甘加明，黃 丹，嚴(yán)全鴻

（廣東省藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663）

纈沙坦（valsartan，VAL），化學(xué)名稱為N-戊?；?N-[[2’-（1H-四氮唑-5-基）聯(lián)苯-4-基]甲基]-L-纈氨酸，屬于第二代血管緊張素II受體抑制劑抗高血壓類藥物，它選擇性地作用于1型受體，阻斷血管緊張素II與1型受體的結(jié)合，從而抑制血管收縮和醛固酮的釋放，產(chǎn)生降壓作用。有文獻(xiàn)報(bào)道[1-3]，纈沙坦能有效治療輕、中度原發(fā)性高血壓，并能改善患者的胰島素抵抗，并且不作用于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、腎素和其他受體，不抑制與血壓調(diào)節(jié)和鈉平衡有關(guān)的離子通道，不良反應(yīng)少。纈沙坦屬于BCS II類（低溶解高滲透）藥物[4]，在水中幾乎不溶，為pH依賴型藥物，隨pH值上升，溶解度增加[5]。藥物自身溶解度和藥物從制劑內(nèi)釋放的速率決定了藥物的溶出度，直接影響制劑的質(zhì)量和療效[6-7]。體外溶出試驗(yàn)是評(píng)價(jià)口服固體制劑內(nèi)在質(zhì)量的一種重要手段，也是口服固體制劑開發(fā)和質(zhì)量控制中的重要方法?！吨袊?guó)藥典》2020年版四部通則新增流池法（flow-through cell method，F(xiàn)TC）[8]作為溶出度與釋放度測(cè)定的第六法。FTC不僅適用于片劑和膠囊劑等傳統(tǒng)口服固體制劑的溶出度測(cè)定，還可用于粉末、栓劑、顆粒劑、混懸劑、微球等劑型及藥物洗脫支架的溶出度測(cè)定。流池法可避免已有溶出度測(cè)定方法因吸附平衡導(dǎo)致的溶出困難及機(jī)械攪拌的弊端，尤其適用于難溶性藥物的溶出研究，能更好地模擬體內(nèi)生理環(huán)境，更具有區(qū)分力[9]。

《中國(guó)藥典》2020年版中纈沙坦片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)修訂后的公示稿[10]、美國(guó)藥典43版、日本藥局方2018版和英國(guó)藥典2022版纈沙坦片的溶出度檢查均采用第二法（槳法），轉(zhuǎn)速為每分鐘50轉(zhuǎn)，以pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，在該溶出條件下15 min內(nèi)纈沙坦片即達(dá)到全溶出。該溶出方法既不能精確地控制藥物釋放速率，也無(wú)法起到控制產(chǎn)品質(zhì)量的作用。本文建立了一種具有合適區(qū)分力的體外溶出方法，該方法對(duì)纈沙坦片的處方優(yōu)化和質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要參考價(jià)值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SOTAX CE7 Offline流通池溶出度儀，包括SOTAX CE7主機(jī)、CY7-50活塞泵（瑞士Sotax公司）；SHIMADZU高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器，日本島津公司）；SOTAX AT 7X溶出度儀（瑞士Sotax公司）；Mettler XS205電子分析天平（美國(guó)Mettler Toledo公司）；Sartorius PB-10 pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥

纈沙坦片（規(guī)格：80 mg；來(lái)源：A公司，批號(hào)：12100；B公司，批號(hào)：20200502）；纈沙坦對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100651-202006，含量： 99.0 %）；鹽酸，磷酸二氫鉀，冰醋酸，氫氧化鈉，乙酸鈉均為分析純，乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO SPOLAR C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水-冰醋酸（500:500:1）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 對(duì)照品溶液 取纈沙坦對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置入50 ml量瓶，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取4 ml，置入10 ml量瓶，用pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，即得。

2.2.1.2 供試品溶液 取供試品粉末適量（相當(dāng)于纈沙坦約10 mg），精密稱定，置入25 ml量瓶并加入pH 6.8磷酸鹽緩沖液10 ml，超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液2 ml，置入10 ml量瓶，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.1.3 空白輔料溶液 按處方取不含纈沙坦的空白輔料約10 mg，置25 ml量瓶中，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液10 ml超聲，稀釋至刻度，搖勻，精密量取續(xù)濾液2 ml，置10 ml量瓶中，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 專屬性試驗(yàn) 分別取空白輔料溶液、供試品溶液和對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，空白輔料和溶出介質(zhì)均不干擾纈沙坦的含量測(cè)定。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.2.3 線性試驗(yàn) 取纈沙坦對(duì)照品約31.47 mg，精密稱定，置入20 ml量瓶，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液5 ml，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。分別取對(duì)照品貯備液適量，用pH 6.8磷酸鹽緩沖液定量稀釋制成約含纈沙坦0.8，3.9，7.8，15.7，62.9，125.9，629.4，786.7，1258.9 μg/ml的系列溶液，按 2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對(duì)濃度（X，μg/ml）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明纈沙坦在0.8～1258.9 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999），線性回歸方程為Y=16 454X+87 154。

2.2.4 加樣回收試驗(yàn) 取處方量空白輔料9份，共分為3組，分別置25 ml量瓶中，每組分別加入纈沙坦對(duì)照品8，10，12 mg，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，用pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，分別作為低、中、高濃度溶液。取低、中、高濃度溶液按 2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明高、中、低3個(gè)濃度平均回收率為100.8 %（n=9），RSD=0.8 %，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（B 公司，批號(hào)：20200502）6份，按2.2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，平均含量為99.4 %，RSD=0.6 %（n=6），表明方法重復(fù)性符合要求。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，纈沙坦峰面積RSD=0.1 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液于進(jìn)樣器內(nèi)室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，10，12 h，按 2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，纈沙坦峰面積RSD為0.1 % ，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

綜上，擬定分析方法滿足定量分析要求。

2.3 濾膜吸附試驗(yàn)

取供試品（B公司，批號(hào)：20200502），按2.2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，5000 r/min離心5 min，取上清，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積；另取供試品（B公司，批號(hào)：20200502），按2.2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，先后經(jīng)0.27 μm Whatman GF/D、0.7 μm GF/F玻璃纖維濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積。結(jié)果表明兩種方式處理的供試品溶液色譜圖中纈沙坦峰面積無(wú)顯著差異，表明濾膜無(wú)吸附。結(jié)果見表1。

表1 濾膜吸附考察結(jié)果

2.4 溶出介質(zhì)的選擇

2.4.1 溶出介質(zhì)的制備 pH 1.2鹽酸溶液：取鹽酸7.65 ml，加水稀釋至1000 ml，搖勻，即得；pH 4.5醋酸鈉緩沖液：取醋酸鈉2.99 g與2 mol/L醋酸溶液14.0 ml，加水稀釋至1000 ml，搖勻，即得；pH 6.8磷酸鹽緩沖液：取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 ml與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液混合后，加水稀釋1000 ml，搖勻，即得；水：純化水。

2.4.2 溶出度測(cè)定 采用流池法開放系統(tǒng)，將纈沙坦片置于錐形部裝滿1 mm玻璃珠的直徑22.6 mm流通池內(nèi)，分別采用pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液、水為溶出介質(zhì)，溫度為 37±0.5 ℃，流速為4 ml/min，收集0～5、5～10、10～15、15～20、20～30、30～45、45～60、60～90 min時(shí)間段的溶出液（溶出液已在線通過(guò)0.7 μm、0.27 μm的玻璃纖維濾膜），取溶出液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累積溶出量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，上述4種溶出介質(zhì)中，纈沙坦片的溶出行為差異較大，溶出量隨溶出介質(zhì)pH值的升高而增加，為典型的pH依賴型藥物；纈沙坦片在以pH 1.2鹽酸溶液為溶出介質(zhì)時(shí)90 min內(nèi)的累積溶出量?jī)H為2.6 %，溶出程度和溶出速率均最小，以水和pH 4.5醋酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)時(shí)，90 min內(nèi)的累積溶出量分別為24.8 %，43.3 %，均未達(dá)溶出平臺(tái)且累積溶出量均小于85 %，溶出程度和溶出速率均較小，而以pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)時(shí)，45 min時(shí)達(dá)到溶出平臺(tái)且累積溶出量為97.9 %，隨著溶出時(shí)間的延長(zhǎng)，溶出速率先不斷增大，后緩慢減小，溶出曲線無(wú)拐點(diǎn)。結(jié)合各國(guó)藥典中纈沙坦片溶出度檢查項(xiàng)均選用pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，故本文選擇pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)。

圖2 不同溶出介質(zhì)的溶出曲線（流速為4 ml/min）

2.5 流池法測(cè)定溶出度的影響因素

2.5.1 溶出介質(zhì)的流速 一般情況下，溶出介質(zhì)的流速對(duì)于藥物的溶出速率的影響是比較明顯的。《中國(guó)藥典》2020年版四部0931溶出度與釋放度測(cè)定法中流池法的標(biāo)準(zhǔn)流速為4，8，16 ml/min[8]，本文以pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，分別考察3種標(biāo)準(zhǔn)流速對(duì)纈沙坦片溶出曲線的影響。結(jié)果見圖3。由圖3可見，隨著流速的提高，溶出速率也會(huì)隨之提高，達(dá)到溶出平臺(tái)時(shí)間減少，其中溶出介質(zhì)流速為4 ml/min時(shí)溶出速率最低，達(dá)到溶出平臺(tái)時(shí)間最長(zhǎng)，溶出介質(zhì)流速為16 ml/min時(shí)較流速為8 ml/min溶出速率略微提高。本文選取溶出介質(zhì)的流速為4 ml/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同流速下的溶出曲線（溶出介質(zhì)為pH 6.8磷酸鹽緩沖液）

2.5.2 流通池內(nèi)徑的影響 標(biāo)準(zhǔn)流通池的內(nèi)徑一般為12 mm和22.6 mm，在流池法試驗(yàn)中小規(guī)格制劑采用小型流通池可提高低濃度取樣分析的靈敏度，且崩解后的顆粒會(huì)均勻地分布在表面[11]。本研究選用了兩種內(nèi)徑的流通池，以pH 6.8緩沖液為溶出介質(zhì)，流速為4 ml/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以全面分析纈沙坦片的溶出情況，結(jié)果見圖4。圖4結(jié)果顯示，在內(nèi)徑12 mm的流通池內(nèi)，纈沙坦片的溶出速率較快，故本文采用內(nèi)徑為22.6 mm流通池進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 不同內(nèi)徑的流通池溶出曲線

2.6 溶出度測(cè)定

分別采用新建立的流池法與《中國(guó)藥典》2020年版纈沙坦片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中溶出度檢查法[12]（槳法，轉(zhuǎn)速50 r/min，溶出介質(zhì)為pH 6.8磷酸鹽緩沖液1000 ml，取樣時(shí)間點(diǎn)為5，10，15，20，30，45，60 min）對(duì)兩家公司的纈沙坦片的溶出度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算累積溶出度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，纈沙坦片在槳法和流池法中溶出曲線有明顯差異，槳法裝置下，累積溶出量在15 min內(nèi)均達(dá)85 %以上，且處于溶出平臺(tái)；流池法測(cè)定的溶出曲線緩慢上升，且溶出曲線無(wú)拐點(diǎn)和突釋，在45 min后處于溶出平臺(tái)，累積溶出量達(dá)85 %以上。

表2 兩家公司的纈沙坦片累積溶出量（槳法和流池法）

2.7 溶出曲線比較

2.7.1 非模型依賴的相似因子法比較 根據(jù)《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》[13]，當(dāng)受試制劑與參比制劑在15 min內(nèi)的累積溶出量不低于85 %，可認(rèn)為兩者溶出行為相似，故采用槳法測(cè)定A、B兩家公司的纈沙坦片的溶出曲線相似；采用非模型依賴相似因子法對(duì)A、B兩家公司的流池法測(cè)得得纈沙坦溶出曲線進(jìn)行相似性評(píng)價(jià)，其相似因子f2值為69（選取前5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積溶出量計(jì)算），非模型依賴相似因子f2值高于50 時(shí)，可認(rèn)為兩條曲線具有相似性，故兩家公司的纈沙坦片溶出曲線相似。

2.7.2 模型依賴的參數(shù)比較 采用DDsolver軟件中的零級(jí)、一級(jí)、Higuchi、Weibull和Peppas-Sahlin模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果零級(jí)、Higuchi和Peppas-Sahlin模型擬合效果不佳（r＜0.99），Weibull和一級(jí)模型擬合效果較好，且 Weibull模型（r＞0.998）擬合效果優(yōu)于一級(jí)模型（r＞0.991），故選定Weibull模型對(duì)流池法測(cè)定的溶出曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到特征溶出參數(shù)T50和Td（藥物溶出50 %和63.2 %所需時(shí)間），結(jié)果見表3。采用SPSS17.0軟件分別對(duì)兩公司樣品的T50和Td進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，兩樣品的溶出參數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 Weibull擬合特征溶出參數(shù)

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

國(guó)內(nèi)外現(xiàn)行藥典均使用UV法測(cè)定纈沙坦片的溶出度，且各國(guó)藥典僅測(cè)定30 min時(shí)的溶出度，溶出液濃度范圍變化小，而采用流池法測(cè)定纈沙坦片溶出度，其溶出液濃度變化范圍大。故本文擬參考《中國(guó)藥典》2020年纈沙坦片含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，根據(jù)實(shí)際測(cè)定情況，建立了纈沙坦片溶出度測(cè)定的HPLC法，該方法經(jīng)方法驗(yàn)證，各項(xiàng)結(jié)果均滿足要求。本方法操作簡(jiǎn)便，可用于纈沙坦片溶出度的測(cè)定。

3.2 溶出介質(zhì)的選擇

根據(jù)《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》推薦的各種不同pH溶出介質(zhì)，結(jié)合國(guó)內(nèi)外現(xiàn)行藥典選用的溶出介質(zhì)，本文選用pH 6.8磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)，與各國(guó)藥典一致。

3.3 溶出介質(zhì)流動(dòng)方式

流池法的樣品池中可加入玻璃珠，一般認(rèn)為不加玻璃珠為湍流，加入玻璃珠為層流[14-16]。謝莉等[17]的研究指出僅以玻璃珠的加入與否來(lái)斷定流體為層流或湍流是不全面的，但加入玻璃珠可降低流體的可變性。本文采用加入玻璃珠方式。

3.4 金屬片夾（V字型）

一般情況下，樣品自由放置或使用金屬片夾（V字型）固定在玻璃床上部的一定位置上[18]。本文采用將樣品自由放置在玻璃珠上。

4 小結(jié)

本文通過(guò)流池法測(cè)定纈沙坦片溶出曲線，分別采用非模型依賴的相似因子（f2）法和Weibull模型評(píng)價(jià)體外溶出曲線。纈沙坦片在溶出初始階段溶出速率較快，即溶出量隨時(shí)間快速增加，隨后溶出速率逐漸減慢，并逐漸進(jìn)入全溶階段。流池法能提供較為溫和的溶出環(huán)境，有助于藥物研發(fā)階段中的處方篩選、工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制；能更好地模擬體內(nèi)壞境，有助于評(píng)估藥物的體內(nèi)溶出和釋放特性。