魏宇濤,溫泉,唐維英,黃璐瑤,余曉琴,杜鋼,李澍才*,李航*

1(四川省食品檢驗(yàn)研究院,四川 成都,611731)2(國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(白酒監(jiān)管技術(shù)),四川 成都,611731) 3(四川省藥品檢驗(yàn)研究院,四川 成都,611731)

隨著人們生活水平的不斷提高,消費(fèi)者對(duì)食品品質(zhì)有了更高的要求,越來越關(guān)注食品中防腐劑的使用,尤其是一些宣稱“綠色”、“零添加”或者“純天然”等食品更是深得廣大消費(fèi)者喜愛[1]。防腐劑作為食品生產(chǎn)加工過程中常用的添加劑,其廣泛用于食品、藥品、生物標(biāo)本等方面[2-5],但是一些不法生產(chǎn)者為謀取利益非法濫用和虛假宣傳,對(duì)人體健康構(gòu)成潛在危害[6]。

蛋白飲料、液體調(diào)味品是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡氖称?其由于含有大量的蛋白質(zhì)、水體基質(zhì),更容易滋生細(xì)菌引起腐敗變質(zhì)。在GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中列入可使用的防腐劑大約有30多種,而日常監(jiān)督抽檢中的項(xiàng)目不到10種。目前針對(duì)防腐劑的高通量檢測(cè)技術(shù)研究,主要集中在藥品方面[7-10]。而食品中相關(guān)研究較少且研究都是針對(duì)單一化合物或者多類添加劑,其檢測(cè)的化合物和涉及的食品基質(zhì)有限[6,11-15]。目前現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和方法針對(duì)防腐劑檢測(cè)都存在目標(biāo)化合物單一,前處理方法復(fù)雜等問題[11],缺乏能夠同時(shí)檢測(cè)多種防腐劑的技術(shù)方法,也沒有將不允許在食品中使用的多種防腐劑納入檢測(cè)范圍,尤其在監(jiān)管此類“零添加”產(chǎn)品時(shí),檢測(cè)能力明顯不足。因此急需建立一套防腐劑的高通量篩查技術(shù),以解決此類產(chǎn)品的檢測(cè)痛點(diǎn)問題,本文應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了能夠同時(shí)檢測(cè)蛋白飲料和液體調(diào)味品中36種防腐劑的方法,該方法靈敏、快速、準(zhǔn)確度高且是現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中能同時(shí)檢測(cè)最多種類防腐劑的方法,對(duì)加強(qiáng)食品中防腐劑的監(jiān)測(cè)監(jiān)管力度具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀、Agilent 6495三重四極桿質(zhì)譜儀,美國(guó)Agilent公司;X3R高速離心機(jī),美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;IRMsci超聲儀,德國(guó)IRM Technology GmbH公司;IKA MS3渦旋混合器,德國(guó)IKA公司。

甲酸、乙腈、甲醇、乙酸銨(均為色譜純),美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;氨水、磷酸、NaCl(均為色譜純),成都科隆化學(xué)品有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

實(shí)驗(yàn)樣品:醋、醬油、蛋白飲料、其他液體調(diào)味品[醬汁、料酒、調(diào)味汁(料)],市售或網(wǎng)購。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品

混合標(biāo)準(zhǔn)品1:苯甲酸、山梨酸、納他霉素、脫氫乙酸、鄰苯基苯酚混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL,北京曼哈格生物科技有限公司。

混合標(biāo)準(zhǔn)品2:肉桂酸、4-氯-3,5-二甲基苯酚(對(duì)氯間二甲酚)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL,天津阿爾塔科技有限公司。

混合標(biāo)準(zhǔn)品3:4-羥基苯甲酸、三氯卡班、4-氯-3-甲基苯酚(對(duì)氯間甲酚)、芐氯酚、溴氯芬、4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯、4-羥基苯甲酸丙酯、4-羥基苯甲酸丁酯、4-羥基苯甲酸異丙酯、4-羥基苯甲酸異丁酯、2,4-二氯苯氧乙酸、苯氧乙酸、三氯生、水楊酸、2-溴-2-硝基-1,3丙二醇(布羅波爾)、甲基異噻唑啉酮、甲基氯異噻唑啉酮、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、氯咪巴唑、芐索氯銨、十四烷基二甲基芐基氯化銨、十六烷基二甲基芐基氯化銨、4-羥基苯甲酸戊酯、十二烷基二甲基芐基氯化銨、4-羥基苯甲酸苯酯、4-羥基苯甲酸芐酯、噻苯咪唑、月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,質(zhì)量濃度均為100 μg/mL,北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:根據(jù)各防腐劑的質(zhì)譜響應(yīng)不同,配制各分析物不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品1溶液0.025 mL、混合標(biāo)準(zhǔn)品2溶液0.01 mL以及混合標(biāo)準(zhǔn)品3溶液0.05 mL,置于同一10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻后,作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中間液。

1.3 樣品分析檢測(cè)

1.3.1 樣品前處理

稱取1 g混合均勻的樣品(精確至0.001 g),置于50 mL離心管中(醋類樣品先用體積分?jǐn)?shù)為10%氨水調(diào)節(jié)pH至中性,與其他基質(zhì)pH保持一致,防止pH變化使化合物保留時(shí)間發(fā)生變化)加入5 mL飽和NaCl溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH=3),渦旋混勻1 min使樣品在飽和NaCl水溶液中充分分散,再準(zhǔn)確加入20 mL乙腈-甲醇(9∶1,體積比)(含體積分?jǐn)?shù)為0.2%甲酸)渦旋混勻5 min,超聲提取15 min,置于高速離心機(jī)中9 000 r/min離心5 min,取上層有機(jī)相過0.22 μm濾膜,濾液用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.3.2 色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×3.0 mm,1.8 μm);柱溫35 ℃:進(jìn)樣量5 μL;流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨,B為甲醇。流速0.3 mL/min;流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI);掃描方式:正、負(fù)離子掃描;檢測(cè)方式動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(dynamic multiple reaction monitoring,DMRM);毛細(xì)管電壓3.0 kV;干燥氣溫度250 ℃;干燥氣流量11 L/min;霧化氣壓力45 psi;鞘氣溫度300 ℃;鞘氣流量11 L/min。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution procedure ofmobile phase

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的考察

2.1.1 儀器方法的建立和優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中考察了ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm)、ACE EXCEL C18柱(75 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Hypersil GOLDC18柱(100 mm×3.0 mm,1.9 μm)和Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×3.0 mm,1.8 μm)4種不同品牌色譜柱對(duì)36種防腐劑的分離情況,結(jié)合化合物峰形、分離度以及系統(tǒng)壓力,最終選擇Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×3.0 mm,1.8 μm)。同時(shí)比較了甲醇-乙酸銨、甲醇-甲酸銨和乙腈-乙酸銨3種流動(dòng)相體系對(duì)36種防腐劑的影響,結(jié)果表明甲醇-乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí),系統(tǒng)壓力較乙腈更低,目標(biāo)分析物分離度和峰形相對(duì)較好,同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化了乙酸銨的濃度,最終選擇甲醇-5 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相。選擇采用ESI+和ESI-模式對(duì)36種防腐劑進(jìn)行了一級(jí)質(zhì)譜全掃描和子離子掃描分析,篩選出36種目標(biāo)分析物的碎片離子。由于碎片離子較多,傳統(tǒng)的多反應(yīng)掃描模式可能會(huì)使目標(biāo)分析物碎片離子的色譜峰采集點(diǎn)不夠,影響峰形和質(zhì)譜響應(yīng)。采用DMRM能利用保留時(shí)間和保留時(shí)間窗口2個(gè)參數(shù),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行精確掃描,保證定性定量的準(zhǔn)確性。36種防腐劑總離子流圖見圖1。

圖1 36種防腐劑的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of 36 preservatives

2.1.2 基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)考察

由于36種防腐劑化合物性質(zhì)差異較大,大多為酸性化合物,還有兩性化合物和弱堿性化合物,且基質(zhì)之間性質(zhì)也差異較大,本研究采用斜率法考察了化合物的ME,即ME=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。若ME=1,則表示不存在基質(zhì)效應(yīng);ME>1,為增強(qiáng)效應(yīng);ME<1為抑制效應(yīng)。由表2可知,不同樣品基質(zhì)中一些化合物的ME不一致,為了兼顧多種防腐劑同時(shí)檢測(cè),因此實(shí)驗(yàn)中采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線以抵消基質(zhì)干擾、保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2 不同樣品基質(zhì)中36種目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 The matrix effect of 36 compounds in different sample matrices

續(xù)表2

2.1.3 提取條件的優(yōu)化

研究中考察了不同提取溶劑、混合比例、不同甲酸濃度對(duì)目標(biāo)化合物提取效率的影響,采用甲醇或者乙腈作為提取溶劑時(shí),甲基異噻唑啉酮、苯甲酸、噻苯咪唑峰形較差,由于乙腈具有沉淀蛋白的作用,而低比例乙腈會(huì)影響甲基異噻唑啉酮峰形,故綜合考慮采用乙腈-甲醇(9∶1,體積比)作為提取溶劑,進(jìn)一步考察了不同甲酸濃度對(duì)提取效果的影響,結(jié)果如圖2所示,考慮到提取效果、色譜柱耐受性和化合物峰形,最終采用0.2%(體積分?jǐn)?shù))甲酸。

圖2 甲酸濃度對(duì)目標(biāo)分析物的影響Fig.2 Effect of the formic acid concentrations on compounds

2.1.4 凈化方式的考察

由于液體調(diào)味品中基質(zhì)較復(fù)雜且一些基質(zhì)含鹽量很高,會(huì)影響目標(biāo)化合物的離子化效率以及質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度,實(shí)驗(yàn)中采用空白基質(zhì)加標(biāo)回收率方式考察EMR小柱(Agilent,Captiva EMR-Lipid,600 mg,6 mL)、PRiME HLB小柱(Waters Oasis PRiME HLB,200 mg,6 mL)、QuEChERS(乙二胺-N-丙基硅烷+C18+硫酸鎂+碳黑,Agela和Sepax)、飽和NaCl溶液(pH=3)4種凈化方式,結(jié)果如圖3所示,實(shí)驗(yàn)表明飽和NaCl溶液整體效果最好,且前處理方便快速。飽和NaCl溶液在高有機(jī)相環(huán)境中具有鹽析的作用,使基質(zhì)中的鹽和一些蛋白質(zhì)等雜質(zhì)留在水相中,起到分層凈化的作用。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍與定量限

分別稱取3份不同基質(zhì)的空白樣品,按照前處理方法得到空白基質(zhì)溶液。配制36種目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度為1～250 ng/mL的系列混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,以目標(biāo)組分的峰面積y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x(ng/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。以信噪比(S/N)≥10作為方法的定量限,其線性方程和定量限見表3。

2.2.2 方法回收率與精密度

在蛋白飲料、醬油和醋的空白樣品中分別添加低、中、高3個(gè)濃度的目標(biāo)分析物,每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次,計(jì)算平均加標(biāo)回收率和精密度,結(jié)果見表4。目標(biāo)分析物的回收率為75%～119%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)為0.90%～9.8%。

圖3 凈化方式對(duì)目標(biāo)分析物的影響Fig.3 Effect of the purification methods on compounds

表3 36種目標(biāo)分析物的質(zhì)譜參數(shù)、線性關(guān)系和定量限Table 3 MS/MS parameters,linear relationships,and limits of quantification of 36 compounds

續(xù)表3

表4 36種目標(biāo)分析物的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of 36 compounds(n=6)

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本文建立的方法,對(duì)從市場(chǎng)購買的50批樣品(醋10批、醬油10批、蛋白飲料20批、其他液體調(diào)味品10批)進(jìn)行檢測(cè),其中1批蛋白飲料和1批醋分別檢出肉桂酸(0.000 17、0.001 3 g/kg),2批蛋白飲料、2批醋和2批醬油中分別檢出4-羥基苯甲酸(0.000 009、0.000 18、0.005 2、0.002 3、0.003 0、0.002 7 g/kg);2批醋和1批液體調(diào)味品分別檢出4-羥基苯甲酸乙酯,1批液體調(diào)味品中檢出脫氫乙酸,8批醬油、6批醋和9批其他液體調(diào)味品分別檢出苯甲酸和山梨酸;其余樣品中未檢出相關(guān)防腐劑化合物。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的蛋白飲料、液體調(diào)味品中36種防腐劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法,尤其覆蓋一些新型和不常見防腐劑的高通量定性定量檢測(cè)方法。前處理方法采用提取和凈化相結(jié)合的方式,能有效減少基質(zhì)干擾,建立的檢測(cè)方法靈敏、快速,準(zhǔn)確度高,操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本較低,可極大提高多種防腐劑的定性定量檢測(cè)效率,對(duì)監(jiān)測(cè)食品中防腐劑使用情況具有重要的意義。