謝丹 歐陽石

廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院感染性疾病科，廣東高校生物靶向診治與康復重點實驗室（廣州 510515）

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是指在既往沒有慢性肝病的基礎上突發(fā)出現(xiàn)大量肝細胞死亡所致的一系列臨床綜合征的總稱，其發(fā)展過程迅速、預后較差，致死率較高（28 d 死亡率達32%），是肝病患者死亡的主要原因［1］。近年來研究表明ALF 的發(fā)生是由于致病因素（如病毒、細菌及藥物等）作為損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）或病原體相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），結合細胞表面的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）后激活細胞內(nèi)信號通路，切割半胱氨酸蛋白酶?1（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase?1），其經(jīng)過切割后變成Cleaved?Caspase?1，后者是前者的活化形式，組裝成炎癥小體，經(jīng)過一系列蛋白的激活，最終在細胞膜上形成孔隙，引發(fā)細胞腫脹直至破裂，釋放細胞內(nèi)容物及炎癥因子白介素（interleukin，IL）?1β、IL?18，進而趨化更多炎癥細胞的聚集，加重炎癥反應，這一過程被稱為細胞焦亡［2］。細胞焦亡作為一種新型細胞死亡方式，在近年來被認為是ALF 中常見的死亡方式［3］，并且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)能通過抑制肝細胞焦亡達到緩解ALF 肝損的目的［4-5］，因此被認為是ALF的潛在治療手段之一。

隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，干細胞移植稱為治療ALF 的新興方式［6-8］。而人臍帶來源的間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，ucMSCs）因低免疫原性、易獲取被認為是最合適的移植來源。近年來，ucMSCs 無論在臨床以及小鼠模型中均被證實具有減輕肝臟損傷，改善肝功能的作用［9?11］。深入研究發(fā)現(xiàn)ucMSCs 主要是通過旁分泌釋放的細胞外囊泡，即外泌體（ucMSCs?exosome，ucMSCs?exo）來發(fā)揮相應的調(diào)控作用。外泌體是一種直徑為30 ～ 150 nm 的雙層膜囊狀結構［12］，具有穩(wěn)定性、生物相容性、通透性等生物特性，被認為是細胞間傳遞信息的基本媒介［13］。已被證明ucMSCs?exo 所釋放的IL?10 可以通過抑制肝細胞焦亡達到減輕ALF 的肝損，從而起到治療的作用［14］。

ALF 在中醫(yī)領域認為濕熱蘊結是其始動病理因素且貫穿疾病全程，因此中醫(yī)治療ALF 常常以清熱祛濕、涼血化瘀為治療核心。茵陳蒿湯出自《傷寒雜病論》，由茵陳、大黃、梔子組成，具有清熱利濕、疏利肝膽功效，因此在中醫(yī)中常作為基礎方用于ALF 的治療［15］。而茵陳蒿湯是否能協(xié)同ucMSCs 及外泌體減少肝細胞死亡，尤其是肝細胞焦亡，從而達到緩解ALF 的肝損的能力尚未被探索，其次在ALF 中應用茵陳蒿湯協(xié)同ucMSCs?exo的中西醫(yī)結合治療手段也尚未被挖掘。因此，本研究擬通過探討茵陳蒿湯聯(lián)合ucMSCs 治療ALF的作用，并進一步探討ucMSCs?exo 發(fā)揮的抗肝細胞焦亡作用，為后續(xù)中西藥結合應用于臨床治療ALF 提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物/細胞 6 ～ 8 周齡SPF 級雄性C57BL/6小鼠50 只（廣州銳格生物科技有限公司），操作符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》規(guī)定及倫理要求。人肝細胞株LO2細胞（武漢普賽諾生命科技有限公司）；UcMSCs 在廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院倫理委員會批準及孕婦的知情同意的情況下，臍帶取自我院健康足月孕婦，并于2 h 內(nèi)送至我院前沿醫(yī)學交叉中心實驗室進行ucMSCs 的提取及制備。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院倫理委員會倫理審批（No.KY01?2021?09?09）。

1.2 藥物 茵陳蒿湯由茵陳18 g、梔子12 g、大黃6 g 構成。購自廣州醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院及藥店，將中藥顆?；旌蠑噭颍?jīng)過滅菌包裝成袋狀供實驗中使用。

1.3 主要試劑及儀器 流式抗體CD34?PE、CD45?FITC、CD29?PE、CD90?PE、CD44?PE、CD73?PE、CD105?PE（美國eBioscience 公司）；CD9 抗體、CD63 抗體、Caspase?1 抗體、Cleaved?Caspase?1 抗體（美國Santa Cruz 公司）；IL?1β、IL?18 ELISA 試劑盒（美國Thermo Fisher 公司）；D?氨基半乳糖（D?ga?lactosamine，D?GalN）、脂多糖（lipoplysaccharide，LPS）（美國Sigma 公司）；倒置顯微鏡（日本Olym?pus 公司）；透射電子顯微鏡（美國 Thermo Fisher 公司）；光學顯微鏡（美國 Thermo Fisher 公司）；全自動生化分析儀（德國Siemens 公司）；超低溫冰箱（美國Thermo scientific 公司）；納米顆粒追蹤分析儀（Nanoparticles Tracking Analysis，NTA）（德國Particle Metrix 公司）。

1.4 UcMSCs 的分離培養(yǎng)和鑒定 分離無菌臍帶中的華通膠，剪成大小約0.5 mm3的組織塊，在含有體積分數(shù)為10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d，達到80%貼壁后進行傳代。取第3 ～ 4 代ucMSCs 細胞懸液100 μL，倒置顯微鏡下觀察ucMSCs 細胞形態(tài)和分布，并在顯微鏡下計數(shù)。取ucMSCs 細胞懸液100 μL 在流式管中并分別加入人單克隆抗體CD34?PE、CD45?FITC、CD29?PE、CD90?PE、CD44?PE、CD73?PE、CD105?PE進行標記，流式細胞分析鑒定ucMSCs 的免疫表型，使用FlowJo 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 UcMSCs?exo 的提取和鑒定 收集第4 代ucMSCs 細胞培養(yǎng)上清液，使用PBS 反復離心重懸4 遍后，棄去上清液，其底部微量液體即為ucMSCs?exo。在室溫靜置2 min 后吸除多余液體，使用3%磷鎢酸溶液負染5 min，再吸干多余染液后室溫瀝干至電鏡下觀察ucMSCs?exo 形態(tài)。離子水、PBS 各洗滌ucMSCs?exo 混懸液1 遍，用NTA 鑒定外泌體的粒徑分布及濃度。Western blot 檢測ucMSCs?exo表面標志物CD63 和CD9 的表達。

1.6 動物分組及造模方法 6 ～ 8周雄性的C57BL/6 小鼠（22 ± 3 g）50 只，飼養(yǎng)在20℃ ～ 25℃，（50 ±5）%相對空氣濕度，每天更換飲用水、墊料及飼料，12 h 暗/光循環(huán)進行適應性喂養(yǎng)7 d。按照實驗要求將隨機小鼠分為模型組、茵陳蒿湯處理組、ucMSCs?exo 處理組、聯(lián)合處理組及正常對照組，每組10只小鼠。除正常對照組外，各組均根據(jù)體質量經(jīng)腹腔注射D?GalN（800 mg/kg）和LPS（10 μg/kg）建立小鼠肝衰模型。在此基礎上，茵陳蒿湯處理組按照120 mg/20 g 劑量的茵陳蒿湯灌胃，連續(xù)給藥3 d；ucMSCs?exo 組經(jīng)鼠尾靜脈注射100 μL ucMSCs?exo（1 μg/μL），連續(xù)注射3 d；聯(lián)合治療組則聯(lián)合茵陳蒿灌胃和尾靜脈注射ucMSCs?exo 干預3 d；模型組和正常對照組尾靜脈注射同等劑量PBS，連續(xù)注射3 d；觀察處理過程中各組小鼠體重、行為表現(xiàn)、轉氨酶改變等，由于造模劑量原因，造模期間有3 只小鼠死亡。給藥結束后12 h，頸椎脫臼處死小鼠，取血及肝組織用作后續(xù)實驗。

1.7 茵陳蒿湯含藥血清制備 茵陳蒿湯按原方生藥量36 g（茵陳18 g，大黃6 g，梔子12 g）合煎劑40 mL 為成人每日量，換算成小鼠每日灌胃劑量約為380 mg/100 g，末次給藥后12 h 取小鼠血清，用于后續(xù)體外實驗。

1.8 細胞分組及造模方法 將人肝細胞株LO2細胞隨機分為5 組：正常對照組、模型組、茵陳蒿湯處理組、ucMSCs?exo 組及聯(lián)合處理組。除正常對照組外，其余組的LO2細胞均在100 ng/mL LPS共孵育37 ℃、5% CO2過夜后再使用5 mmol/L ATP 刺激60 min 構建ALF 細胞模型；茵陳蒿湯處理組在造?；A上加10%茵陳蒿湯含藥血清干預；ucMSCs?exo 處理組在造模基礎上加入ucMSCs 提取的外泌體（終濃度10 μg/mL）；而聯(lián)合處理組則在造模基礎上加入茵陳蒿湯含藥血清處理的 ucMSCs 提取的外泌體（終濃度10 μg/mL）。在光學顯微鏡下觀察各組LO2細胞的形態(tài)及數(shù)量的變化。

1.9 檢測指標及方法

1.9.1 ALT 和AST 的測定 收集小鼠眶后靜脈血液1 mL，按照3 000 r/min，4 ℃離心10 min 后分離血清，通過全自動生化分析儀檢測ALT、AST 血清水平。

1.9.2 肝組織蘇木精-伊紅（hematoxylin?eosin，HE）染色 將小鼠肝組織剝離后于25%甲醛、10 ℃環(huán)境中固定、脫水，并包埋于石蠟中，進行切片，對切片進行常規(guī)HE 染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織的病理學表現(xiàn)。

1.9.3 流式細胞分析儀檢測LO2細胞凋亡率 通過A?FITC/A?PE 細胞凋亡試劑盒檢測LO2細胞凋亡率，流式細胞分析儀檢測各組細胞凋亡率。

1.9.4 Western blot 采集各組LO2細胞，提取蛋白后進行轉膜、封閉、洗膜。再分別加入Cleaved?Caspase?1、Caspase?1 的抗體，在封閉液中在4 ℃條件下孵育過夜。第2 天于室溫孵育二抗1 ～ 2 h 后應用1×TBST 洗滌PVDF 膜3 ～ 5 次，每次10 min。吸取適量發(fā)光液覆蓋PVDF 膜，在ECL 發(fā)光儀上進行曝光可視化。

1.9.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme?linked immu?nosorbnent assay，ELISA） 按照ELISA 試劑盒說明書步驟測定IL?1β、IL?18 的表達水平。用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD值）。

1.10 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。GraphPad 9.5 版進行相關繪圖工作。計量數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布采用獨立樣本t檢驗。多組間比較使用單因素方差分析（ANOVA）。P< 0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物的一般情況 正常對照組小鼠的活動正常，飲食、飲水及排便情況正常，皮毛光澤。而造模后的小鼠在造模后3 d 出現(xiàn)活動減少、反應遲鈍、大便干結、飲食較少、體質量下降。經(jīng)過不同藥物組干預后，小鼠上述癥狀有所好轉，其中聯(lián)合治療組小鼠癥狀改善最顯著。

2.2 UcMSCs 及其外泌體的鑒定 倒置顯微鏡觀察ucMSCs 的形態(tài)穩(wěn)定均一，并可見到呈典型的長梭形及漩渦狀排列（圖1）。流式細胞儀檢測P3代的ucMSCs 表面標記物CD29（99.9%）、CD90（100%）、CD44（100%）、CD73（100%）和CD105（99.5%）的表達量均在98%以上，而造血干細胞的表面標記CD34（1.89%）、CD45（7.14%）表達極低（圖2）。通過透射電子顯微鏡觀察提取的外泌體可見呈杯狀或類圓形、雙層膜的囊泡樣結構（圖3）。納米顆粒跟蹤分析鑒定其直徑在50 ～ 100 nm，峰值在107 nm，總占比在99%，粒子數(shù)為4.6E+6/mL（圖4A?B），并可見量測過程中的囊泡結構顯現(xiàn)（圖4C）。Weastern blot 鑒定外泌體表面標志物CD63、CD9 表達明顯高于上清液（圖4D，P< 0.05）。經(jīng)上述鑒定所提取的為高純度的ucMSCs 和外泌體，用于后續(xù)實驗。

圖1 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的ucMSCs 形態(tài)學顯微鏡觀（× 200）Fig.1 Morphological microscopic view of ucMSCs cultured in serum-free medium （× 200）

圖2 UcMSCs 表面標記物表達情況Fig.2 UcMSCs surface marker expression

圖3 透射電子顯微鏡下外泌體成像（左200 nm；右50 nm）Fig.3 Transmission electron microscopy imaging of exosomes （Left 200 nm； Right 50 nm）

圖4 外泌體的鑒定Fig.4 Identification of exosomes

2.3 茵陳蒿湯聯(lián)合ucMSCs?exo 對體外ALF 模型的影響 在光鏡下觀察不同處理組LO2細胞表現(xiàn)。正常對照組中肝細胞形態(tài)大小均一，呈多邊形，分布均勻，分界清楚，胞內(nèi)未見明顯空泡樣改變（圖5A）。而模型組的LO2細胞體積變小，形態(tài)不規(guī)則，胞漿內(nèi)有大小不等的圓形空泡，有氣泡狀突出物，細胞間分界不清晰（圖5B）。而茵陳蒿湯治療組及聯(lián)合ucMSCs?exo 治療組中僅有少量肝細胞損傷、壞死、空泡，其中聯(lián)合組損傷最輕（圖5C?D）。通過流式檢測各組中肝細胞死亡率，其中模型組（7.99%）（圖6B）和茵陳蒿湯治療組（8.33%）（圖6C）的肝細胞死亡率最高，而聯(lián)合治療組（4.33%）（圖6D）死亡率顯著下降（P< 0.05），并與正常對照組（4.08%）（圖6A）相似。

圖5 光學顯微鏡觀察肝細胞形態(tài)（× 200）Fig.5 Hepatocyte morphology observed by light microscope （× 200）

圖6 流式檢測肝細胞死亡率Fig.6 Flow assay for hepatocyte mortality rate

2.4 茵陳蒿湯聯(lián)合ucMSCs?exo 對肝細胞焦亡的作用 通過Western blot 檢測各組中焦亡相關蛋白Caspase?1 和Cleaved?Caspase?1 的表達水平。結果顯示，與模型組（Model）相比，ucMSCs?exo 治療組（ucMSCs）、茵陳蒿湯治療組（Medicine）及聯(lián)合治療組（Combination）的Caspase?1 水平相較無明顯差異（P> 0.05），而各組的Cleaved?Caspase?1 表達明顯下降（P< 0.05）（圖7A），其中聯(lián)合治療組下降的最顯著。ELISA 檢測各組IL?1β、IL?18 的表達情況。對比模型組，ucMSCs?exo 治療組、茵陳蒿湯治療組、聯(lián)合治療組的IL?1β、IL?18 表達水平均有相應的下降（P< 0.05），其中聯(lián)合治療組下降的最顯著，抗肝細胞焦亡效果最佳（P< 0.05）（圖7B）。

圖7 各治療組對肝細胞焦亡的影響Fig.7 Effect of each treatment group on hepatocyte pyroptosis

2.5 茵陳蒿湯聯(lián)合ucMSCs?exo 對ALF 小鼠血清中ALT、AST 的影響 與模型組相比，ucMSCs?exo組、茵陳蒿湯組、聯(lián)合組的ALT、AST 均顯著下降（P< 0.05），其中聯(lián)合組的ALT 及AST 水平下降的最多（P< 0.05）。但相較于正常對照組而言，各組的ALT、AST 均增高（P< 0.05）（圖8）。

圖8 肝衰造模后12 h 各處理組小鼠血清ALT、AST 表達情況Fig.8 Serum ALT and AST expression in mice in each treatment group 12 h after liver failure modeling

2.6 茵陳蒿湯聯(lián)合ucMSCs?exo 對ALF 小鼠肝臟病理學的影響 通過HE 染色可見正常對照組小鼠肝小葉界限分明，肝細胞呈條索樣排列，未見炎癥細胞的浸潤及壞死組織、膠原纖維的沉積（圖9E）。而模型組的肝組織結構紊亂、破裂、缺失，肝竇、肝索分界不清，肝細胞大片變性壞死，可見深紫色炎癥細胞的浸潤及壞死的細胞碎片，符合ALF 小鼠模型的病理特點（圖9A）。與模型組對比，茵陳蒿湯治療組及ucMSCs 治療組可見肝索樣肝細胞排列，部分匯管區(qū)有深紫色炎癥細胞的浸潤，整體肝臟破壞程度輕于模型組（圖9B?C）。而聯(lián)合治療組的肝索排列相對整齊，肝細胞壞死程度明顯減少，存在散在少量壞死細胞，未見明顯炎癥細胞浸潤（圖9D）。

圖9 不同處理組小鼠肝臟病理變化（× 200）Fig.9 Pathological changes of liver in different treatment groups（× 200）

3 討論

茵陳蒿湯作為治療濕熱黃疸之主方［15］，在現(xiàn)代醫(yī)學研究中已被證實對ALF 具有一定的治療效果［15-16］?，F(xiàn)代藥理學研究分析顯示，茵陳蒿湯中的大黃其主要有效成分為蒽醌衍生物，能通過增強淋巴細胞的免疫功能及膽汁的排放，從而降低血清ALT、AST，起到治療ALF 的作用［17］。另外茵陳的有效成分6，7?二甲氧基香豆素能夠抑制血清中IL?6 和Toll 樣受體4（Toll?like receptor 4，TLR4）的表達，抑制肝臟炎癥，起到保肝作用［18］。因此茵陳蒿湯在拆分的藥理學基礎及整體應用均表現(xiàn)出抑制肝細胞凋亡、抗肝臟炎癥、調(diào)整免疫狀態(tài)的作用，從而發(fā)揮保肝作用，以達到治療ALF 的效果。然而，根據(jù)ALF 的整個發(fā)病過程中所對應到的中醫(yī)證候而言，其分布復雜，并且病情演變迅速，故單純的中醫(yī)治療應用于ALF 的治療仍存在一定的局限性。并且由于中藥的成分特殊，作用機制復雜，在一定程度上也限制了中藥的應用。而結合現(xiàn)代醫(yī)學研究，應用干細胞及其囊泡作為中草藥物載體不僅為中藥應用提供了新的方向，也能為中藥具體作用機制研究提供了新的思路。

此外，研究發(fā)現(xiàn)中藥可以干預外泌體內(nèi)生物活性物質的表達而改變其含量，在疾病發(fā)生發(fā)展或治療中發(fā)揮作用。中藥與外泌體間的調(diào)控作用主要分為4 種：中藥改變外泌體釋放的數(shù)量；中藥改變外泌體內(nèi)容物含量；中藥介導外泌體結構改變；外泌體作為中藥的載體［19］。因此作為中華民族優(yōu)秀傳統(tǒng)文化的瑰寶之一的中藥，也跟隨現(xiàn)代醫(yī)學研究的發(fā)展和進步，被應用到干細胞外泌體治療疾病的領域中［19］。因此應用中藥作用于干細胞及其外泌體所發(fā)揮的協(xié)同作用在臨床疾病治療方面具有一定的可行性。

研究發(fā)現(xiàn)ucMSCs?exo 通過釋放胰島素樣生長因子結合蛋白6（angiogenin，insulin?like growth factor?binding protein 6，IGFBP?6）至ALF 小鼠肝組織中，有效的提高了小鼠的生存率，并抑制肝細胞凋亡［20］。但是由于干細胞的多向分化性，單純的干細胞及其外泌體容易受到復雜的宿主微環(huán)境的影響，塑造出不同的干細胞及其功能，導致治療過程中不可控的風險大大增加［21?23］。而中藥所作用的外泌體不僅能夠改變外泌體內(nèi)容物的含量及結構，還能作為中藥的藥物載體改變中藥溶解度低、生物利用度低、作用過程長、毒副作用較明顯等缺點，實現(xiàn)精準轉運、靶向作用，能克服ucMSCs?exo 的不可控性風險，從一定程度上發(fā)揮協(xié)同治療作用。

在本研究中，ALF 體外模型內(nèi)可見茵陳蒿湯聯(lián)合ucMSCs?exo 治療組抑制肝細胞死亡的作用明顯優(yōu)于單一治療組，且通過檢測肝細胞焦亡相關蛋白Cleaved?Caspase?1 及焦亡相關細胞因子IL?1β、IL?18 的表達也顯現(xiàn)出茵陳蒿湯及ucMSCs?exo 對肝細胞焦亡的抑制作用，其中聯(lián)合治療所發(fā)揮的協(xié)同效應所對應的治療效果、抗肝細胞焦亡作用最顯著。并且ALF 體內(nèi)小鼠模型驗證兩者的協(xié)同作用。本研究應用的LPS/D?GalN 構建的ALF 小鼠模型被認為是造成溫病熱毒血瘀證的動物模型［24］，且LPS/D?GalN 誘導的肝損小鼠模型也是公認的ALF 小鼠模型［25］。本研究從肝臟病理、血清學AST 及ALT 兩方面對比均反映聯(lián)合治療組的抗肝損作用顯著優(yōu)于單一茵陳蒿湯或單一ucMSCs?exo 治療組。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯聯(lián)合ucMSCs?exo 能夠抑制肝細胞焦亡，改善肝臟損傷，為茵陳蒿湯聯(lián)合ucMSCs?exo 治療ALF 提供理論和實驗依據(jù)。

【Author contributions】XIE Dan performed the experiments and wrote the article.OUYANG Shi and XIE Dan revised the article.OUY?ANG Shi designed the study.OUYANG Shi reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.