王超之，高新貞，王 麗，劉 枕，趙 銳*

（1.山東理工大學(xué)，山東 淄博 255000；2.淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086）

細(xì)菌內(nèi)毒素是現(xiàn)今醫(yī)藥生產(chǎn)工業(yè)中最常見的外源性熱原[1]，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖結(jié)構(gòu)，細(xì)菌增殖、死亡或溶解后內(nèi)毒素從細(xì)胞壁表面釋放，臨床上可能導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)炎和感染[2]。

維生素B6是人體內(nèi)一些輔酶的組成成分，是維持人體健康所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，參與人體代謝過程和免疫調(diào)節(jié)，具有抗炎、抗癌等作用[3]。維生素B6注射液為無色或淡黃色的澄明液體，可用于預(yù)防和治療小兒驚厥[4]；也能減輕妊娠嘔吐或癌癥治療引起的惡心、嘔吐等[5]，還可治療長期或大量服用異煙肼導(dǎo)致的失眠、不安及周圍神經(jīng)炎[6]。其在酸性溶液中穩(wěn)定，堿性溶液中易被破壞[7]。其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2020年版二部，細(xì)菌內(nèi)毒素的限度為每1 mg維生素B6中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.30 EU[8]。國內(nèi)文獻(xiàn)多用凝膠限度法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測[6,9-13]，未發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)濁度法用于維生素B6注射液內(nèi)毒素檢測的文獻(xiàn)。本研究根據(jù)《中國藥典》2020年版四部通則1143和指導(dǎo)原則9251[14]，選擇9個(gè)廠家共41批維生素B6注射液，分別用凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法檢測內(nèi)毒素，并對比兩種方法的結(jié)果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ZH-2型旋渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；TAL-40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；PKF32細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀（美國ACC）。

1.2 試藥

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-202191，規(guī)格：90 EU/支）；動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：2112290，可測內(nèi)毒素范圍：0.01～10 EU/ml，規(guī)格：每支1.25 ml）；鱟試劑（0.25 EU/ml，批號(hào)：2208053，湛江博康海洋生物有限公司；0.125 EU/ml，批號(hào)：2208023，湛江安度斯生物有限公司；0.125 EU/ml，批號(hào)：2204112，湛江博康海洋生物有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：2205171，規(guī)格：每支50 ml）；維生素B6注射液（華潤雙鶴利民藥業(yè)，共7批，批號(hào)：21100320，22060205，22050319，22060204，21120307，21120305，21120306；瑞陽制藥，共6批，批號(hào)：21060511，22030811，22030712，22030812，21101811，21101711；方明藥業(yè)，共10批，批號(hào)：21091341，22021243，21091144，22051943，22052043，22051843，21090744，21091543，21091444，20091744；華魯制藥，共3批，批號(hào)：XA21I10，XA21I09，XA21I08；新華制藥，共8批，批號(hào)：2204154，2204157，2204160，2009144，2201030，2112034，2201006，2112023；晉新雙鶴藥業(yè)，共2批，批號(hào)：220109221，220108221；太原藥業(yè)，共2批，批號(hào)：211209，211214；歐意藥業(yè)，共1批，批號(hào)：073210410；美大康華康藥業(yè)，共2批，批號(hào)：22011317，22021627）。

2 方法與結(jié)果

2.1 凝膠法

2.1.1 干擾預(yù)試驗(yàn) 根據(jù)公式MVD=CL/λ（MVD：最大有效稀釋倍數(shù)；C：供試品溶液的濃度；L：細(xì)菌內(nèi)毒素的限值；λ：鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），不同靈敏度鱟試劑對應(yīng)的樣品MVD和最大不干擾濃度見表1。

表1 不同靈敏度鱟試劑MVD和最大不干擾濃度

取4個(gè)廠家各1批檢品，用BET水溶解并稀釋成0.883，0.417，0.208 mg/ml 3個(gè)濃度，作為供試品溶液（NPC）；另取相同批號(hào)檢品，同樣稀釋為上述3個(gè)濃度，但稀釋過程中加入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，使其含濃度為2λ（0.5 EU/ml）的細(xì)菌內(nèi)毒素，作為供試品陽性對照溶液（PPC）。用λ為0.25 EU/ml的鱟試劑分別與上述溶液反應(yīng)，每組做2個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置陽性對照組（PC）和陰性對照組（NC），結(jié)果見表2。

表2 干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，當(dāng)各廠家注射液稀釋120倍及以上時(shí)可消除干擾。即應(yīng)使用λ=0.125 EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑進(jìn)行凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.1.2 干擾試驗(yàn) 取表2的4批樣品，根據(jù)中國藥典2020年版四部通則1143進(jìn)行干擾試驗(yàn)[4]，鱟試劑靈敏度λ=0.125 EU/ml，稀釋劑為0.417 mg/ml樣品溶液和BET水。結(jié)果見表3。結(jié)果表明，鱟試劑靈敏度的測定值（λc）在0.5λ和2λ之間，符合藥典要求。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性分析

2.1.3 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限度檢查 取9個(gè)廠家共41批檢品，用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑依法進(jìn)行檢查，結(jié)果樣品均符合規(guī)定。

2.2 動(dòng)態(tài)濁度法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及可靠性分析 取1支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用BET水稀釋，制成最終細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為1.25，0.25，0.05，0.01 EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液及BET水各 0.1 ml，分別加入預(yù)先加有0.1 ml動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑的試管中，混勻，插入預(yù)熱到37 ℃的PKF32細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)檢測，其中標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)3個(gè)平行，BET水重復(fù)2個(gè)平行。檢測波長為660 nm。以平均反應(yīng)時(shí)間的對數(shù)（lgT）為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度的對數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為lgT=-0.3114lgC+2.794（r=-0.9966，絕對值大于0.980），平行管之間的RSD均小于10 %，陰性對照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

2.2.2 干擾試驗(yàn) 供試品的最大稀釋倍數(shù)MVD=CL/λ=50×0.3/0.01=1500倍。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)毒素濃度范圍的設(shè)置，選擇0.25 EU/ml作為靠近標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（λm）。取3個(gè)廠家的各1批樣品，用BET水將供試品分別稀釋100，200，500倍，作為供試品溶液（NPC），同時(shí)另行制備含0.25 EU/ml內(nèi)毒素的上述供試品溶液，作為供試品陽性對照溶液（PPC）；以BET 水作為陰性對照溶液（NC）。上述溶液均做2支平行管，并計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率，結(jié)果見表5。由結(jié)果可知，樣品稀釋200倍回收率合格但偏低，稀釋500倍回收率合格且更接近100 %，因此動(dòng)態(tài)濁度法樣品均稀釋500倍進(jìn)行檢查。

表5 動(dòng)態(tài)濁度法干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查 用λ=0.01～10 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)，標(biāo)曲范圍為0.01～0.125 EU/ml，樣品稀釋倍數(shù)為500倍，結(jié)果41批檢品細(xì)菌內(nèi)毒素均小于0.01 EU/ml，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

3 討論

3.1 鱟試劑靈敏度的選擇

對于凝膠法檢查維生素B6注射液細(xì)菌內(nèi)毒素，以往研究者選擇的鱟試劑靈敏度不盡相同，有的用0.06 EU/ml的鱟試劑[6,9,13]，有的用0.25 EU/ml的鱟試劑[10-12]，分析原因一是選擇的供試品廠家不同，本研究也發(fā)現(xiàn)有的廠家用0.25 EU/ml的鱟試劑也能通過干擾試驗(yàn)；二是供試品生產(chǎn)年份不同，可能不同廠家、不同年份的產(chǎn)品存在工藝上的差別，導(dǎo)致干擾因素和干擾水平有差異。鱟試劑靈敏度太低可能無法消除試驗(yàn)干擾，靈敏度太高則增加了檢驗(yàn)成本。本研究用0.125 EU/ml的鱟試劑即可通過干擾試驗(yàn)，也可節(jié)約試驗(yàn)成本。

3.2 稀釋倍數(shù)的差別

進(jìn)行內(nèi)毒素檢查時(shí)，供試品和鱟試劑混合后的溶液pH為6.0～8.0較為合適[14]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，維生素B6注射液pH應(yīng)為2.5～4.0[8]，對內(nèi)毒素檢查造成干擾。本試驗(yàn)采用稀釋的方法來消除pH的干擾作用。干擾試驗(yàn)表明，凝膠法稀釋到120倍可去除干擾，動(dòng)態(tài)濁度法稀釋200倍回收率合格但偏低，稀釋500倍回收率較好，與最大稀釋倍數(shù)1500倍相比，稀釋步驟較少。兩種方法稀釋倍數(shù)不同，文獻(xiàn)中也常見這種情況，如丹紅注射液凝膠法稀釋倍數(shù)大[15]，痰熱清注射液動(dòng)態(tài)濁度法稀釋倍數(shù)大[16]，因此，并不能完全參考凝膠法的稀釋倍數(shù)直接進(jìn)行動(dòng)態(tài)濁度法試驗(yàn)。原因可能是由于兩種方法的結(jié)果判定方式不同，凝膠法需要形成堅(jiān)實(shí)、不變形的凝膠，動(dòng)態(tài)濁度法則是檢測反應(yīng)混合物的吸光度達(dá)到設(shè)定值所需的時(shí)間[15]。

3.3 兩種方法的比較

兩種方法均可用于維生素B6注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。凝膠法操作簡單，成本較低，是內(nèi)毒素檢查的經(jīng)典方法和處理爭議的仲裁方法，本試驗(yàn)中此方法稀釋倍數(shù)比動(dòng)態(tài)濁度法少，只能做限度檢查。動(dòng)態(tài)濁度法可獲得更大的稀釋倍數(shù)，靈敏度更高，能在一定濃度范圍內(nèi)定量檢測細(xì)菌內(nèi)毒素含量；建立標(biāo)準(zhǔn)曲線能更好地減輕內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品對試驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，樣品的受干擾程度可通過量化的回收率數(shù)值直觀地表現(xiàn)出來，所用儀器設(shè)備能記錄更多試驗(yàn)信息，數(shù)據(jù)完整性和可追溯性更好[17-18]。相關(guān)人員可根據(jù)需求選擇合適的方法。