于 夢，孫 清，王金虎，孫 玲

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點實驗室，山東 濟(jì)南 250101）

作為重要的中間體，吡唑類化合物廣泛用于藥物的合成和研制[1-3]。吡唑類化合物具有抗菌、消炎、抗腫瘤等多種藥理活性[4-7]，已有吡唑類化合物作為藥物上市或進(jìn)入臨床研究，如抗炎藥物塞來昔布、抗菌藥物磺胺苯吡唑，抗高血壓藥物利奧西呱、抗癌藥物蒽吡唑類等[8-10]。合成人員參考相關(guān)文獻(xiàn)以選擇性COX-2抑制劑塞來昔布為模型化合物，設(shè)計合成了多個二芳基取代的吡唑衍生物[11-13]。合成中間體4-磺酰胺基苯肼含遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)，其起始物料磺胺有較大毒性且不易代謝[14-16]，后續(xù)反應(yīng)中會生成有遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)的偶氮化合物。本文建立了采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定二芳基吡唑類衍生物中4-磺酰胺基苯肼和磺胺的含量的方法[17-18]，對兩種雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格控制。雜質(zhì)信息見表1。

表1 兩種雜質(zhì)信息

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UPLC-Q-Exactive Orbitrap液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國Thermo）；XS205DU十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo）；Seven Excllence多參數(shù)測定儀（瑞士Mettler Toledo）。

1.2 試藥

二芳基吡唑類衍生物（自制）；4-磺酰胺基苯肼鹽酸鹽對照品（加拿大Toronto Research Chemicals，批號：1-QL-68-1，純度：98 %）；磺胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100024-201103，純度：99.2 %）；甲醇（色譜純，康科德）；醋酸銨（分析純，國藥集團(tuán)）；醋酸（色譜純，國藥集團(tuán)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil Ph-3苯基柱（100 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相：0.01 mol/L醋酸銨緩沖溶液（pH 4.0）-甲醇，按表2進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.5 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μl；運行設(shè)置：切換閥控制5 min后流出液不再進(jìn)入質(zhì)譜檢測器。

表2 梯度洗脫程序

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：加熱電噴霧離子源（H-ESI）；載氣：氮氣；離子傳輸管溫度：320 ℃；輔助氣加熱溫度：310 ℃；鞘氣壓力：35 psi；S-lens RF水平：50；輔助氣壓力：10 arb；噴霧電壓：3.6 kV；掃描方式：選擇離子監(jiān)測，0～5 min：[M+Na]＋m/z210.0，[M+Na]＋m/z195.0，見圖1。

圖1 4-磺酰胺基苯肼（A）和磺胺（B）質(zhì)譜圖

圖2 4-磺酰胺基苯肼（A）和磺胺（B）HPLC圖譜

2.1.3 溶液的配制 對照品溶液的制備：取4-磺酰氨基苯肼和磺胺雜質(zhì)對照品10 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，用甲醇制成各自儲備液。精密移取各對照品儲備液1 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品儲備液。取混合對照品儲備液適量，用甲醇逐步稀釋制成每1 ml含4-磺酰胺基苯肼5 ng、磺胺5 ng的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備：取二芳基吡唑類衍生物適量，精密稱定，用甲醇溶液溶解并制成每1 ml中含2 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2 驗證結(jié)果

2.2.1 專屬性 取空白溶劑和對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明4-磺酰胺基苯肼的保留時間為2.84 min，磺胺的保留時間為4.37 min，空白溶劑不干擾待測成分的測定。

2.2.2 溶液穩(wěn)定性 取2.1.3項下對照品溶液，放置12 h，分別在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 h進(jìn)樣測定。4-磺酰胺基苯肼峰面積的RSD為5.28 %，磺胺峰面積的RSD為3.39 %，結(jié)果表明對照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 檢測限和定量限 取2.1.3項下對照品溶液，用甲醇逐級稀釋至信噪比（S/N）接近10和3，確定4-磺酰胺基苯肼和磺胺的定量限和檢測限。結(jié)果對磺酰氨基苯肼和磺胺的定量限分別為0.4915 ng/ml和0.5079 ng/ml，對磺酰氨基苯肼和磺胺的檢測限分別為0.1474 ng/ml和0.1524 ng/ml。

2.2.4 線性 取混合對照品儲備液5 ml，置100 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，作為線性儲備液。分別精密移取線性儲備液1，2，4，6 ml置100 ml量瓶中，精密移取線性儲備液1，2，3 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋制成系列濃度的溶液，作為線性樣品溶液。分別量取5 μl注入液質(zhì)聯(lián)用色譜儀，記錄峰面積。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果對磺酰氨基苯肼在0.4915～14.7441 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，磺胺在0.5079～15.2384 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，具體結(jié)果見表3。

2.2.5 回收率試驗 取混合對照品儲備液5 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為回收率儲備液。精密稱取二芳基吡唑類衍生物約20 mg，置10 ml量瓶中，共9份，分為3組，每組分別加入0.1，1，2 ml回收率儲備液，甲醇溶解并稀釋至刻度，即得回收率樣品溶液，另按2.1.3項下方法配制對照品溶液。分別精密量取上述溶液5 μl，注入液質(zhì)聯(lián)用色譜儀，按2.1.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法，以峰面積計算各雜質(zhì)的含量，并計算其回收率，結(jié)果4-磺酰胺基苯肼和磺胺回收率分別為106.96 %和106.71 %，RSD分別為6.03 %和7.94 %，符合要求，具體結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗結(jié)果

2.2.6 精密度試驗

2.2.6.1 儀器精密度 取同一份對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得4-磺酰胺基苯肼和磺胺峰面積的RSD分別為2.55 %和2.03 %，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.6.2 重復(fù)性試驗 精密稱取二芳基吡唑類衍生物約20 mg，置10 ml量瓶中，加回收率儲備液1 ml，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，平行制備6份，作為重復(fù)性樣品溶液。另取2.1.3項下對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算各雜質(zhì)的含量。結(jié)果4-磺酰胺基苯肼含量的RSD為3.64 %（n=6），磺胺含量的RSD為0.69 %（n=6），表明重復(fù)性良好。

2.2.6.3 中間精密度 不同人員配制6份重復(fù)性樣品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算各雜質(zhì)的含量。結(jié)果4-磺酰胺基苯肼含量的RSD為3.90 %（n=12），磺胺含量的RSD為4.78 %（n=12），表明中間精密度良好。

2.2.7 樣品的測定 取二芳基吡唑類衍生物，按2.1.3項下方法制備供試品溶液和對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件，量取對照品溶液和供試品溶液各5 μl，注入液質(zhì)聯(lián)用色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算各供試品溶液中4-磺酰胺基苯肼和磺胺的含量。結(jié)果多批二芳基吡唑類衍生物中4-磺酰胺基苯肼和磺胺均低于定量限。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

二芳基吡唑類衍生物在甲醇中溶解性較好，磺胺和4-磺酰胺基苯肼微溶于甲醇，考慮主成分濃度較大，雜質(zhì)濃度較小，最終確定以甲醇作為溶劑。

3.2 色譜柱的選擇

為了提高雜質(zhì)檢測的靈敏度，本研究選用質(zhì)譜檢測器進(jìn)行檢測。由于較高濃度的樣品溶液可能會對質(zhì)譜檢測器造成污染，建立的色譜方法應(yīng)能實現(xiàn)雜質(zhì)與主成分峰的很好分離，以便于通過切換閥實現(xiàn)主成分峰不進(jìn)入質(zhì)譜檢測器。分析磺胺、4-磺酰胺基苯肼和二芳基吡唑類衍生物結(jié)構(gòu)，前兩者含1個苯環(huán)，后者含2個苯環(huán)，試驗結(jié)果表明對于芳香化合物有特殊選擇性的苯基柱可實現(xiàn)磺胺、4-磺酰胺基苯肼與二芳基吡唑類衍生物的較好分離，因此選用苯基柱進(jìn)行研究。

3.3 流動相的選擇

質(zhì)譜檢測器需使用揮發(fā)性流動相添加劑，為了優(yōu)化峰形，使目標(biāo)物之間、目標(biāo)物與溶劑峰之間能較好分離，經(jīng)過試驗，使用醋酸銨作為流動相添加劑，調(diào)整pH值為4.0，能使磺胺和4-磺酰胺基苯肼實現(xiàn)基線分離。通過調(diào)整有機相比例和梯度洗脫，使二芳基吡唑類衍生物出峰時間在5 min之后，切換閥控制主峰不流入質(zhì)譜，同時確保每次樣品測定時主峰能被完全洗脫不影響下一針樣品檢測。

3.4 限度的確定

本文中二芳基吡唑類衍生物以塞來昔布為模型化合物設(shè)計合成，雜質(zhì)控制限度參考塞來昔布最大日劑量600 mg，按遺傳毒性雜質(zhì)要求進(jìn)行嚴(yán)控。根據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）1.5 μg/d計算，設(shè)定4-磺酰氨基苯肼和磺胺含量均不得過0.00025 %。