劉曉強(qiáng)，劉 毅，蔣曉勤*

（1.常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 常州 213102；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 102600）

乙二胺四乙酸二鈉（也稱依地酸二鈉，EDTA-2Na）是一種常用的注射劑穩(wěn)定劑，其與微量的金屬離子可形成穩(wěn)定的螯合物，避免了金屬離子對(duì)藥物自身氧化的催化作用，有利于提高藥物在制備、存儲(chǔ)和臨床配制過程中的穩(wěn)定性[1-3]。EDTA-2Na被列為GRAS安全物質(zhì)，收載于美國FDA《非活性組分指南》，英國也被許可用于非注射和注射給藥制劑。在藥物制劑中EDTA-2Na被用作螯合劑的一般濃度為 0.005 %～0.1 %（w/v）。但必須指出如果人體大量攝入EDTA-2Na，它會(huì)與血液及骨骼中的鈣形成水溶性螯合物，被排出體外，引起低血鈣癥或骨鈣流失[4-6]，因此，需嚴(yán)格控制注射劑中EDTA-2Na用量。同時(shí)，基于一致性評(píng)價(jià)的要求，仿制藥處方中各成分來源及含量均需與參比制劑一致。因此，探索一種能評(píng)估各品種制劑中依地酸二鈉含量的方法既能滿足一致性評(píng)價(jià)的實(shí)際需要，同時(shí)也能用于評(píng)估各制劑臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LCMS-8060型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（含島津LC-30A高效液相色譜儀、電噴霧離子化接口、三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器、色譜工作站，日本島津）；XP205電子天平（瑞士Mettler Toledo）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀）；Milli-Q純水機(jī)（德國Merck）。

1.2 試藥

維生素C 注射液（生產(chǎn)企業(yè)A，批號(hào)：21060213，規(guī)格：2 ml:0.5 g）；鹽酸多巴胺注射液（生產(chǎn)企業(yè)B，批號(hào)：2101131，規(guī)格：2 ml:20 mg）；注射用奧美拉唑鈉（生產(chǎn)企業(yè)C，批號(hào)：B2106181，規(guī)格：40 mg）；注射用艾司奧美拉唑鈉（生產(chǎn)企業(yè)D，批號(hào)：20210308，規(guī)格：40 mg）；注射用泮托拉唑鈉（生產(chǎn)企業(yè)E，批號(hào)：51200801，規(guī)格：2 ml:0.5 g）。乙腈（質(zhì)譜級(jí)，霍尼韋爾國際公司）；乙酸銨（國藥集團(tuán)）；依地酸二鈉（美國Sigma）；冰醋酸（上海泰坦）；硫酸銅（上海泰坦）；實(shí)驗(yàn)用水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用安捷倫InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），流速為1.0 ml/min，流動(dòng)相A：20 mmol/L乙酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.0），流動(dòng)相B：乙腈，按表1進(jìn)行梯度洗脫；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離（ESI）源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，負(fù)離子模式，霧化氣流量：3 L/min，加熱氣流量：10 L/min，接口溫度：300 ℃，脫溶劑溫度：526 ℃，曲型脫溶劑管（CDL）溫度：250 ℃，加熱塊溫度：400 ℃，干燥氣流量：10 L/min。定量離子及定性離子參數(shù)詳見表2。

表2 定量離子及定性離子參數(shù)

2.3 溶液配制

2.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備 取EDTA-2Na對(duì)照品約0.1 g，精密稱定，置100 ml量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻即得（1 mg/ml）。精密量取溶液2 ml，置200 ml量瓶中，精密加入0.04 mol/L硫酸銅溶液4 ml，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，即得10 μg/ml EDTA-2Na溶液。

2.3.2 供試品溶液的配制

2.3.2.1 鹽酸多巴胺注射液供試品溶液的制備方法精密量取樣品6 ml，置10 ml量瓶中，精密加入0.04 mol/L硫酸銅溶液0.2 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min。精密量取上述溶液2 ml，置200 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得，平行制備兩份。

2.3.2.2 維生素C注射液供試品溶液的制備 精密量取樣品1 ml，置100 ml量瓶中，精密加入0.04 mol/L硫酸銅溶液2 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，即得。

2.3.2.3 注射用奧美拉唑鈉、注射用艾司奧美拉唑鈉、注射用泮托拉唑鈉供試品溶液的制備 取樣品1瓶量，精密稱定，置50 ml量瓶中，加水適量使溶解，精密加入0.04 mol/L硫酸銅溶液1 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min。取上述溶液離心，精密量取上清2 ml，置200 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備 依次精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2，3，5，5，5 ml，分別置200，100，100，50，25 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得濃度依次為0.1，0.3，0.5，1，2 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2.4 專屬性

取水、0.004 mol/L硫酸銅溶液、0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液、注射用奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用艾司奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用泮托拉唑鈉供試品溶液、鹽酸多巴胺注射液供試品溶液、維生素C注射液樣品溶液各10 μl，依次進(jìn)樣，色譜圖見圖1。水、0.004 mol/L硫酸銅溶液在EDTA-Cu處均未出峰，不干擾檢測(cè)。0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液、注射用奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用艾司奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用泮托拉唑鈉供試品溶液、鹽酸多巴胺注射液供試品溶液、維生素C注射液供試品溶液EDTA-Cu峰形良好，注射用奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用艾司奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用泮托拉唑鈉供試品溶液、鹽酸多巴胺注射液供試品溶液、維生素C注射液供試品溶液EDTA-Cu定量離子峰與定性離子峰峰面積比例（100:75）與對(duì)照品溶液基本一致。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖

2.5 線性

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液依次進(jìn)樣分析，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以濃度（C）為橫坐標(biāo)作圖，回歸方程：A=106 337C-2305.82，r=0.999 98，EDTA-Cu在0.1～2 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度

取注射用泮托拉唑鈉約1瓶量，精密稱定，置50 ml量瓶中，加水適量使溶解，精密加入0.04 mol/L CuSO4溶液1 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min。取上述溶液離心，精密量取上清2 ml，置200 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。平行制備6份樣品，依次進(jìn)樣，取峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算依地酸二鈉含量。

2.6.1 重復(fù)性 6份泮托拉唑鈉供試品溶液依地酸二鈉含量依次為0.205，0.202，0.206，0.210，0.208，0.201 μg/ml，均值為0.205 μg/ml，RSD為1.54 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.2 中間精密度 分別由3人分3 d采用3臺(tái)不同的儀器分別測(cè)定6份注射用泮托拉唑鈉供試品溶液，儀器分別為島津LC-MS/MS-8060，AB LC-LCMS/MS-4500+和島津LC-MS/MS-8050，3個(gè)批次數(shù)據(jù)依次為：0.205，0.202，0.206，0.210，0.208，0.201 mg/L；0.203，0.206，0.206，0.204，0.196，0.206 mg/L；0.201，0.205，0.199，0.207，0.202，0.200 μg/ml；均值為0.204 μg/ml，RSD為1.68 %，表明方法中間精密度良好。

2.7 檢測(cè)限與定量限

2.7.1 檢測(cè)限 精密量取0.1 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液5 ml，置50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得（0.01 μg/ml），取上述溶液進(jìn)樣，色譜圖見圖2，S/N為5，檢測(cè)限為0.01 μg/ml。

圖2 檢測(cè)限溶液色譜圖

2.7.2 定量限 精密量取0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液3 ml，置10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得（0.03 mg/L），取上述溶液進(jìn)樣，色譜圖見圖3，S/N為16，定量限為0.03 μg/ml。

圖3 定量限溶液色譜圖

2.8 加樣回收試驗(yàn)

2.8.1 溶液制備

2.8.1.1 EDTA-2Na對(duì)照品儲(chǔ)備溶液A（實(shí)際濃度：3.15 mg/ml）的制備 取EDTA-2Na對(duì)照品約0.3 g，精密稱定，置100 ml量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.8.1.2 EDTA-2Na對(duì)照品溶液A（實(shí)際濃度：315 μg/ml）的制備 精密量取EDTA-2Na對(duì)照品儲(chǔ)備溶液A 5 ml，置50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。

2.8.1.3 EDTA-2Na對(duì)照品儲(chǔ)備溶液B（實(shí)際濃度：2.08 mg/ml）的制備 取EDTA-2Na對(duì)照品約0.2 g，精密稱定，置100 ml量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.8.1.4 EDTA-2Na對(duì)照品溶液B（實(shí)際濃度：208 μg/ml）的制備 精密量取EDTA-2Na對(duì)照品儲(chǔ)備溶液B 5 ml，置50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。

2.8.2 鹽酸多巴胺注射液加樣回收率測(cè)定 依次精密量取鹽酸多巴胺注射液樣品3 ml，分別置10 ml量瓶中，依次精密加入EDTA-2Na對(duì)照品溶液A 400，500，600 μl，精密加入0.04 mol/L CuSO4溶液0.2 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min。精密量取上述溶液2 ml，置200 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。每個(gè)濃度平行制備3份。按2.1及2.2項(xiàng)下條件測(cè)定。

2.8.3 維生素C注射液加樣回收率測(cè)定 依次精密量取維生素C注射液樣品1 ml，分別置200 ml量瓶中，依次精密加入EDTA-2Na對(duì)照品溶液B 400，500，600 μl，加水適量，精密加入0.04 mol/L硫酸銅溶液4 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，即得。每個(gè)濃度平行制備3份。按2.1及2.2項(xiàng)下條件測(cè)定。

2.8.4 注射用奧美拉唑鈉、注射用艾司奧美拉唑鈉、注射用泮托拉唑鈉加樣回收率測(cè)定 依次取樣品1瓶量，分別精密稱定，置100 ml量瓶中，依次精密加入EDTA-2Na對(duì)照品儲(chǔ)備溶液A 400，500，600 μl，加水適量使溶解，精密加入0.04 mol/L硫酸銅溶液2 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min。取上述溶液離心，精密量取上清2 ml，置200 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。每個(gè)濃度平行制備3份。按2.1及2.2項(xiàng)下條件測(cè)定。

結(jié)果見表3。由表3可見，鹽酸多巴胺注射液低、中、高濃度的加樣回收率均在97 %左右，且平行性良好；維生素C注射液低、中、高濃度的加樣回收率均在94 %左右，且平行性良好；注射用奧美拉唑鈉、注射用艾司奧美拉唑鈉、注射用泮托拉唑鈉低、中、高濃度的加樣回收率均在99 %左右，且平行性良好。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 耐用性

2.9.1 柱溫耐用性 分別設(shè)置柱溫為30 ℃及40 ℃，其他色譜及質(zhì)譜條件不變，依次取0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，依地酸二鈉峰峰形良好，保留時(shí)間無明顯變化，表明該方法柱溫耐用性良好。

2.9.2 流速耐用性 分別設(shè)置流速分別為0.8 ml/min及1.2 ml/min，其他色譜及質(zhì)譜條件不變，依次取0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，依地酸二鈉峰峰形良好，表明該方法流速耐用性良好。

2.9.3 色譜柱耐用性 改用島津Shim-pack GIS HILIC（4.6 mm100 mm，5 μm），其他色譜及質(zhì)譜條件不變，依次取0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，依地酸二鈉峰峰形良好，表明該方法柱溫耐用性良好。

2.9.4 儀器耐用性 分別采用AB LC-MS/MS-4500+及島津LC-MS/MS-8050檢測(cè)，其他色譜及質(zhì)譜條件不變，依次取0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，依地酸二鈉峰峰形良好，表明該方法儀器耐用性良好。

2.9.5 梯度耐用 分別按表4、表5梯度洗脫程序，其他色譜及質(zhì)譜條件不變，依次取0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，依地酸二鈉峰峰形良好，表明該方法梯度耐用性良好。

表4 梯度洗脫程序1

表5 梯度洗脫程序2

2.9.6 流動(dòng)相pH耐用性 分別將流動(dòng)相A pH調(diào)至2.5及3.5，其他色譜及質(zhì)譜條件不變，依次取0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，依地酸二鈉峰峰形良好，表明該方法流動(dòng)相pH耐用性良好。

2.10 膜過濾試驗(yàn)

依次取0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液、鹽酸多巴胺注射液供試品溶液、維生素C注射液供試品溶液、注射用奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用艾司奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用泮托拉唑鈉供試品溶液適量，采用0.22 μm濾頭過濾，分別將初濾液及棄去1，3，5，7，9 ml后的續(xù)濾液依次進(jìn)樣。結(jié)果表明，依地酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液、鹽酸多巴胺注射液供試品溶液、維生素C注射液供試品溶液、注射用奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用艾司奧美拉唑鈉供試品溶液和注射用泮托拉唑鈉供試品溶液中依地酸二鈉均無膜吸附作用，但仍建議實(shí)驗(yàn)時(shí)如需過濾，棄去2～3 ml初濾液。

2.11 穩(wěn)定性考察

2.11.1 依地酸二鈉對(duì)照品溶液穩(wěn)定性考察 分別于4，8，12，2，3，48，60，72，84，96 h，取0.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)樣測(cè)定，峰面積無明顯差異（RSD為0.77 %），表明依地酸二鈉對(duì)照品溶液96 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11.2 供試品溶液依地酸二鈉穩(wěn)定性考察 分別于4，8，12，24，36，48 h，取鹽酸多巴胺注射液供試品溶液、維生素C注射液供試品溶液、注射用奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用艾司奧美拉唑鈉供試品溶液、注射用泮托拉唑鈉供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，各溶液中待測(cè)物峰面積無明顯差異（RSD依次為0.66 %，0.92 %,0.60 %，0.42 %，0.49 %），表明各供試品溶液中依地酸二鈉48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.12 樣品測(cè)定

按2.3項(xiàng)下方法依次制備標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液及供試品溶液，按2.1及2.2項(xiàng)下條件測(cè)定，取峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算依地酸二鈉含量。鹽酸多巴胺注射液、維生素C注射液、注射用奧美拉唑鈉、注射用艾斯奧美拉唑鈉、注射用泮托拉唑鈉中依地酸二鈉含量分別約為48 μg/ml，140 μg/ml，1.5 mg/瓶，1.5 mg/瓶，1.0 mg/瓶。

3 討論

3.1 螯合金屬離子的選擇

EDTA螯合金屬離子穩(wěn)定性排序?yàn)镸o6+＞Bi3+＞Fe3+＞Cu2+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+＞K+＞Ca2+＞Mg2+，其中較為常用的螯合金屬離子為Fe3+、Cu2+[7-8]，EDTA-2Na與Cu2+形成螯合物的穩(wěn)定常數(shù)為1018.7，而與Fe3+可形成更為穩(wěn)定的螯合物，穩(wěn)定常數(shù)為1024.2[9]。為避免供試品溶液中可能存在的金屬離子對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，選擇采用CuSO4溶液中的Cu2+作為絡(luò)合離子與EDTA形成穩(wěn)定的螯合物。未選擇更穩(wěn)定的Fe3+是因?yàn)殡m然對(duì)照溶液出峰更好，但預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明維生素C注射液加樣回收率較差且平行性較差，可能Fe3+與維生素C之間存在氧化還原反應(yīng)有關(guān)。

3.2 分析方法的選擇

預(yù)試驗(yàn)時(shí)采用DAD檢測(cè)器進(jìn)行分析，但維生素C注射液的規(guī)格分別為2 ml:0.5 g及5 ml:1 g，即維生素C的濃度為0.25 g/ml及0.2 g/ml，若直接進(jìn)樣或低倍數(shù)稀釋（10倍以內(nèi)）后進(jìn)樣，維生素C會(huì)出現(xiàn)顯著的柱過載現(xiàn)象，基線上升導(dǎo)致EDTA-2Na峰積分不準(zhǔn)確甚至被淹沒而導(dǎo)致無法積分，因此采用UPLC-MS/MS+HILIC柱法進(jìn)行確證及分析。同時(shí)需說明的是，對(duì)鹽酸多巴胺注射液、注射用奧美拉唑鈉、注射用泮托拉唑鈉、注射用艾司奧美拉唑鈉及部分EDTA-2Na濃度較高的維生素C注射液該方法也可使用DAD為檢測(cè)器，用峰面積定量，采用全波長(zhǎng)紫外吸收?qǐng)D譜進(jìn)行輔助定性。

3.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇

預(yù)試驗(yàn)時(shí)，對(duì)照品及供試品溶液加入CuSO4溶液并定容后均立即進(jìn)樣，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性及供試品溶液平行性均有問題，懷疑反應(yīng)需要時(shí)間并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照品及供試品溶液加入CuSO4溶液并定容后立即、靜置5，10，20，30，40，50，60 min后依次測(cè)定，其中立即、靜置5，10，20，30 min測(cè)定峰面積依次上升，靜置30，40，50，60 min測(cè)定峰面積無明顯變化，因此確定對(duì)照品及供試品溶液加入CuSO4溶液并定容后均需靜置30 min后方可進(jìn)樣。

4 結(jié)論

該方法專屬性、線性及范圍、重復(fù)性、中間精密度、加樣回收率、檢測(cè)限與定量限、耐用性、對(duì)照品溶液及供試品溶液穩(wěn)定性均較好，可以用于測(cè)定維生素C注射液、鹽酸多巴胺注射液、注射用奧美拉唑鈉、注射用艾司奧美拉唑鈉、注射用泮托拉唑鈉中EDTA-2Na含量。