曹曉蓉，林倩楠，王慧艷*，佘廣彤，周文柏，夏丹丹

1南京醫(yī)科大學常州醫(yī)學中心，常州市婦幼保健院產科，2實驗室，江蘇 常州 213016

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）指妊娠前糖代謝正常，妊娠期出現的糖尿?。?］。隨著我國經濟條件改善，超重肥胖等健康問題日益普遍，GDM 患病率持續(xù)上升。研究表明氧化應激、慢性炎癥反應、脂質代謝異常、胰島素抵抗及一些胎盤因素都參與了GDM 的發(fā)生發(fā)展［2］。GDM 的發(fā)病機制復雜，研究發(fā)現妊娠早期鐵蛋白水平高的女性罹患GDM的風險升高21%［3］，血清鐵含量的增加可以引起鐵死亡和異常脂質過氧化［4］。鐵死亡是一種由鐵依賴性脂質過氧化導致的新型程序性細胞死亡［5］，可能與GDM相關。本研究使用透射電鏡觀察胎盤滋養(yǎng)細胞超微結構，檢測正常胎盤和不同病情程度的GDM胎盤鐵死亡相關標志物，比較各組鐵死亡發(fā)生的程度，探討鐵死亡在GDM發(fā)生發(fā)展中的作用及用藥對鐵死亡可能產生的影響。

1 對象和方法

1.1 對象

選取2020年9月—2022年12月在常州市婦幼保健院定期產檢并分娩的單胎GDM孕婦為研究對象，年齡22～39 歲，納入標準：①常州市常住居民；②從事輕體力勞動；③在孕24～28 周行75 g 葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）陽性；④孕婦及家屬簽署知情同意書。75 g OGTT 正常標準：空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）及服糖后1 h血糖（1-hour postprandial glucose，1hPG）、2 h 血糖（2-hour postprandial glucose，2hPG）分別低于5.1、10.0、8.5 mmol/L，任何一時間點血糖值達到或超過上述標準，同時FBG<7.0 mmol/L、2hPG<11.1 mmol/L即診斷為GDM。排除標準：①孕前有糖尿病、高血壓病史；②圍產期合并其他并發(fā)癥者，如子癇前期、妊娠合并膽汁淤積癥、妊娠合并傳染性疾病、胎膜早破、羊水糞染中轉剖宮產、產后宮腔感染等。對診斷為GDM 的研究對象，首先給予飲食控制，監(jiān)測血糖，觀察2～4 周。血糖控制良好的標準是FBG<5.3 mmol/L，餐后1hPG<7.8 mmol/L，餐后2hPG<6.7 mmol/L。若飲食控制血糖未能達標，根據孕婦自愿原則給予二甲雙胍或胰島素控制血糖。其中，30例飲食指導后血糖控制良好者納入G1組，30例二甲雙胍治療者納入G2組，30例胰島素治療者納入G3 組，30 例血糖控制不佳拒絕用藥者納入G4組，按年齡、孕產次匹配30例正常孕婦為正常對照組（N組）。本研究獲得常州市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會的批準（CZFY2022046）。

1.2 方法

1.2.1 GDM治療方案

孕婦診斷為GDM后，轉至營養(yǎng)門診由營養(yǎng)師進行個體化飲食指導，根據孕婦的身高、體重、孕周、體力勞動強度計算每天的總能量。輕體力勞動者孕中晚期總能量=理想體重×30 kcal/（kg·d）+200 kcal，碳水化合物的推薦攝入量為33%～40%，蛋白質20%及脂肪40%，以滿足胎兒營養(yǎng)需要。飲食控制3 d后監(jiān)測并記錄空腹及餐后血糖，每周復診1 次，調整飲食方案至血糖控制滿意，督促孕婦孕期定期隨訪，按配餐進食。飲食治療血糖控制不佳者，自愿口服二甲雙胍治療需排除使用二甲雙胍的禁忌證（肝腎功能損傷、感染風險），其起始劑量每日500 mg，連用1 周后無明顯不適，可根據血糖調整用量為500 mg/次，每日2次，或500 mg/次，每日3次，2 周內據血糖情況調整，每日最大劑量不超過2 500～3 000 mg［6］。其中，二甲雙胍治療效果不佳需聯(lián)用胰島素者予以剔除。選用胰島素治療組予超短效胰島素餐前皮下注射，必要時聯(lián)合長效胰島素睡前注射，初始劑量0.3～0.8 U/（kg·d），根據孕期病情進展及血糖情況及時調整。

1.2.2 主要試劑

2.5 %戊二醛固定液購自福州飛凈生物科技公司，普魯士藍染色試劑購自索萊寶公司，長鏈脂酰輔酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗體購自美國Abcam公司，內參GAPDH 抗體購自上海碧云天生物技術公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2.3 樣本采集

新鮮胎盤分娩后，3 min 內避開出血、鈣化等區(qū)域，盡快在胎盤母體面用無菌剪切出厚度適中的胎盤組織5 片（約2 cm×2 cm×2 cm），無菌鹽水沖洗干凈。2 片置于10%福爾馬林溶液固定后，石蠟包埋。2片浸于RNAlater 保存液置于EP管中，編號后凍存于-80 ℃冰箱。將最后1 片分成1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織，新鮮置入預冷2.5%戊二醛固定液中，4 ℃冰箱避光儲存。

1.2.4 透射電鏡觀察胎盤滋養(yǎng)細胞

新鮮胎盤置入2.5%戊二醛固定液浸泡，1%鋨酸室溫固定2 h，乙醇梯度脫水，每次15 min。100%丙酮置換3 次，樹脂包埋固化、切片，3%醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，漂洗后在透射電鏡下觀察和拍攝細胞形態(tài)。

1.2.5 普魯士藍染色

石蠟切片按常規(guī)方法烘烤、脫蠟和水化，然后普魯士藍入染色工作液浸染30 min。水洗后入核固紅染色液，染細胞核5 min 后水洗。然后常規(guī)方法乙醇脫水、二甲苯透明、封片，最后中性樹膠固封，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 免疫組化

將切片常規(guī)脫蠟、水化、高溫修復，用1%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶。ACSL4、GPX4抗體（1∶500）滴入切片后4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液洗滌，結合二抗，滴加SABC 溶液孵育顯色，顯微鏡下觀察見棕褐色顆粒視為顯色完成，放入水中停止顯色，脫水封片。

1.2.7 Western blot

提取每組胎盤組織中的蛋白質，使用BCA蛋白定量試劑盒測量蛋白質濃度。通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉，加入ACSL4抗體（1∶1 000）和GPX4抗體（1∶1 000），以GAPDH為內參，4 ℃孵育過夜。使用TBST 緩沖液沖洗3 次，每次5 min。隨后加入相應二抗孵育1 h，洗膜后顯色，應用Bio-Rad Gel Doc EZ 凝膠成像系統(tǒng)和Image J 軟件分析目標條帶的灰度值。

1.2.8 qRT-PCR

應用TRizol 試劑盒提取胎盤組織中的總RNA，通過紫外分光光度計測定RNA 的濃度和純度。通過熒光定量PCR 系統(tǒng)和SYBR Green 試劑盒進行qRT-PCR。引物序列如下：ACSL4，上 游5′-ATACCTGGACTGGGACCGAA-3′，下游5′-TGCTGGACTGGTCAGAGAGT-3′。GPX4，上游5′-CAGTGAGGCAAGACCGAAGT-3′，下游5′-CCGAACTGGTTACACGGGAA-3′。反應條件如下：95 ℃預變性10 min，95 ℃10 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，45 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。GAPDH 作為內參基因。通過2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用統(tǒng)計軟件SPSS 27.0 進行數據分析。計量資料均用均數±標準差（）表示。樣本均數比較采用One-way ANOVA檢驗，組間比較方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及妊娠結局比較

比較5組孕婦的年齡、孕周、孕次、產次，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。G1、G2、G3組孕前體重指數（body mass index，BMI）高于N組（P<0.05），G3組孕前BMI 高于G1 組（P<0.05），G2、G3 組孕前BMI高于G4 組（P<0.05）。N 組、G1 組新生兒體重低于G4組（P<0.05），5組均未發(fā)生新生兒窒息（表1）。

表1 5組孕婦臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data of pregnant women in five groups（）

表1 5組孕婦臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data of pregnant women in five groups（）

Compared with N group，*P<0.05；compared with G1 group，#P<0.05；compared with G3 group，▽P<0.05；compared with G4 group，△P<0.05.a：Welch method.

2.2 胎盤滋養(yǎng)細胞超微結構

電鏡下，N 組胎盤滋養(yǎng)細胞線粒體結構基本正常，未見明顯線粒體皺縮及嵴斷裂，而G1、G2、G3、G4組GDM胎盤滋養(yǎng)細胞中線粒體萎縮、變小，膜密度增加，線粒體變圓，嵴加深，其中G4組最為嚴重，高度符合鐵死亡細胞的特征。而飲食治療的G1 組線粒體改變程度最輕，其次是口服二甲雙胍治療的G2組（圖1）。

圖1 TEM下5組胎盤超微結構圖Figure 1 Ultrastructure of placenta in five groups under TEM

2.3 胎盤普魯士藍染色結果

使用普魯士藍染色，鐵被染成藍色，細胞質呈淺粉色，核被染為紅色。5 組胎盤中均可見含鐵顆粒，與N組比較，G1、G2、G3、G4組GDM胎盤中含鐵顆粒明顯增多，與G4 組比較，G1、G2、G3 組胎盤中的含鐵顆粒明顯減少（圖2）。

圖2 5組胎盤普魯士藍染色（×200）Figure 2 Prussian blue stain in placenta of five groups（×200）

2.4 胎盤滋養(yǎng)細胞免疫組化結果

ACSL4、GPX4主要在合體滋養(yǎng)細胞細胞質中表達。ACSL4 在N 組呈陰性（-），在G1 組呈弱陽性（+），在G2、G3、G4組呈強陽性（+++）。GPX4在G1、G2、G3、G4組呈弱陽性（+），在N組呈中度陽性（++）（圖3）。

圖3 5組胎盤ACSL4、GPX4免疫組化表達（×100）Figure 3 Expression of ACSL4 and GPX4 in placenta of five groups by immunohistochemistry（×100）

2.5 胎盤Western blot結果

G1、G2、G3、G4 組ACSL4 表達高于N 組，G1、G2、G3、G4 組GPX4 表達低于N 組（P<0.05，圖4）。

圖4 5組胎盤ACSL4、GPX4蛋白表達水平Figure 4 Expression of ACSL4 and GPX4 in placenta of five groups

2.6 胎盤qRT-PCR結果

組間ACSL4 mRNA表達量無顯著性差異（P>0.05，圖5A），G1、G2、G3、G4 組GPX4 mRNA 表達量低于N組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖5B）。

圖5 5組胎盤ACSL4、GPX4轉錄水平Figure 5 mRNA level of ACSL4 and GPX4 in placenta of five groups

3 討論

3.1 GDM胎盤滋養(yǎng)細胞鐵死亡形態(tài)學的特征性改變

鐵死亡作為區(qū)別于自噬、凋亡的新型細胞死亡方式，有其獨特的形態(tài)學特征。鐵死亡細胞的形態(tài)學特征主要表現為細胞膜斷裂和出泡，線粒體萎縮、膜密度增加、細胞核形態(tài)正常，無染色體凝集［7］。本研究觀察胎盤滋養(yǎng)細胞透射電鏡下的微觀結構，發(fā)現4 組GDM 胎盤滋養(yǎng)細胞中均有不同程度的鐵死亡現象，其中血糖控制不佳病情最重的G4組鐵死亡線粒體改變最明顯，而G1、G2、G3 組線粒體改變較輕。

同時，考慮到鐵死亡的作用機制與鐵負荷過重密切相關，本研究用普魯士藍檢測胎盤組織中存在的鐵。正常胎盤中含鐵顆粒極少，其次是血糖控制滿意的G1、G2、G3組，血糖控制不佳的G4組含鐵顆粒最多。以上結果提示GDM 患者胎盤滋養(yǎng)細胞中存在鐵死亡，鐵死亡與患者的治療用藥及病情嚴重程度相關，使用二甲雙胍和胰島素治療均可改善胎盤滋養(yǎng)細胞鐵死亡。

3.2 GDM胎盤鐵死亡相關基因ACSL4、GPX4的表達

鐵死亡調控機制復雜，可大致分為3 類：第1 類涉及鐵代謝，包括核受體共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）對鐵蛋白降解的調控，以及影響鐵的核因子紅細胞2相關因子-血紅素加氧酶1（nuclear factor erythroid-2-related factor 2-heme oxygenase 1，Nrf2-HO-1）途徑［8］，例如緩解糖尿病心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)生的鐵死亡可通過抑制NCOA4 的表達實現［9］；第2 類是抗氧化系統(tǒng)谷胱甘肽（glutathione，GSH）/GPX4 途徑［10］，包括胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白途徑、轉硫途徑、甲羥戊酸途徑、谷氨酰胺途徑和p53途徑，Wang等［11］發(fā)現硫化鈉可增加GPX4 表達，抑制糖尿病小鼠前額葉皮質層細胞發(fā)生鐵死亡；第3類涉及脂質代謝，如ACSL4調控通路及鐵死亡抑制蛋白1-輔酶Q10 通路［12］，其通過減少磷脂過氧化從而抑制鐵死亡的發(fā)生。

抑制基因GPX4和促進基因ACSL4是鐵死亡經典的兩大標志物，兩者分別通過不同途徑參與鐵死亡的調控。GPX4 通過還原脂質過氧化物抑制鐵死亡，其失活可導致活性氧和脂質過氧化物在β細胞中積累最終發(fā)生鐵死亡［13］。而脂肪酸代謝酶ACSL4則通過催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）轉化成乙酰輔酶A，形成易被氧化的膜磷脂促進鐵死亡［14］。本研究中，免疫組化及Western blot檢測發(fā)現GPX4在4組GDM胎盤上的表達均低于正常組，ACSL4 在4 組GDM 胎盤上的表達均高于正常組。qRT-PCR 結果雖提示ACSL4 及GPX4 的mRNA表達量組間無顯著差異，但GPX4 表達趨勢與前結果一致。因此，GDM 胎盤鐵死亡與GPX4 下調和ACSL4上調相關。

3.3 病情和用藥對GDM患者胎盤鐵死亡的影響

在透射電鏡下，血糖控制滿意的G1、G2、G3 組線粒體形態(tài)相較血糖控制不滿意的G4組明顯改善，提示病情和用藥與GDM 胎盤滋養(yǎng)細胞鐵死亡相關。其中，病情輕、通過飲食治療血糖控制滿意的G1組線粒體萎縮不明顯，二甲雙胍治療者其次。二甲雙胍主要的降糖機制是通過一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）途徑抑制肝糖異生和糖原分解，促進外周組織對葡萄糖的攝取和利用，增加對胰島素的敏感性［15］。

本研究GDM 分組中，G2、G3 組是在孕婦飲食治療效果不佳的情況下，按自愿原則給予孕婦二甲雙胍或胰島素治療，其中二甲雙胍治療效果不佳者已剔除出組，故用藥前G2 和G3 組孕婦病情相近。電鏡結果提示二甲雙胍改善胎盤滋養(yǎng)細胞中鐵死亡的作用可能更佳。已有研究在構建多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）小鼠模型并給予二甲雙胍治療的過程中，發(fā)現二甲雙胍治療可以增加PCOS 小鼠卵巢中GPX4 表達，從而逆轉鐵死亡過程［16］。Zhao 等［17］發(fā)現二甲雙胍可通過AMPK 通路抑制鐵死亡發(fā)生，減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展，這也間接提示了當二甲雙胍通過AMPK 途徑發(fā)揮降糖作用時，可能抑制了鐵死亡的發(fā)生。本研究電鏡結果也提示二甲雙胍可以減輕鐵死亡。在二甲雙胍治療的G2 組胎盤上，GPX4 的蛋白表達顯著高于病情重的G4 組，但2 組中ACSL4 的蛋白表達無顯著差異，提示二甲雙胍可能通過GPX4相關通路促進了GPX4 的表達，從而發(fā)揮抑制鐵死亡的作用。2015 年起國際婦產科聯(lián)盟（Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO）將二甲雙胍作為GDM 的一線治療用藥［18］，2022 年妊娠期高血糖診治指南認為目前尚未發(fā)現二甲雙胍對子代有明確不良作用［19］，孕婦無法使用胰島素時，推薦使用二甲雙胍控糖。二甲雙胍作用機制廣泛，本實驗從改善鐵死亡方面體現了二甲雙胍治療的優(yōu)勢。

目前，國內外針對鐵死亡與GDM機制的研究主要圍繞細胞或動物模型展開［20］。本研究收集GDM孕婦的胎盤以初步探究鐵死亡對GDM的影響，這是本文的創(chuàng)新之處。本研究亦有不足之處，鐵死亡與GDM 之間的調節(jié)機制尚不能明確，GDM 孕婦不同孕期鐵代謝水平不同［21］，鐵死亡可能通過影響細胞內鐵含量水平和氧化應激水平，參與了GDM 的發(fā)病過程。因實驗條件限制，本研究缺少胎盤氧化應激水平的輔證，且樣本例數偏少，需加大樣本量，結合細胞及動物模型，進一步梳理鐵死亡在GDM中可能的分子機制及二甲雙胍對鐵死亡的調控作用，為未來GDM的治療提供新思路。

綜上所述，本研究在GDM孕婦胎盤滋養(yǎng)細胞中觀察到了鐵死亡現象，與病情嚴重程度及用藥相關。GDM孕婦胎盤中ACSL4、GPX4表達異常，二甲雙胍可能通過GPX4通路抑制鐵死亡。