

(3)

(4)

其中,Pij為第j個(gè)指標(biāo)下第i組的概率,0≤Pij≤1,k為樣本數(shù)對數(shù)的倒數(shù),m為實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)。

③用公式(5)計(jì)算出權(quán)重系數(shù)Wj。

(5)

1.5.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.5.2.1 提取溫度

按處方配比取所需藥材適量,以提取時(shí)間90 min、乙醇濃度50%為固定量,考察不同提取溫度下,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的質(zhì)量濃度變化,結(jié)合綜合評分法優(yōu)選最佳提取溫度。

1.5.2.2 乙醇濃度

按處方配比取所需藥材適量,以提取時(shí)間90 min、提取溫度55 ℃為固定量,考察不同乙醇濃度下,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的質(zhì)量濃度變化,綜合評分法優(yōu)選最佳乙醇濃度。

1.5.2.3 提取時(shí)間

按處方配比取所需藥材適量,以提取溫度55 ℃、乙醇濃度50%為固定量,考察不同提取時(shí)間下,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的質(zhì)量濃度變化,在90 min之后,選擇最佳提取時(shí)間。

1.6 Box-Behnken響應(yīng)面法

本研究在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)提取溫度(X1)、乙醇濃度(X2)、提取時(shí)間(X3)對三黃洗劑提取工藝綜合評分影響顯著,故本實(shí)驗(yàn)以X1、X2、X3為考察因素,采用 Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)3因素3 水平Box-Behnken響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)方案。以小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的質(zhì)量濃度的綜合評分Z1、Z2、Z3、Z4、Z5為因變量,采用熵權(quán)法綜合評分法優(yōu)選三黃洗劑提取工藝,計(jì)算綜合評分(Z)。

1.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照最佳工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),并進(jìn)行含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素含量測定

2.1.1 專屬性考察結(jié)果

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液的HPLC色譜圖見圖1。由圖1可知,供試品溶液中待測成分與對照品在相同的保留時(shí)間有對應(yīng)的色譜峰。

(a)混合標(biāo)準(zhǔn)品 (b)供試品

(c)大黃陰性 (d)黃芩陰性

(e)苦參陰性 (f)黃柏陰性峰1-小檗堿;峰2-黃芩苷;峰3-漢黃芩苷;峰4-大黃素。圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液的HPLC色譜圖

2.1.2 線性考察結(jié)果

分別繪制各對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。各對照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)r、線性范圍見表1,結(jié)果表明各成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素的線性關(guān)系

2.1.3 精密度考察結(jié)果

小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素對應(yīng)峰面積的RSD分別為1.05%、1.12%、1.33%、1.26%,結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.4 加樣回收考察結(jié)果

小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素加樣回收率結(jié)果見表2,符合方法學(xué)要求。

表2 小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.2 苦參堿含量測定

2.2.1 專屬性考察結(jié)果

供試品溶液中待測成分與對照品在相同的保留時(shí)間有對應(yīng)的色譜峰。

2.2.2 線性關(guān)系結(jié)果

繪制對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線,峰面積Y對鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度回歸方程:Y5=3 474 968.657 53X-155 42,r=0.999 6,在209.2～1 046.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度考察結(jié)果

重復(fù)進(jìn)樣5次,峰面積的RSD為2.07%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.4 加樣回收率考察結(jié)果

苦參加樣回收率結(jié)果見表3,符合方法學(xué)考察。

表3 苦參加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.3 綜合評分計(jì)算結(jié)果

應(yīng)用熵權(quán)法計(jì)算得到小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的權(quán)重值分別為 0.226、0.233、0.175、0.258、0.107。綜合評分Y=0.226Z1+0.233Z2+0.175Z3+0.258Z4+0.107Z5,其中,Z1為小檗堿的質(zhì)量濃度,Z2為黃芩苷質(zhì)量濃度,Z3為漢黃芩苷質(zhì)量濃度,Z4為大黃素質(zhì)量濃度,Z5為苦參堿質(zhì)量濃度。計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組別各指標(biāo)成分綜合評分。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度對綜合評分的影響結(jié)果如圖2(a)～(c)所示。

(a)提取時(shí)間 (b)提取溫度 (c)乙醇濃度圖2 提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度對綜合評分的影響

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平、實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值

采用 Design Expert 8.0.6軟件將各組綜合評分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸和二項(xiàng)式分析,對3個(gè)因素的二次回歸模型方程建立綜合評分:

F=5.75+0.153 7X1+0.068 8X2+0.112 5X3+0.047 5X1X2+

對回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

圖3 提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度與提取功率交互作用對綜合評分影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)模型擬合結(jié)果,提取溫度為56.4 ℃,提取時(shí)間為93.9 min,乙醇濃度為71.5%,按照最佳工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),并進(jìn)行含量測定。如表6所示,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)綜合評分均值為5.84,與理論最佳工藝樣品的綜合評分5.80基本吻合,說明優(yōu)化得到的提取工藝條件較為穩(wěn)定可行。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

中藥復(fù)方組分較多,不同的加工工藝對復(fù)方質(zhì)量有很大的影響[21]。液體制劑具有體積大、運(yùn)輸攜帶不方便的特點(diǎn),可通過優(yōu)化中藥復(fù)方的提取工藝,將提取液濃縮為濃縮液、浸膏或粉末,進(jìn)而制成其他制劑,方便使用。中藥復(fù)方工藝優(yōu)化的評價(jià)方法是學(xué)者們一直在探索的問題,王銳等[22]以桑皮苷A、指紋圖譜相似度、出膏率以及地骨皮乙素為評價(jià)指標(biāo),通過模糊層次分析法(fuzzy analytical hierarchy process,FAHP)-熵權(quán)法結(jié)合基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù),計(jì)算綜合評分,優(yōu)化經(jīng)典名方瀉白散的提取工藝;李婉玉等[23]以總多糖、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮的含量,及浸膏得率為評價(jià)指標(biāo),采用AHP結(jié)合熵權(quán)法確定權(quán)重系數(shù),以多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法優(yōu)化復(fù)方紅黃咀嚼片提取工藝;張星等[24]利用多元統(tǒng)計(jì)分析對指紋圖譜 共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)與正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)并計(jì)算得分,優(yōu)化經(jīng)典名方四妙勇安湯煎煮工藝。

本實(shí)驗(yàn)建立RP-HPLC檢測方法,以三黃洗劑中五種代表性成分為評價(jià)指標(biāo),先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)確定因素的考察范圍,再通過Box-Behnken響應(yīng)面法考察因素之間的交叉影響,結(jié)合熵權(quán)法進(jìn)行綜合評分,優(yōu)化三黃洗劑提取的工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,提取溫度56.4 ℃,提取時(shí)間93.9 min,乙醇濃度71.5%,綜合評分為5.84,與模型理論預(yù)測值基本一致,表示該模型準(zhǔn)確度可信,質(zhì)量穩(wěn)定,能夠較合理地應(yīng)用于三黃洗劑提取的工藝優(yōu)化,為中藥復(fù)方的制劑研究提供參考。