李 欣， 周 穎， 王鼎南， 裴 勇， 武 斌， 張宜明

（1. 浙江農林大學食品與健康學院, 杭州 311300；2. 浙江省水產推廣技術總站, 杭州 310023； 3. 湘潭大學化學學院, 湘潭 411105；4. 浙江農林大學數(shù)學與計算機科學學院, 杭州 311300）

沙丁胺醇（Salbutamol， SAL）是在治療哮喘和慢性阻塞性肺疾病中使用最廣泛的β2激動劑之一［1］.沙丁胺醇對牛、 羊、 禽和豬等具有促生長、 促進營養(yǎng)再分配及提高動物蛋白質合成等作用， 所以飼料中添加沙丁胺醇可以顯著提高肉類行業(yè)的利潤［2，3］. 但是， 人在食用含沙丁胺醇較高的動物組織后將產生一系列不良反應（如肌肉震顫、 心悸、 頭痛、 惡心和嘔吐等）， 會對身體健康造成重大危害［4］. 因此， 動物產品中沙丁胺醇殘留物的檢測和測定對畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生健康都具有重要意義. 目前， 沙丁胺醇殘留檢測的方法［弱陽離子交換層析、 聚合物微萃取、 免疫親和柱和固相萃取（SPE）柱等［5～7］］很多， 但這些方法設備昂貴且操作繁瑣、 選擇性差.

分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymers， MIPs）是以待測物質為模板合成的超分子聚合材料， 隨著新印跡技術的發(fā)展， 其對特定的目標分子（如藥物、 食品和農藥）具有越來越好的選擇性和親和力， 并已被用于分離和識別廣泛的生化實體［8，9］. 但是MIPs的缺點（電導率差、 腔體可達性差和傳質速率低）限制了其對分析物的高效檢測［10］， 因此， 設計具有良好導電性和高比表面積的新型MIP材料來克服這些缺陷具有重要意義. 研究表明， 金屬有機框架（Metal-organic frameworks， MOFs）材料具有高孔隙率和高比表面積等優(yōu)點， 是開發(fā)固定單體和模板分子的新型分子印跡聚合物的良好載體［11］. MOFMIPs 的組合結構既能提供選擇性吸附的特異性識別位點， 又能提供較多的比表面積孔隙吸附［12］. 因此， 具有增強傳感特性的MOF-MIPs已經被制造出來并用于檢測各種目標物［13，14］. 此外， 含有特定官能團配體的MOFs被設計合成出來， 拓展了其應用［15］， 近年來， 具有硼酸官能團的配體已被成功組裝， 得到的功能化MOFs對順式二醇化合物具有較好的選擇性和富集性能［16，17］， 硼酸配體與含順式二醇化合物之間形成的硼酸酯可在不同的pH 下實現(xiàn)成環(huán)和開環(huán)的過程， 從而實現(xiàn)模板底物的結合和釋放［18］.同時， 分子印跡所構筑的選擇性空腔能進一步保證硼親和材料對含有順式二醇結構分子的選擇性能，實現(xiàn)快速、 穩(wěn)定、 有選擇性地富集食品中的含順式二醇的污染物質.

近年來， 為了提高MIPs的可預測性、 可控性、 選擇性和識別能力， 并定量探索印跡分子與功能單體之間的相互作用， 已有在原子水平上建立分子模型模擬MIPs的設計［19］. 目前， 分子模擬在分子印跡材料的研發(fā)過程中得到了越來越廣泛的應用， Zhao等［20］對甲醛和甲基丙烯酸復合物自組裝系統(tǒng)中交聯(lián)劑、 溶劑以及印跡比的優(yōu)化模擬， 為制備快速、 經濟、 新型的甲醛MIPs 提供了可靠的理論依據(jù).Zeng等［21］用密度泛函理論分析了泰樂菌素與硼酸鹽以帶電氫鍵形式存在的硼酸親和機理. 分子模擬不僅為功能單體、 印跡比、 交聯(lián)劑和溶劑［22，23］的篩選提供了理論指導， 而且定量描述了分子水平［24，25］上的識別和機制以及印跡的本質.

鑒于形成的硼酸酯鍵對底物分子的獨特識別能力， 借助這種親和作用可在MOF骨架結構上構筑新型微流控選擇性識別芯片. 本文以Zr為金屬中心， 以對苯二甲酸（Terephthalic acid， BDC）和3-羧基苯硼酸（3-Carboxyphenylboronic acid， 3-CPBA）為雙配體， 合成了UiO-66-BA金屬有機框架材料， 并在此基礎上開發(fā)了一種基于硼親和策略的新型MOF/MIP復合材料的分子印跡紙基芯片F(xiàn)SU-BA@MIP， 通過密度泛函理論（Density functional theory， DFT）對FSU-BA@MIP選擇性吸附沙丁胺醇的機理進行了理論計算； 首先對FSU-BA@MIP 中具有吸附作用的金屬有機框架（UiO-66-BA）的3-羧基苯硼酸配體和沙丁胺醇的復合物進行拓撲分析， 對比了中性和離子化硼酸與沙丁胺醇間的相互作用力； 再通過Materials Studio軟件的DMol3模塊對UiO-66-BA和沙丁胺醇及競爭吸附物質的復合物進行模擬； 計算結果解釋了基于硼親和分子印跡策略MOF/MIPs對沙丁胺醇的選擇性吸附， 并為下一步的MOF基選擇性識別界面構筑提供了實例分析和理論參考.

1 實驗部分

1.1 計算方法

通過Gaussian 16［26］和Materials Studio 2018［27］軟件進行結構優(yōu)化， 使用Multifwn 3.8［28］軟件分析結果， 用VMD1.9.3［29］軟件進行可視化.

1.2 計算過程

1.2.1 硼親和作用機理 采用Gaussian 16程序研究3-羧基苯硼酸配體和沙丁胺醇的相互作用， 結構優(yōu)化使用隱式溶劑模型（Implicit solvation model， SMD）， 溶劑為水， 采用DFT的B3LYP/6-31+G（d，p）泛函加上色散校正（em=gd3bj）計算， 最后用波函數(shù)分析軟件Multifwn進行拓撲分析， 并用VMD軟件繪制結構模型.

1.2.2 印跡空腔模擬 印跡空腔的模擬能夠預測分子印跡空穴的形狀， 使用Materials Studio 軟件的Adsorption Locator 模塊的模擬退火法獲得了3-CPBA 和模板沙丁胺醇分子以及交聯(lián)劑硅酸四乙酯（Tetraethyl orthosilicate， TEOS）的自組裝混合物， 再將模板分子從中移除， 形成含有印跡空腔的混合物， 然后對其進行幾何優(yōu)化， 并用Forcite模塊的動力學方法模擬了腔體對模板再吸附的動態(tài)過程.

1.2.3 印跡空腔識別機制 對沙丁胺醇和幾種競爭吸附化合物［去甲腎上腺素（Noradrenaline，NORE）、 特布他林（Terbutaline sulfate， TER）、 克侖特羅（Clenbuterol hydrochloride， CBL）、 萊克多巴胺（Ractopamine hydrochloride， RAC）］進行結構優(yōu)化， 再使用Multifwn 軟件分析得出每種底物分子的體積. Piletsky等［30］提出只有模板分子或分子體積小于模板分子的物質才能夠進入印跡空腔， 在此， 通過比較分子體積的大小初步確定能夠進入印跡空腔的化合物， 由此來判斷分子印跡對競爭化合物是否存在吸附作用.

1.2.4 結合能與反應能 使用Materials Studio 軟件中的DMol3模塊進行選擇性吸附計算， 具體模擬過程如下： （1） 對構建好的UiO-66-BA、 沙丁胺醇、 競爭吸附化合物進行結構優(yōu)化； （2） 在已經優(yōu)化完的UiO-66-BA吸附SAL的xsd文件去除模板（SAL）后固定的所有原子坐標， 然后在可能的作用位點加入優(yōu)化完成的競爭化合物形成新的復合構型； （3） 根據(jù)結合能公式計算得出幾種物質與印跡空腔中識別位點的結合能， 通過比較結合能的大小說明模板對沙丁胺醇的特異性吸附. 并通過Mulliken布居電荷分析能夠更加準確地從理論上說明FSU-BA@MIP對沙丁胺醇的選擇性吸附.

根據(jù)下式計算結合能（?E1， eV）：

式中：EC（eV）為UiO-66-BA與吸附化合物形成未成環(huán)簡單復合物的總能量；ET（eV）為吸附化合物的能量；EU（eV）為UiO-66-BA的能量.

因為硼酸配體與含順式二醇的化合物在一定的pH下可形成的硼酸酯， 故模擬硼親和分子印跡對目標物的選擇性時不能僅僅計算一般的非共價作用情況. 在此， 也模擬計算了UiO-66-BA和SAL及競爭物質反應脫去兩分子水形成五元或六元環(huán)酯時的反應能， 在式（1）的基礎上加上兩分子水的能量得到的反應能（?E2， eV）的公式如下：

式中：EM（eV）為UiO-66-BA與吸附化合物結合成含有硼酸環(huán)酯復合物的總能量；EH2O（eV）為水的能量.

1.3 實驗過程

為了考察FSU-BA@MIP 對 SAL 的特異性吸附， 選擇同屬于β-腎上腺素受體激動劑的克侖特羅、 特布他林、 萊克多巴胺及結構類似物去甲腎上腺素作為SAL 的競爭吸附化合物. 分別配制上述5種化合物的標準甲醇溶液（50 mg/L， 2 mL）， 加入兩片F(xiàn)SU-BA@MIP或FSU-BA@NIP 在水浴搖床中以120 r/min 振蕩1 h， 結束后取上層清液過0.22 μm 針頭式濾膜， 用高效液相色譜［Agilent 1100型高效液相色譜儀（HPLC）， 美國安捷倫科技有限公司］檢測殘留物濃度， 并根據(jù)下式計算吸附容量：

式中：Qe（mg/g）為單位質量的FSU-BA@MIP 對SAL 的吸附量；c0（mg/L）為SAL 起始溶液濃度；ce（mg/L）為吸附平衡時溶液相中SAL 濃度；V（mL）為吸附平衡時溶液體積；m（g）為FSU-BA@MIP 的質量.

2 結果與討論

2.1 沙丁胺醇和3-羧基苯硼酸的相互作用

分子中原子（Atoms in molecules， AIM）理論分析化學鍵主要是基于電子密度拓撲分析的手段. AIM拓撲圖中顯示了鍵徑和鍵臨界點（Bond critical point， BCP）， 從實際化學意義上判斷， 鍵徑能夠較好地展現(xiàn)原子間相互作用的最主要路徑， BCP 的屬性可以用來考察相應化學鍵的特征， 包括強度和本質［31］. 基于 Hirshfeld 分區(qū)的獨立梯度模型（IGMH）以圖形的方式更直觀顯示分子間弱相互作用， 圖形中等值面的大小和顏色可以判斷作用力的強弱［32］. 在此， 可用AIM分析和IGMH圖來識別3-CPBA和沙丁胺醇形成的復合物之間的相互作用.

中性的3-CPBA與沙丁胺醇分子間形成一條鍵徑［圖1（A）］， 形成的等值面對應著散點圖［圖1（C）］中sign（λ2）ρ為-0.04處的峰值（δinterg為3-CPBA與沙丁胺醇間的相互作用力）， 圖1中最下面的顏色標尺代表圖中的著色方式和對應的顏色解釋， 所以圖1（A）中形成的藍色等值面表示強吸引力（如氫鍵）. 離子化的3-CPBA與沙丁胺醇形成3條鍵徑［圖1（B）］， 位點2的等值面對應著散點圖［圖1（D）］ sign（λ2）ρ為-0.05處的峰值， 此處峰值明顯高于位點1， 并且圖1（B）中兩個分子間也存在一些范德華力作用， 這些可以說明離子化的3-CPBA與沙丁胺醇間的相互作用更強. 鍵臨界點的電子密度分析可以從理論上預測真空相中氫鍵的能量， 根據(jù)式（4）或式（5）［33］， 可以表明實驗中分子間相互作用的強度. 鍵臨界點1處和2處的電子密度［ρ（r）， a.u.］的值列于表1.

Table 1 Electron density and predicted energy H-bonding of different sites

Fig.1 Interaction of salbutamol and 3-carboxyphenylboronic acid（A） AIM and IGMH plots for neutral 3-CPBA and SAL； （B） AIM and IGMH plots of charged 3-CPBA and SAL； （C） interaction scatter plot of neutral 3-CPBA and SAL； （D） interaction scatter plot of charged 3-CPBA and SAL. Elements： H（white）； B（pink）；C（cyan）； O（red）； N（blue）.

式中：Eneutral（kJ/mol）為中性復合物中形成的氫鍵鍵能. 將位點1相應的ρ（r）代入式（4）， 可以計算出位點1處形成的氫鍵鍵能估計值為-35.5356 kJ/mol， 屬于中等強度氫鍵范疇；Echarged（kJ/mol）為帶電復合物中的氫鍵鍵能， 將位點2的電子密度代入式（5）得到氫鍵鍵能為-68.5631 kJ/mol， 屬于強氫鍵. 氫鍵的能量越高， 共價鍵就越容易形成， 說明離子化3-羧基苯硼酸更容易與含順式二醇的沙丁胺醇形成穩(wěn)定的苯硼酸酯.

2.2 印跡空腔模擬

對3-CPBA， SAL和TEOS進行印跡空腔模擬， 形成的分子印跡自組裝混合物如圖2（A）所示， 形成的自組裝混合物可以可視化模擬吸附沙丁胺醇的過程， 更為直觀了解印跡空腔的形成以及其對SAL的吸附. 從圖2（A）可見， 3-CPBA和SAL被TEOS包圍， 形成了一定厚度的印跡涂層， Bie等［34］認為適當厚度的印跡涂層能夠決定MIP對模板的結合性質， TEOS形成的二氧化硅層能夠有效避免特異性吸附. 將模板沙丁胺醇分子移除， 能看到形成了一個印跡空腔［圖2（B）］， 由于二氧化硅的高度交聯(lián)結構使印跡涂層具有高孔隙率、 優(yōu)異的物理剛性等特點， 因此， 該空腔在形狀和尺寸上應與模板互補. 再通過分子動力學模擬吸附沙丁胺醇的過程， 將沙丁胺醇放在空腔入口處［圖2（C）］， 印跡空腔里的作用位點對沙丁胺醇的特異性吸附使其進一步進入空腔， 圖2（D）為分子動力學模擬結束狀態(tài).

Fig.2 3-CPBA, SAL and TEOS molecularly imprinted self-assembly mixtures(A), imprinted cavity mixture(B), the initial state(C) and the end state(D) of molecular dynamics simulationElements： Si（yellow）； H（white）； B（pink）； C（gray）； N（blue）； O（red）.

2.3 選擇性吸附模擬

研究了基于硼親和策略新型MOF/MIP 復合材料的分子印跡吸附膜FSU-BA@MIP 對沙丁胺醇及其類似物的選擇性， 實驗結果表明， FSU-BA@MIP 對沙丁胺醇存在特異性吸附， 對其它競爭物質有少量吸附. 為了更加了解FSU-BA@MIP對沙丁胺醇的吸附性能并且驗證實驗結果， 對競爭物質的分子體積進行比較和DFT 計算， 從分子水平上對FSU-BA@MIP 中主要具有吸附作用的金屬有機框架（UiO-66-BA）對沙丁胺醇的選擇性識別機制進行了理論計算與分析.

2.3.1 模型的構建 探討的硼親和策略分子印跡技術是在紙基上進行硼親和定向表面印跡選擇性吸附動物源性食品中的沙丁胺醇， 實驗中以Zr為金屬中心、 對苯二甲酸和3-羧基苯硼酸為雙配體（摩爾比3∶1）合成了UiO-66-BA 納米材料. 為了讓計算模擬與實驗條件接近， 在UiO-66-BA 模型構建時的兩種配體摩爾比也應該為3∶1， 并且Song 等［35］使用離子化4-羧基苯硼酸構型對硼酸配體與模板的結合能進行計算， 將UiO-66-BA中一個3-羧基苯硼酸配體以陰離子硼酸基形式表示， 構建的UiO-66-BA 模型如圖3所示. UiO-66-BA 的結構單元是由［Zr6O4（OH）4］金屬簇團與12 個配位連接而成， 密集的結構單元使得整個結構穩(wěn)定地連接. 沙丁胺醇和其它競爭吸附化合物的分子構型取自ChemSpider網站.

Fig.3 Initial configuration of UiO-66-BA

2.3.2 分子體積 研究分子印跡的識別機制， 首先分析競爭分子的分子體積. 使用Gaussian 16軟件對沙丁胺醇及4種競爭吸附化合物［去甲腎上腺素（NORE）、 特布他林（TER）、 克侖特羅（CBL）、 萊克多巴胺（RAC）］進行結構優(yōu)化， 將結果文件導入分析軟件Multifwn3.8得到各自的體積.

計算得出沙丁胺醇、 克侖特羅、 萊克多巴胺的分子體積分別為0.3305， 0.3418 和0.4061 nm3， 競爭物質克侖特羅和萊克多巴胺的分子體積均大于沙丁胺醇的體積， 因此進入不了印跡空腔， 能夠解釋實驗結果中FSU-BA@MIP對這兩種物質的吸附量最低的現(xiàn)象. 去甲腎上腺素和特布他林的分子體積分別為0.2124和0.3068 nm3， 均比沙丁胺醇的分子體積小， 說明這兩種分子可以進入印跡空腔， 但是去甲腎上腺素和特布他林分子與空腔中識別位點的相互作用弱于模板分子沙丁胺醇， 屬于非特異性吸附結合， 此結論可通過DFT計算進行理論模擬驗證分析.

2.3.3 UiO-66-BA與目標物質的結合能 在考慮分子印跡作用時， 印跡空腔能對模板分子沙丁胺醇及其類似物具有選擇識別特性， 故UiO-66-BA 與沙丁胺醇和競爭分子去甲腎上腺素、 特布他林之間均含有相互作用力， 結合方式由目標分子和UiO-66-BA形成復合物的結構決定. 模板分子與功能單體在溶液中以非共價方式作用， 主要是氫鍵、 疏水作用、π-π共軛等作用力［36］. 由2.1 節(jié)的結果可知，UiO-66-BA的硼酸配體與沙丁胺醇間存在氫鍵作用， 在此， 先模擬UiO-66-BA與目標分子非共價作用時摩爾比為1∶1的復合物構型（圖4）， 并用式（1）計算結合能. 通常， 復合物的結合能越低， 復合物的穩(wěn)定性越強， UiO-66-BA與目標分子之間的相互作用也越強.

Fig.4 Optimized configuration of the complex formed by UiO-66-BA with Salbutamol(A),Norepinephrine(B) and Terbutaline(C)

從表2可見， UiO-66-BA和沙丁胺醇的結合能為-1.1494 eV， 明顯低于UiO-66-BA-NORE的結合能（-0.8350 eV）以及UiO-66-BA-TER 的結合能（-0.7241 eV）， 結合能ΔE為負值， 越低越有利于UiO-66-BA對沙丁胺醇的識別， 說明印跡空腔對沙丁胺醇的吸附結合作用強于去甲腎上腺素和特布他林， 這與選擇性吸附實驗中去甲腎上腺素和特布他林的吸附量均低于沙丁胺醇的結果一致.

Table 2 Binding energy of UiO-66-BA with adsorbed substance

2.3.4 Mulliken布居電荷分析 Mulliken布居電荷有助于了解UiO-66-BA與沙丁胺醇、 去甲腎上腺素和特布他林形成復合物時表面電子的定量轉移情況. 表3列出了3種復合物中主要原子吸附前后的電荷量， 并計算了電子轉移數(shù)量（Δe）， 電子轉移主要是UiO-66-BA 的羥基上的O 原子得電子， H 原子失電子. 轉移的電荷數(shù)越多， 相互作用越大［37］， 通過表3數(shù)據(jù)可知， UiO-66-BA-SAL的得失電子數(shù)都是最多的， 因此， 在以非共價方式作用的模型中， UiO-66-BA和沙丁胺醇之間有較強的相互作用力. Mulliken電荷分析的結果和結合能的結果一致， 均能驗證選擇性吸附實驗中FSU-BA@MIP對沙丁胺醇的吸附效果最好.

Table 3 Mulliken charge of UiO-66-BA bound to the adsorbed substance

2.3.5 UiO-66-BA與目標物質的反應能 硼酸鹽親和材料的分子相互作用的原理依賴于硼酸配體與含順式二醇的化合物之間的可逆共價反應， 當溶液的pH大于硼酸的解離常數(shù)（pKa）值時， 硼酸以四方硼酸根陰離子（sp3）的形式存在， 并與順式二醇反應形成共價鍵環(huán)酯［38］. 在模擬計算FSU-BA@MIP對沙丁胺醇選擇性吸附機理時， 除了考慮分子印跡的作用， 還應考慮硼親和作用. 使用Materials Studio 軟件中的DMol3模塊計算UiO-66-BA 和沙丁胺醇及競爭分子的順勢二醇反應脫去兩分子水時的復合物能量， 溶劑為水， 用式（2）計算的反應能結果列于表4. 可見， UiO-66-BA與沙丁胺醇的反應能最小， 并且反應能遠高于非共價作用時的能量， 能夠說明UiO-66-BA的硼酸配體與SAL更易形成硼酸環(huán)酯且形成的復合物在一定pH的溶液狀態(tài)下穩(wěn)定存在.

Table 4 Reaction energy of UiO-66-BA with adsorbed substance

2.4 實驗結果

硼酸鹽親和材料能夠在堿性環(huán)境下與含順式二醇的物質結合； 表面印跡的有效傳質促進了模板分子的去除和重新結合， 獲得了較高的印跡效率. 在硼酸鹽親和與表面印跡的雙重作用下，F(xiàn)SU-BA@MIP 具有特異性識別位點以及較高結合親和力， 能夠選擇性吸附具有順式二醇結構的沙丁胺醇， 其它相似分子存在一些非特異性吸附. 在此， 通過式（3）計算了FSU-BA@MIP 對幾種物質的吸附量， FSU-BA@MIP 對沙丁胺醇的吸附量最高， 達到111.6732 mg/g， 去甲腎上腺素的吸附量為31.1263 mg/g， 高于特步他林的16.4869 mg/g， 與計算得到的結合能中去甲腎上腺素的結合能絕對值高于特步他林一致. 克倫特羅和萊克多巴胺的吸附量分別為13.8163和11.2247 mg/g， 與克侖特羅和萊克多巴胺的分子體積大于沙丁胺醇從而進入不了印跡空腔導致吸附量較低的結論一致， 說明計算結果能驗證與指導實驗， 并能估計選擇性實驗中吸附物質的吸附量高低.

3 結論

使用拓撲分析得出3-羧基苯硼酸與沙丁胺醇間存在氫鍵作用， 并且離子化的3-羧基苯硼酸與沙丁胺醇的氫鍵鍵能更高. 氫鍵的能量越高， 共價鍵就越容易形成， 說明硼酸以四方硼酸根陰離子（sp3）的形式存在時易與順式二醇反應并形成硼酸酯. 此外， 通過密度泛函理論計算模擬驗證實了驗結果，F(xiàn)SU-BA@MIP對沙丁胺醇有特異性吸附， 為實驗提供了計算方法與理論依據(jù)， 并為發(fā)展新型硼親和印跡材料提供了計算參考和佐證. 對MOF界面硼親和結合底物的計算與表征策略的研究結果， 證明了硼修飾的UiO-66-BA是一個非常具有潛力的硼親和骨架.