李敏敏 張?zhí)m迎 趙翠敏 熊永星 吳倩倩 趙 岑

（聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 聊城 252000）

靈芝Ganoderma lucidum，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌，含有三萜、多糖等多種活性成分。這些活性成分在抗腫瘤、抗癌，以及改善慢性病、提高機(jī)體免疫力等方面均有顯著效果。近年來(lái)，隨著人們生活水平穩(wěn)步提高，保健意識(shí)逐步增強(qiáng)，保健產(chǎn)品的需求量也日益加大。靈芝保健產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

從靈芝子實(shí)體、菌絲體、孢子粉、發(fā)酵液中分離獲得靈芝三萜、多糖，可用于保健品、美白抗衰類(lèi)化妝品等功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。靈芝不同類(lèi)型材料中的三萜、多糖種類(lèi)及含量存在差異，如子實(shí)體中三萜種類(lèi)和含量最豐富，菌絲體中多糖、芝酮三醇、靈芝醇A含量較高。靈芝三萜和多糖提取及分離純化方法的差異會(huì)制約靈芝三萜和多糖的開(kāi)發(fā)利用。因此，筆者分析歸納靈芝三萜、多糖的不同提取及分離純化方法，以期為其開(kāi)發(fā)、利用提供理論指導(dǎo)。

1 靈芝三萜提取及分離純化方法

1.1 靈芝三萜提取方法

三萜類(lèi)化合物廣泛存在，因其具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性而受到廣泛關(guān)注。靈芝三萜多具脂溶特性，不易溶于水。如果只選擇傳統(tǒng)提取方法從靈芝的子實(shí)體以及孢子粉等材料中提取三萜類(lèi)化合物，不僅花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)、三萜得率較低，而且所提取的三萜類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)也會(huì)由于提取方式不同而受到不同程度的破壞。因此，提取工藝需要綜合考慮靈芝三萜的吸附力、蒸汽壓、溶解度以及酶解和超聲空化作用等特性，根據(jù)實(shí)際情況選擇傳統(tǒng)溶劑提取、超聲波輔助、超臨界萃取、微波輔助和微波-超聲波協(xié)同等不同的提取方法[1]。

1.1.1 靈芝子實(shí)體三萜提取方法

彭小芳等[2]基于超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS-MS）定量檢測(cè)法，對(duì)sd-2 靈芝子實(shí)體中三萜類(lèi)化合物熱回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)：提取時(shí)間2.5 h，液（mL）料（g）比14∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取2 次，所得三萜為11.859 1 mg/g。丁霄霄等[3]以靈芝子實(shí)體為原料，用復(fù)合酶提取靈芝總?cè)频墓に嚍槊附馓幚?0 min，溫度50 ℃、pH 5，酶解后的子實(shí)體繼續(xù)用無(wú)水乙醇在80 ℃水浴中回流提取2 h，靈芝總?cè)频牡寐蕿?.29%±0.04%。此方法簡(jiǎn)單、效率高，可以用于提取靈芝總?cè)?，但是試?yàn)只對(duì)復(fù)合酶提取靈芝總?cè)乒に囘M(jìn)行研究，而復(fù)合酶對(duì)靈芝總?cè)瞥煞纸M成是否有影響還有待進(jìn)一步研究。李波等[4]以靈芝子實(shí)體為原料采用傳統(tǒng)醇提法提取三萜，最佳條件為10 倍無(wú)水乙醇，溫度60 ℃，時(shí)間60 min，提取2 次，三萜的提取率為0.76%，在此醇提法的基礎(chǔ)上進(jìn)行超聲輔助，提取率可提高20.5%。馬婧嘉等[5]在超聲波協(xié)同半仿生法的研究中，優(yōu)化提取靈芝子實(shí)體三萜工藝，在乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，液（mL）料（g）比30∶1，提取溫度為60 ℃，超聲時(shí)間30 min 的條件下，靈芝三萜提取率為2.99%，該工藝提取率較高且穩(wěn)定。徐樹(shù)來(lái)等[6]優(yōu)化超高壓輔助提取靈芝三萜的工藝：液（mL）料（g）比20∶1，壓力為350 MPa，保壓時(shí)間7 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，靈芝三萜得率為1.154%。

1.1.2 靈芝菌絲體三萜提取方法

鄭苗欣等[7]以靈芝菌絲體為原料，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，液（mL）料（/g）比為30∶1，提取時(shí)間為30 min，靈芝菌絲體三萜的平均得率達(dá)3.50%。劉奇等[8]通過(guò)正交試驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化超聲輔助提取靈芝菌絲體三萜工藝，得出超聲輔助提取靈芝菌絲體總?cè)普辉囼?yàn)最佳工藝為超聲時(shí)間50 min，超聲功率90 W，pH 8，液（mL）料（g）比40∶1，在此條件下靈芝菌絲體三萜平均提取率為0.76%；超聲輔助提取靈芝菌絲體總?cè)祈憫?yīng)面試驗(yàn)最佳工藝為超聲時(shí)間42 min，超聲功率90 W，pH 8，液（mL）料（g）比30∶1，在此條件下，靈芝菌絲體總?cè)破骄崛÷蕿?.09%。這兩種提取工藝參數(shù)可靠，可為靈芝三萜工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1.1.3 靈芝孢子粉三萜提取方法

孢子粉包括未破壁孢子粉和破壁孢子粉。李康等[9]研究破壁靈芝孢子粉中總?cè)频淖罴烟崛」に嚕瑑?yōu)化提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，液（mL）料（g）比60∶1，在85 ℃條件下回流提取2 h，提取2次，總?cè)频暮靠蛇_(dá)6.45%。崔馨戈等[10]以赤芝、紫芝破壁孢子粉（破壁率≥98%）為原料，采用超聲輔助法優(yōu)化后，赤芝破壁孢子粉超聲提取最優(yōu)方案：提取溶劑為無(wú)水乙醇，液（mL）料（g）比65∶1，提取溫度42 ℃，提取時(shí)間60 min；紫芝破壁孢子粉超聲提取最優(yōu)方案：提取溶劑為無(wú)水乙醇，液（mL）料（g）比50∶1，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間42 min；采用超聲輔助提取赤芝、紫芝孢子粉中的總?cè)疲噍^于傳統(tǒng)的溶劑浸提法和回流提取法，提取時(shí)間縮短且提取率提高，高效省時(shí)，原料利用率高，且不會(huì)因?yàn)樘崛囟忍叨茐挠行С煞郑m用于工業(yè)生產(chǎn)。此外，溫艷艷等[11]研究?jī)?yōu)化CO2超臨界提取破壁靈芝孢子粉中三萜類(lèi)成分工藝，最佳提取工藝：無(wú)水乙醇為提取溶劑，提取溫度為50 ℃，液（mL）料（g）比為20∶1，提取時(shí)間為1.5 h，提取2 次，三萜提取率最高為12.29%；為進(jìn)一步分析靈芝破壁孢子粉在CO2超臨界萃取孢子油前后三萜類(lèi)成分含量差異提供理論依據(jù)和參考。

1.1.4 靈芝發(fā)酵物三萜提取方法

劉海良等[12]利用有機(jī)溶劑萃取法，從樹(shù)舌靈芝發(fā)酵液中的醇溶物、醇沉物提取靈芝酸，得率分別為0.022 mg/g、0.049 mg/g。高文庚等[13]、胡瓊方等[14]分別采用回流法、超聲波輔助法，從靈芝發(fā)酵粉中提取三萜類(lèi)物質(zhì)，其平均得率分別為0.676 0 mg/g、0.612 8 mg/g。

1.2 靈芝三萜分離純化方法

根據(jù)靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)為醇溶性、弱酸性的特性，通常采用色譜法對(duì)其分離純化，包括高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）、高速逆流色譜（High speed counter current chromatography，HSCCC）、大孔吸附樹(shù)脂色譜（Macro-porous resin column chromatography）、柱層析（Column chromatography）、薄層色譜分離純化法（Thin-layer chromatography）等。

高效液相色譜方法精密度高，分離純化度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好。梁銳等[15]采用優(yōu)化后的HPLC純化條件：以乙腈-乙酸水溶液（0.01%）為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm，從靈芝子實(shí)體水提物中分離純化獲得不同的靈芝酸單體。大孔吸附樹(shù)脂色譜法具有高效簡(jiǎn)便、快捷、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)，但不同類(lèi)型的大孔樹(shù)脂分離純化三萜類(lèi)化合物效果，存在較大的差異。錢(qián)竹[16]用大孔吸附樹(shù)脂色譜AB-8 吸附發(fā)酵液中靈芝三萜，在流速為2 mL/min，上樣pH 2 的條件下，吸附并純化獲得靈芝酸8.837 mg/g；祝朋玲等[17]利用HPD-500 型大孔樹(shù)脂吸附靈芝子實(shí)體總?cè)?，在上樣?.0 g/mL（干樣），最大上樣量2 BV，用8.5 BV 的75%乙醇進(jìn)行洗脫時(shí)，靈芝子實(shí)體總?cè)萍兌冗_(dá)60.59%。

由此可見(jiàn)，應(yīng)根據(jù)具體需求選擇適合的大孔樹(shù)脂類(lèi)型。HSCCC 法可以在乙醇、石油醚提取的靈芝三萜粗提液中，純化分離出靈芝酸S、T、B，并且將HSCCC 與大孔吸附樹(shù)脂HZ-816 結(jié)合使用，可分離得到高純度的靈芝酸F、C1、A、C2。半制備HPLC 和薄層、硅膠柱層析法，可以用于分離純化靈芝菌絲體中的靈芝酸Mc、TMk、Mf、S、R等靈芝酸單體。

2 靈芝多糖提取及分離純化方法

2.1 靈芝多糖提取方法

靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一，具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血脂與抗衰老等作用。靈芝多糖大多為雜多糖，雖不易溶于有機(jī)溶劑，但易溶于水。提取靈芝多糖的方式除了傳統(tǒng)的熱水和稀酸堿提取法外，還有微波、超聲波、微波輔助超聲波和超聲波輔助堿提法等。采用不同提取方法提取多糖的得率及理化表征均不同，其分子量、單糖的化學(xué)及物理結(jié)構(gòu)改變，會(huì)影響其抗氧化活性等特性。因而選擇靈芝多糖的提取方法，應(yīng)綜合考慮該方法所提取的多糖產(chǎn)量及活性等是否滿(mǎn)足要求。

2.1.1 靈芝子實(shí)體多糖提取方法

靈芝子實(shí)體多糖存在于細(xì)胞內(nèi)，采用傳統(tǒng)的浸提方式提取靈芝多糖難度較大。李波等[4]采用超聲波輔助提取的方法，將靈芝多糖的提取率提高13.2%。王鋒等[18]采用優(yōu)化后的超聲輔助堿提取工藝：超聲功率為105 W，超聲時(shí)間為20 min，水浴提取溫度為100 ℃，水浴時(shí)間為80 min，液（mL）料（g）比為40∶1，靈芝子實(shí)體中多糖提取率為傳統(tǒng)水提法的三倍左右，多糖提取率為67.8 mg/g。孫小梅[19]綜合考慮水浴回流法、加速溶劑萃取法、超聲波輔助法以及微波輔助提取法的多糖得率、對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞性、實(shí)際應(yīng)用性等因素，最終選擇采用超聲波輔助法提取靈芝子實(shí)體多糖，并構(gòu)建其指紋圖譜。此外，張倩倩[20]研究表明，靈芝子實(shí)體菌蓋、菌肉、菌管、菌柄，以及孢子粉（破壁和未破壁）多糖的含量有差異，破壁孢子粉的多糖含量較高，子實(shí)體組織中菌柄的多糖含量較高。

2.1.2 靈芝菌絲體及孢子粉多糖提取方法

靈芝菌絲體生長(zhǎng)較快，生產(chǎn)周期短，可用于集約化提取多糖。楊光成等[21]利用I2-DMSO 溶液去除菌絲體從培養(yǎng)基中夾帶的糖類(lèi)物質(zhì)，并用標(biāo)準(zhǔn)菌絲體進(jìn)行校正，保證菌絲體中多糖的準(zhǔn)確測(cè)定。訾鴻威[22]采用超高壓技術(shù)同時(shí)進(jìn)行靈芝孢子破壁與多糖的提取，提取劑在靈芝孢子細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)快速破裂的同時(shí)，將多糖帶出胞外，在壓力360 MPa，液（mL）料（g）比為25∶1，保壓時(shí)間為4.5 min時(shí)，靈芝多糖得率為2.79%。

2.2 靈芝多糖的分離純化方法

靈芝多糖分離純化方法有乙醇分級(jí)沉淀法、超濾膜分離法、離子交換層析法、凝膠層析法（分子篩層析法）等。李康強(qiáng)等[23]以分級(jí)醇沉方法從靈芝子實(shí)體水提物中分離出80%以上的靈芝多糖。

靈芝多糖結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜，多糖結(jié)構(gòu)會(huì)因?yàn)殪`芝多糖原料以及純化方法的不同，而導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的差異。劉艷芳等[24]采用乙醇沉淀和柱層析方法，分別從靈芝子實(shí)體、孢子粉中分離純化獲得免疫調(diào)節(jié)活性存在差異的β-葡聚糖。為了分離純化出靈芝胞外多糖，在實(shí)際操作過(guò)程中往往會(huì)綜合利用多種分離純化方法。李平作等[25]利用蛋白酶法和Sevage法結(jié)合除去雜蛋白，然后經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠過(guò)濾色譜和DEAE-纖維柱層析，多糖回收率達(dá)78.2%。超濾膜分離法可以利用不同孔徑的濾膜按照多糖分子質(zhì)量初步分級(jí)，但分級(jí)精度不夠高。楊祖金等[26]采用超濾膜分離法分離得到分子量6000 Da 的靈芝多糖，純度為73.5%。

3 展望

靈芝是極具藥用價(jià)值的真菌，其三萜、多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域和保健食品的開(kāi)發(fā)有很大應(yīng)用潛力。

靈芝三萜、多糖的提取，以及分離、純化流程優(yōu)化，多種方法聯(lián)合提高靈芝三萜、多糖的提取率，降低生產(chǎn)成本，仍是現(xiàn)階段研究的難點(diǎn)，也是未來(lái)的研究方向。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)靈芝三萜、多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性、作用機(jī)理、醫(yī)療保健開(kāi)發(fā)等的研究。