劉思哲，安萬花，郭淑利，王慧睿，肖蓬莉，王萬里，王雙琳

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.洛陽市中心醫(yī)院血液科,河南 洛陽 471009)

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)作為成人最常見的侵襲性非霍奇金淋巴瘤,在臨床表現(xiàn)、生物學特征及臨床預(yù)后方面具有高度異質(zhì)性[1-2]。近年來,隨著聯(lián)合化學治療及生物靶向治療的應(yīng)用,多數(shù)患者可獲得完全緩解[3];但仍有部分患者出現(xiàn)難治或復發(fā),而難治或復發(fā)是導致患者死亡的主要原因[4]。目前,臨床常用國際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index,IPI)、經(jīng)年齡調(diào)整的IPI來評估預(yù)后和復發(fā)風險[5],但該指標僅結(jié)合了多項臨床因素,而未考慮分子生物學方面的異質(zhì)性,因而其評估價值有限[6]。因此,深入研究DLBCL的發(fā)病機制,探討新的分子標志物對于DLBCL的精準治療和預(yù)后評估具有重要的臨床意義。鋅指蛋白382(zinc finger protein 382,ZNF382)是KRAB型鋅指蛋白(krüppel-associated box domain-zinc finger protein,KRAB-ZNF)家族的成員之一,定位于19p13.12,編碼相對分子質(zhì)量64 000的鋅指蛋白。有研究報道,多種腫瘤的發(fā)病過程中均存在ZNF382基因表達異常,該基因可能是一個潛在的新型抑癌基因[7];然而,國內(nèi)關(guān)于ZNF382在DLBCL中的表達情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系報道較少?；诖?本研究旨在觀察ZNF382在DLBCL組織樣本中的表達,分析其與DLBCL 臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,探討其對DLBCL 預(yù)后評估的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年1月至2018年12月洛陽市中心醫(yī)院血液科收治的57例DLBCL患者為研究對象。其中男29例,女28例;年齡30～88歲;原發(fā)部位在淋巴結(jié)外23例(40.40%),伴B癥狀(發(fā)熱、盜汗、體質(zhì)量減輕)23例(40.40%),伴骨髓浸潤(形態(tài)學下骨髓中原始+幼稚淋巴細胞≥5%[8])19例(33.30%),伴巨大包塊(瘤灶直徑≥10 cm)10例(17.50%),乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平升高(參考值109～245 U·L-1)41例(71.90%),β2微球蛋白(β2-microglobin,β2-MG)水平升高(參考值1～3 mg·L-1)35例(61.40%),美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)體能狀況評分≥2分者21例(36.80%),Ann Arbor分期為Ⅲ～Ⅳ期者34例(59.60%),IPI評分≥3分者32例(56.10%),Ki67指數(shù)>70%者22例(38.60%);Hans分型:生發(fā)中心B細胞樣淋巴癌(germinal center B-cell-like lymphoma,GCB) 20例(35.10%),非生發(fā)中心B細胞樣淋巴癌(non-germinal center B-cell-like lymphoma,non-GCB) 37例(64.90%)。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準,患者和(或)家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 治療及預(yù)后評估

57例DLBCL患者中38例行聯(lián)合利妥昔單抗化學治療,其余19例患者化學治療方案中不含利妥昔單抗,化學治療療程6(1～12)個;3例患者行自體造血干細胞移植,1例患者行嵌合抗原受體T細胞治療。完成2～4個療程誘導化學治療后,根據(jù)2013年版《中國彌漫大B細胞淋巴瘤診斷與治療指南》評估治療效果[9],分為完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response,PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease,SD)和疾病進展(progressive disease,PD),CR和PR為有效,SD和PD為無效。依據(jù)患者治療后的生存時間評估長期療效。

1.3 En vision二步法檢測DLBCL 組織和反應(yīng)性增生淋巴組織中ZNF382表達

二步法免疫組織化學檢測試劑盒購自武漢Elabscience公司。取57例DLBCL 患者的腫瘤組織石蠟標本切片和洛陽市中心醫(yī)院病理科保存的20例反應(yīng)性增生淋巴組織石蠟標本切片,將石蠟切片放入65 ℃烤箱內(nèi)40 min,經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇水化、磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline,PBS)漂洗后,置于配制好的抗原修復液(0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖溶液,pH 6.0)中,使用高壓鍋加熱25 min后自然冷卻,PBS沖洗3次;應(yīng)用體積分數(shù)3%過氧化氫室溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS充分沖洗3次;滴加體積分數(shù)5%即用型正常山羊血清,室溫封閉30 min,PBS充分沖洗3次;滴加兔抗人ZNF382多克隆抗體(滴度為180,購自美國Sigma-Aldrich公司),4 ℃孵育過夜,次日復溫(37 ℃水浴鍋復溫5～10 min)后,滴加聚合物輔助劑室溫孵育20 min,PBS充分沖洗3次;滴加羊抗兔IgG二抗,室溫孵育60 min,PBS充分沖洗3次;然后用二氨基聯(lián)苯胺顯色液覆蓋組織1 min,顯微鏡下觀察顯色后用蒸餾水清洗終止顯色,蘇木精染色法復染細胞核,鹽酸乙醇分化、氨水返藍,最后使用中性樹膠封片。常規(guī)PBS代替一抗作為陰性對照,使用小鼠心臟組織切片作為陽性對照。每張免疫組織化學切片在顯微鏡下放大400倍后隨機取8個視野,應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件進行圖像分析,計算切片中各視野陽性點總面積及累積吸光度值,以半定量法計算平均光密度(optical density,OD)值,以O(shè)D值表示ZNF382表達水平,OD值越大代表ZNF382表達水平越高[10]。

1.4 隨訪

對57例DLBCL患者進行生存隨訪,隨訪方式包括門診隨訪和電話隨訪,截至2020年4月30日。無事件生存(event-free survival,EFS)期為主要終點指標。EFS為確診到發(fā)生事件(死亡、首次PD、首次復發(fā)、首次更換二線治療方案)或末次隨訪之間的時間。若患者在末次隨訪時仍然存活且未發(fā)生過PD、復發(fā)、更換方案等事件,則計為刪失值。

1.5 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk方法,不符合正態(tài)分布的連續(xù)變量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))表示,2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗;采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線;對可能影響EFS的預(yù)后因素采用log-rank 法行單因素分析,并對其中P<0.05的因素行Cox比例風險模型多因素分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL腫瘤組織與反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織中ZNF382表達水平比較

ZNF382主要定位于細胞質(zhì)中,偶見細胞核中,腫瘤旁間質(zhì)無表達,反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織中ZNF382表達顯著多于DLBCL組織(圖1)。DLBCL組織中ZNF382表達水平為0.021 1(0.006 9,0.060 9),反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織中ZNF382表達水平為0.123 6(0.084 2,0.188 9)(OD值);DLBCL組織中ZNF382表達水平顯著低于反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織,差異有統(tǒng)計學意義(Z=-5.056,P<0.01)。

A:反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織中ZNF382表達(×200);B:DLBCL組織中ZNF382蛋白表達(×200);C:反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織中ZNF382表達(×400);D:DLBCL組織中ZNF382蛋白表達(×400)。

2.2 ZNF382表達水平與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系

ZNF382表達水平與DLBCL患者的IPI評分、Ann Arbor分期、Hans分型、B癥狀、骨髓浸潤、巨大包塊相關(guān)(P<0.05);ZNF382表達水平與DLBCL患者的性別、年齡、原發(fā)部位、ECOG評分、β2-MG、血清LDH、Ki67、是否聯(lián)合妥昔單抗化學治療無關(guān)(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 不同臨床病理特征DLBCL患者腫瘤組織中ZNF382表達水平比較Tab.1 Comparison of ZNF382 expression levels in tumor tissues of DLBCL patients with different clinical and pathological characteristics

2.3 治療有效與治療無效DLBCL患者腫瘤組織中ZNF382表達水平比較

57例患者中治療有效者36例(63.20%),無效者21例(36.80%)。治療有效患者和治療無效患者腫瘤組織中ZNF382表達水平分別為0.031 2(0.017 8,0.074 3)、0.007 1(0.003 5,0.031 4);治療有效患者腫瘤組織中ZNF382表達水平顯著高于治療無效患者,差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.895,P<0.01)。

2.4 ZNF382表達對DLBCL患者預(yù)后的影響

57例患者中有54例完成生存隨訪,3例失訪,失訪率為5.26%,中位隨訪時間為26(6～63)個月。在隨訪時間內(nèi),共觀察到31例事件,包括15例PD、4例復發(fā)、9例更換二線治療方案以及3例因腫瘤及其治療相關(guān)的死亡。以O(shè)D值的P50(第50位百分位數(shù))為截斷值,將DLBCL患者分為ZNF382高表達組(OD值>0.021 1)和低表達組(OD值≤0.021 1)。生存分析結(jié)果顯示,ZNF382高表達組和ZNF382低表達組患者的2 a EFS率分別為59.4%[95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)38.0%～80.8%]、18.3%(95%CI:2.4%～34.2%);ZNF382高表達組患者2 a EFS率顯著高于ZNF382低表達組,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=17.955,P<0.001);結(jié)果見圖2。

圖2 ZNF382高表達組和低表達組DLBCL患者的無事件生存曲線Fig.2 Event free survival curves of DLBCL patients in the ZNF382 high expression group and ZNF382 low expression group

2.5 DLBCL患者預(yù)后影響因素的單因素、多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示,女性、淋巴結(jié)內(nèi)原發(fā)、有B癥狀、有骨髓浸潤、有巨大包塊、IPI評分≥3分、β2-MG升高、Ki67>70%、non-GCB型、Ann Arbor分期 Ⅲ～Ⅳ期、ZNF382低表達是影響DLBCL患者預(yù)后的危險因素[風險比(hazard ratio,HR)=2.134、2.184、2.664、3.301、4.112、2.425、2.383、2.199、5.231、0.291,P<0.05];多因素分析結(jié)果顯示,淋巴結(jié)內(nèi)原發(fā)、Ann Arbor分期 Ⅲ～Ⅳ期、ZNF382低表達是DLBCL患者預(yù)后不良(疾病進展、死亡)的獨立危險因素(HR=6.248、7.253、0.208,P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 DLBCL患者預(yù)后影響因素的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis on influencing factor of prognosis of DLBCL patients

3 討論

DLBCL的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多基因、多因素、多階段的病理過程。在標準的CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素類、長春新堿和潑尼松)方案上加入利妥昔單抗后可使患者的總生存率提高10%～15%[11];多數(shù)DLBCL患者經(jīng)CHOP聯(lián)合利妥昔單抗治療后預(yù)后良好,但仍有部分患者會出現(xiàn)病情進展或復發(fā)[12-13]。有研究指出,腫瘤細胞高增殖性及侵襲性是影響患者治療效果及導致復發(fā)的主要因素[14]。因此,深入研究DLBCL的發(fā)病機制,探討新的分子標志物對于DLBCL的精準治療和預(yù)后評估具有重要的臨床意義。KRAB-ZFP最早于1983年在爪蟾卵母細胞的轉(zhuǎn)錄因子ⅢA中被發(fā)現(xiàn),是機體最常見的一類轉(zhuǎn)錄因子[15];KRAB-ZFP參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控人類約2%的基因,有近800個成員[16-18]。ZNF382是KRAB-ZFP家族成員,由典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域和Krüppel相關(guān)盒結(jié)構(gòu)域組成[19],通過C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域的定位和KRAB結(jié)構(gòu)域的抑制,ZNF382可作用于核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和激活子蛋白-1信號通路,從而對NF-κB信號通路上游因子信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducer and activator of transcription,STAT) 3、STAT5B、分化抑制因子1和NF-κB抑制蛋白E抗體等多種癌基因的表達起到負性調(diào)控作用[20]。既往研究顯示,ZNF382參與細胞增殖、分化、侵襲、凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)化等諸多進程[21-23],在胃癌、食管鱗狀細胞癌、肝癌等多種實體瘤中表達下調(diào)或沉默[23-25]。為此,本研究選擇臨床確診為DLBCL患者的淋巴結(jié)病理組織樣本,并以反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織作為對照,觀察ZNF382在DLBCL中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示,DLBCL組織中ZNF382表達水平顯著低于反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織,說明ZNF382在DLBCL患者的腫瘤組織中呈低表達,ZNF382在DLBCL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定作用,這與該基因在其他腫瘤中的研究結(jié)果相一致[23-26]。本研究結(jié)果顯示,ZNF382表達水平與DLBCL患者的IPI評分、Ann Arbor分期、Hans分型、B癥狀、骨髓浸潤、巨大包塊相關(guān),治療有效患者腫瘤組織中ZNF382表達水平顯著高于治療無效患者;這進一步證實,ZNF382作為一個新的抑癌基因在DLBCL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用,ZNF382表達水平影響 DLBCL的治療效果,其可作為預(yù)測臨床療效的標志物。同時,本研究結(jié)果顯示,ZNF382高表達組患者的2 a EFS率顯著高于ZNF382低表達組,提示ZNF382表達水平影響DLBCL患者治療后的生存時間,其可作為預(yù)測DLBCL患者治療后生存時間的生物學指標。此外,本研究單因素分析顯示,女性、淋巴結(jié)內(nèi)原發(fā)、有B癥狀、有骨髓浸潤、有巨大包塊、IPI評分≥3分、β2-MG升高、Ki67>70%、non-GCB型、Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期、ZNF382低表達為影響DLBCL患者預(yù)后的危險因素,說明DLBCL的發(fā)生發(fā)展是多種因素參與的復雜病理過程,ZNF382表達水平影響DLBCL患者的預(yù)后。本研究多因素分析結(jié)果顯示,淋巴結(jié)內(nèi)原發(fā)、Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期、ZNF382低表達是影響DLBCL患者預(yù)后的獨立危險因素,提示ZNF382可作為DLBCL患者預(yù)后監(jiān)測的有效指標。

4 結(jié)論

ZNF382在不同臨床分期和預(yù)后的DLBCL患者腫瘤組織中表達存在差異,其表達量的高低可作為對DLBCL預(yù)后監(jiān)測的有效指標。但本研究為單中心、回顧性分析,臨床資料收集過程可能存在信息偏倚;另外,本研究樣本量較少,結(jié)果可能存在偏差;未來應(yīng)運用更加先進的技術(shù)及方法,進行前瞻性、大樣本多中心臨床研究、細胞分子研究等,進一步明確ZNF382在DLBCL中的具體作用機制,以期為 DLBCL 患者的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點。