冼佳露，李 理*

（華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品大多以自然發(fā)酵為主，在長期發(fā)酵過程中引入了環(huán)境中的多種微生物，這些微生物菌群利用原料中的營養(yǎng)成分通過多種代謝途徑改變產(chǎn)品的品質(zhì)，激發(fā)獨特風味[1]。但這些微生物復雜多變，隨環(huán)境條件改變而發(fā)生動態(tài)變化，產(chǎn)品可能存在致病菌污染問題。

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種食源性條件致病菌，通過產(chǎn)生腹瀉型或嘔吐型毒素影響人體健康[2-4]。目前研究表明，腐乳、豆醬等發(fā)酵食品中普遍存在蠟樣芽孢桿菌污染，其中腐乳的污染率較高，并有超出限量標準的報道，具有食品安全隱患[5-7]，但對于傳統(tǒng)發(fā)酵食品毛豆腐、辣椒醬和酸湯中是否有蠟樣芽孢桿菌污染尚鮮見報道。毛豆腐和腐乳的前期發(fā)酵工藝相近[8]，均是豆?jié){經(jīng)自然發(fā)酵的酸漿水凝乳壓榨制成豆腐[9]，再接種毛霉[10]發(fā)酵而成。如果原料、環(huán)境中有蠟樣芽孢桿菌則可在發(fā)酵過程中大量繁殖而帶來污染風險。此外，雖然目前關于辣椒醬產(chǎn)品污染蠟樣芽孢桿菌的報道較少，但有報道表明新鮮辣椒、干辣椒、辣椒粉中存在蠟樣芽孢桿菌污染，且分離菌株大多攜帶腹瀉型毒力基因[11-13]。酸湯因發(fā)酵原料差異，分為白酸湯和紅酸湯兩種[14]。白酸湯的主要發(fā)酵基質(zhì)為米湯，從成熟老酸湯中接種乳桿菌屬、明串珠菌屬、醋酸桿菌屬等微生物菌群[15-17]；而紅酸湯的主要發(fā)酵基質(zhì)為糯米、番茄、辣椒，優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬、德克酵母屬、釀酒酵母屬和畢赤酵母屬等[18-19]。酸湯中的蠟樣芽孢桿菌污染問題少見報道。傳統(tǒng)發(fā)酵食品的蠟樣芽孢桿菌污染問題應當引起重視，不管是原料中攜帶蠟樣芽孢桿菌，還是發(fā)酵過程中環(huán)境引入蠟樣芽孢桿菌，都可能導致終產(chǎn)品的污染菌數(shù)超過安全限量，消費者攝入后容易引發(fā)食品安全問題。

國內(nèi)外相關研究顯示，蠟樣芽孢桿菌污染多發(fā)生在淀粉類食物、豆類制品、肉類制品、乳制品等產(chǎn)品中[20]，對辣椒醬、酸湯、毛豆腐三類傳統(tǒng)發(fā)酵食品的關注度較低。因此，本研究針對這三類產(chǎn)品，探究其蠟樣芽孢桿菌污染狀況，研究樣品分離菌株的生理生化特征、毒力基因和多樣性，以期為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的安全生產(chǎn)提供指導和控制依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

辣椒醬（瓶裝密封）（5個樣品編號分別為L、S、XP、J、XS）和酸湯（瓶裝密封）（4個樣品編號分別為MST、ST、YM、3Y）、毛豆腐（塑料盒裝）（7個樣品編號分別為HW、ML、BCT、LHZ、HA、HZ、HY）：市售，低溫保存；標準菌株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC14579：廣東省微生物保藏中心。

1.1.2 試劑

革蘭氏染色液、堿性復紅（0.5%）：廣州環(huán)凱生物科技有限公司；硝酸鹽還原試劑盒、溶菌酶溶液（0.1%）：青島海博生物技術有限公司；過氧化氫溶液（30%）、甲醇（99%）：南京化學試劑有限公司；多粘菌素B硫酸鹽（6 000 IU）：瑞舒生物科技有限公司；核酸熒光定量染料（P7589）：美國Invitrogen公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Mix、Marker、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：廣州東盛生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂（mannitol yolk polymyxin agar，MYP）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血平板：廣州環(huán)凱生物科技有限公司；腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基、硝酸鹽肉湯培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

POGSON-09X無菌均質(zhì)機：南京普森儀器設備有限公司；SE-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海申賢恒溫設備廠；MDF-86V340E醫(yī)用低溫冰箱：安徽中科都菱商用電器股份有限公司；XSP-BM-3CA顯微鏡：上海雷韻試驗儀器制造有限公司；TC-96/G/H（b）C基因擴增儀：杭州柏恒科技有限公司；DYCP-31E電泳儀：北京六一生物科技有限公司；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統(tǒng)：北京百晶生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將采集的樣品使用滅菌研缽在無菌條件下研磨均勻，分裝后液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌的分離與計數(shù)

根據(jù)國標GB 4789.14—2014《食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗》方法測定樣品的污染菌數(shù)[21]。每個稀釋梯度平行3份。在MYP平板中挑取疑似菌落，在營養(yǎng)瓊脂平板劃線分離，重復操作4～5次，直至獲得單菌落。BHI液體培養(yǎng)后，取菌液于25%甘油條件下在-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 分離菌株的生理生化鑒定

根據(jù)國標GB 4789.14—2014《食品安全國家標準——食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗》方法進行測定[21]。

1.3.4 分離菌株的毒力基因測定

根據(jù)參考文獻[22]方法，適當修改。采用PCR方法檢測7個腸毒素基因（hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK）、1個潛在毒力基因（entFM）和2個嘔吐毒力基因（cesB、EM1）。以蠟樣芽孢桿菌ATCC14579為對照菌株，并設置空白對照。

采用DNA提取試劑盒提取分離菌株DNA。分別配制25 μL PCR擴增體系（①hbl、nhe、entFM：提取DNA 2 μL、10 μmol/L引物各1 μL、PCR mix酶10 μL、超純水11 μL；②cytK：提取DNA 2 μL、100 μmol/L引物各0.2 μL、PCR mix酶12.5 μL、超純水10.5 μL；③cesB、EM1：提取DNA 2 μL、10 μmol/L引物各2.5 μL、PCR mix酶12.5 μL、超純水5.5 μL）。根據(jù)引物條件（表1）進行PCR擴增。PCR擴增結束后，將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以2 000 bp Marker條帶作為對照。

表1 蠟樣芽孢桿菌毒力基因測定的引物及測定條件Table 1 Primers and conditions for the determination of Bacillus cereus virulence genes

1.3.5 分離菌株的分型

分型采用隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術。根據(jù)參考文獻[23]方法，適當修改。DNA提取方法同1.3.4。配制25 μL體系（提取DNA 1 μL、引物各1 μL、PCR mix酶10 μL、超純水12 μL）。采用引物HLWL85（序列5'-ACAACTGCTC-3'）對細菌基因組DNA進行隨機擴增，PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min、34 ℃退火2 min、72 ℃延伸2 min，共45個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增結束后，將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分離擴增片段。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用Excel 2019、Origin 2018等軟件。RAPD電泳條帶經(jīng)NTedit 軟件識別轉(zhuǎn)化為0/1矩陣，采用NTSYS PC 2.1軟件計算遺傳距離，使用MRGA11軟件算術平均值未加權對組方法（UPGMA）繪圖。

2 結果與分析

2.1 辣椒醬、酸湯和毛豆腐中蠟樣芽孢桿菌的污染菌數(shù)

3類傳統(tǒng)發(fā)酵食品的污染狀況及菌株分離情況見表2。

表2 三類傳統(tǒng)發(fā)酵食品中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況Table 2 Contamination status of Bacillus cereus in three types of traditional fermented food

由表2可知，5個辣椒醬樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為100%，污染菌數(shù)在15～460 MPN/g之間，污染菌數(shù)較低，與已有報道基本一致。向婧姝等[24]檢測了貴陽市的120個市售糟辣椒樣品，樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為55.00%，污染菌數(shù)在0～100 CFU/g之間。辣椒醬的生產(chǎn)工藝比較簡單，通常是將辣椒洗凈晾干后切碎，再按一定比例拌入食鹽及切碎的姜、蒜等，裝壇密封后進行1～2月的自然發(fā)酵而成。雖然辣椒醬的生產(chǎn)過程沒有滅菌工序，但原輔料中含有大量的辣椒素、大蒜素、姜辣素和肉桂酸等抑菌成分[25-27]，因此對蠟樣芽孢桿菌有較好的控制效果。

2個紅酸湯和2個白酸湯共4個樣品的分析結果顯示，酸湯中的蠟樣芽孢桿菌檢出率為100%，污染菌數(shù)在3.6～23 MPN/g之間，污染程度不高。酸湯主要來源于貴州凱里，根據(jù)原料不同，有紅酸湯、白酸湯兩種產(chǎn)品。白酸湯是由糯米經(jīng)清洗、磨碎后，接種老酸湯，再裝壇密封進行自然發(fā)酵即為白酸湯而成[28]。紅酸湯則是紅辣椒、番茄、姜、糯米、木姜子等原料磨碎后放入壇中，再加入白酒、食用鹽等進行調(diào)味，密封后進行自然發(fā)酵，制成半成品，然后再經(jīng)二次發(fā)酵而成熟[15]。通常酸湯在罐裝后會進行商業(yè)滅菌。酸湯中的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacillus）、德克酵母屬（Dekkera）等菌群[29-30]，而芽孢桿菌屬僅占比1%～2%，豐度較低。表明蠟樣芽孢桿菌在酸湯樣品中并不是優(yōu)勢菌，污染菌數(shù)較少。

7個毛豆腐樣品的分析結果顯示，毛豆腐中蠟樣芽孢桿菌污染的情況差異較大。其中，2個購買于夏季（氣溫28～30 ℃）的樣品污染菌數(shù)高達7 lg CFU/g，而另外5個購買于秋季（氣溫18～20 ℃）的樣品未檢出蠟樣芽孢桿菌。這可能與購買樣品期間的氣溫不同或商家運輸產(chǎn)品的方式有關。蠟樣芽孢桿菌的最適生長溫度為30 ℃，夏季的溫度更有利于其生長繁殖，而運輸途中如果溫度升高，也會加速菌株繁殖的速度。

為了獲得蠟樣芽孢桿菌更為詳細的信息，進一步從以上樣品的MYP平板上挑取了單菌落，經(jīng)分離純化，獲得了94個分離菌株。其中，辣椒醬來源分離菌株39株、酸湯來源分離菌株35株、毛豆腐來源分離菌株20株。由于蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌同屬于蠟樣芽孢桿菌族（Bacillus cereus sensu lato），許多表型特征及16S基因序列的同源性較高[32]。因此，需要進一步通過生理生化特征鑒定來判斷菌株是否為蠟樣芽孢桿菌。

2.2 分離菌株的生理生化鑒定

以蠟樣芽孢桿菌ATCC14579為對照菌株，對三類樣品分離的94個菌株分別進行了12項生理生化鑒定，結果見圖1。

圖1 分離菌株的生理生化鑒定結果Fig.1 Physiological and biochemical identification results of isolated strains

由圖1可知，94個菌株均具有完全溶血環(huán)，呈β溶血性。其中，86個菌株顯示硝酸鹽還原反應呈陽性，93個菌株顯示VP反應呈陽性。說明大部分菌株具有硝酸鹽還原能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等物質(zhì)，且在糖代謝過程中能分解葡萄糖生成丙酮酸，與發(fā)酵豆制品中的蠟樣芽孢桿菌生理生化特性一致[5]。所有菌株均符合蠟樣芽孢桿菌的生理生化特征。

2.3 蠟樣芽孢桿菌分離菌株的毒力基因譜

蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)生腹瀉型或嘔吐型毒素。腸毒素hbl、腸毒素nhe、腸毒素entFM、細胞毒素cytK是引起腹瀉性疾病最主要的毒力因子，通過使細胞成孔作用引起疾病[2，4]。引起嘔吐疾病的毒素主要是環(huán)狀十二肽Cereulide，cesB與EM1是合成該毒素的相關基因，通過與5-HT3受體靶向結合刺激迷走神經(jīng)引起疾病[3]。蠟樣芽孢桿菌分離菌株的毒力基因譜結果見表3。

表3 分離菌株的毒力基因譜Table 3 Virulence gene profile of isolated strains

由表3可知，94個分離菌株都具有腹瀉型毒力基因，且所有菌株均無嘔吐毒素相關的合成基因。其中，5個辣椒醬樣品分離的39個菌株的毒力基因nheA（79%）、nheB（90%）、nheC（87%）、entFM（100%）的陽性率較高，與向婧姝等[24]所述結果一致。4個酸湯樣品分離的35個菌株的毒力基因及nheA（94%）、nheB（100%）、nheC（88%）、entFM（100%）陽性率較高，與辣椒醬樣品檢測結果一致。而2個毛豆腐樣品分離的20個菌株的毒力基因腸毒素hbl、nhe及entFM陽性率均較高，與發(fā)酵豆制品中的蠟樣芽孢桿菌的毒力基因陽性率較相似[5]。

蠟樣芽孢桿菌的毒力基因譜具有樣品差異性，大多分離菌株具有多重腹瀉毒力基因。腸毒素容易引發(fā)人體腹瀉、腹痛等癥狀，應當同時關注污染菌數(shù)及毒素產(chǎn)生量，預防食品中毒事件發(fā)生。糧食加工制品中容易存在嘔吐型蠟樣芽孢桿菌污染問題，尤其是米飯及其制品（米飯、米糕、米粉等），而辣椒醬、酸湯、毛豆腐產(chǎn)品的生產(chǎn)發(fā)酵環(huán)境并不適宜嘔吐型蠟樣芽孢桿菌生長。

2.4 分離菌株的RAPD分型

將94個分離菌株進行RAPD分型，結果見圖2。由圖2可知，94株菌株按聚類分析結果劃分A、B、C三大集群。A集群主要是辣椒醬樣品分離的菌株，B集群主要是辣椒醬樣品和白酸湯樣品分離的菌株，C集群主要是紅酸湯樣品和毛豆腐樣品分離的菌株。同一種類樣品的菌株聚類在同一集群中，說明蠟樣芽孢桿菌的多樣性與樣品差異性有關。辣椒醬樣品分離菌株多樣性較強，不同樣品分離的菌株相似度較低，分布在不同的集群。紅酸湯樣品和白酸湯樣品分離菌株的相似度較低，說明酸湯的原料、發(fā)酵條件差異可能導致污染的蠟樣芽孢桿菌不同。

圖2 分離菌株的RAPD模式樹狀圖Fig.2 RAPD pattern tree diagram of isolated strains

3 結論

本實驗研究了辣椒醬、酸湯、毛豆腐三類傳統(tǒng)發(fā)酵食品的蠟樣芽孢桿菌污染狀況，并分析了樣品分離菌株的生理生化特征、毒力基因和多樣性。辣椒醬樣品和酸湯樣品的蠟樣芽孢桿菌的檢出率均為100%，但污染菌數(shù)不高，菌數(shù)在3.6～460 MPN/g之間。毛豆腐樣品的蠟樣芽孢桿菌的檢出率為28.57%，其中夏季樣品的蠟樣芽孢桿菌菌數(shù)在7.25～7.39 lg（CFU/g）之間，秋季樣品經(jīng)GB 4789.14—2014《蠟樣芽孢桿菌檢驗》中的第一法及第二法均未檢出。毛豆腐樣品的蠟樣芽孢桿菌污染菌數(shù)差異較大，可能與樣品發(fā)酵條件、運輸方式有關，需要實地采樣并進行季節(jié)性分析。

從辣椒醬、酸湯和毛豆腐樣品中分離獲得94個菌株，經(jīng)生理生化鑒定均具有蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）特征。毒力基因分析顯示，來自于辣椒醬樣品和酸湯樣品的74個分離菌株的毒力基因均為腹瀉型，其中腸毒素nhe及entFM陽性率較高；來自于毛豆腐樣品的20個分離菌株，毒力基因均為腹瀉型，其中腸毒素hbl、nhe及entFM陽性率較高。RAPD分型結果顯示，蠟樣芽孢桿菌的多樣性與樣品差異性有關。辣椒醬樣品的分離菌株多樣性較強，不同樣品之間具有較大差異。紅酸湯樣品和白酸湯樣品分離菌株的相似度較低，表明酸湯的原料、發(fā)酵條件差異可能導致污染的蠟樣芽孢桿菌不同，而毛豆腐樣品的分離菌株相似度較高。