李少英 何健淳 趙耿燁 冼嘉嘉 黃玲玲 何文智 馬曉燕 張慧敏 張敏聰 黎青

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，婦研所實(shí)驗(yàn)部 （廣州 510150）

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（survival mo?tor neuron gene 1，SMN1）突變導(dǎo)致SMN 蛋白功能缺陷所致的遺傳性神經(jīng)肌肉病，為常染色體隱性遺傳［1-3］。發(fā)病率為1/10 000 ～ 1/6 000，攜帶率為1/85 ～ 1/35［4-7］。

SMN基因（survival motor neuron）位于染色體5q11.2 ～ q13.3 上，全長約為27 kb，含有9 個(gè)外顯子，人基因組有兩個(gè)緊鄰的高度同源的SMN 基因，為SMN1基因（survival motor neuron gene 1，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1）與SMN2基因（survival motor neu?ron gene 2，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因2），SMN1是主要功能基因，該基因突變可導(dǎo)致SMA 發(fā)?。?-9］，SMN2為臨床表型的調(diào)節(jié)基因，影響病情的嚴(yán)重程度，其拷貝數(shù)增加可減輕SMA 表型［10-12］。臨床上，SMA診斷以分子遺傳學(xué)檢測為基礎(chǔ)。當(dāng)患者因典型臨床癥狀被懷疑為SMA 時(shí)，應(yīng)當(dāng)首先考慮進(jìn)行基因檢測，基因檢測結(jié)果明確的無須再進(jìn)行肌活檢。約95%的SMA 患者由SMN1基因外顯子7、8 純合缺失導(dǎo)致，或只存在外顯子7 純合缺失。大多數(shù)患者的缺失遺傳自父母，有2%的患者SMN1兩個(gè)等位基因中的一個(gè)出現(xiàn)了新發(fā)缺失。有3% ～ 4%的病例，SMN1一個(gè)等位基因缺失，而另一個(gè)則出現(xiàn)了其他類型的突變［2-3］。目前已報(bào)道的檢測技術(shù)眾多，如SMN基因拷貝數(shù)檢測常見的方法有PCR 結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法、定量聚合酶鏈反應(yīng)法（qPCR）、二代測序法（NGS）及多重連接探針擴(kuò)增法（MLPA）［13-22］；點(diǎn)突變技術(shù)有二代和三代測序［19-20，23-24］；而SMN1基因2+0 型變異目前仍沒有直接檢測方法。間接方法有：采用三代測序平臺(tái)通過單倍型分析，推測受試者是否為2+0 型攜帶，因其研究的樣本數(shù)量相對(duì)較少，從單倍型分析中得結(jié)果仍有待進(jìn)一步研究［23-24］；采用滴式數(shù)字PCR 平臺(tái)，通過單精子檢測SMN1基因拷貝數(shù)，推算受試者是否為2+0 型攜帶，該方法只適用于男性受試者［25］。目前已報(bào)道的眾多的檢測技術(shù)均存在一定的局限性。由于SMN基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，且約95%為缺失型變異基因致病特點(diǎn)，SMN基因拷貝數(shù)檢測已成為SMA 檢測的首選方法。SMN基因拷貝數(shù)檢測常見的方法性能有所差異。其中，MLPA 技術(shù)目前被認(rèn)為是定量SMN1和SMN2拷貝數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)方法［21-22］。但MLPA 因試劑非國產(chǎn)化，其耗材貴、操作步驟較復(fù)雜和檢測時(shí)間長等缺點(diǎn)限制其在臨床中的應(yīng)用。然而，以上的其他方法對(duì)于檢測SMN1和SMN2從0 ～ 4 的拷貝數(shù)均存在一定局限性［13-21］。

以熒光PCR-毛細(xì)管電泳（PCR/CE）為基礎(chǔ)的SMN1和SMN2基因檢測技術(shù)，比MLPA 技術(shù)快速、簡便，且為國產(chǎn)化試劑。在本研究中，我們同時(shí)采用PCR/CE 技術(shù)和MLPA 技術(shù)，對(duì)337 個(gè)樣本的SMN1和SMN2拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，比較其方法的性能。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇自2010-2022年，就診于本院生殖醫(yī)學(xué)中心和產(chǎn)前診斷中心的患者共337 例，其中115 例為SMA 患兒或有SMA 家族史的患者，222 例為接受SMN1基因篩查的患者，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書，授權(quán)醫(yī)院在去掉所有個(gè)人信息后，檢測數(shù)據(jù)可供研究參考。本研究通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：醫(yī)倫專審［2021］第254 號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 一致性分析 應(yīng)用PCR/CE 方法與MLPA 法對(duì)同一樣本在各自檢測流程上進(jìn)行平行測定，對(duì)兩者檢測結(jié)果進(jìn)行一致性分析，在試驗(yàn)操作過程中及判定結(jié)果時(shí)采用盲法，并將結(jié)果填入病例報(bào)告表中，用于統(tǒng)計(jì)分析。檢測結(jié)果以MLPA 方法檢測結(jié)果為最終檢測結(jié)果。

1.2.2 DNA 的提取 采用QIAmp DNA mini kit（QIAGEN，德國）快速DNA 提取試劑盒提取DNA樣本。

1.2.3 MLPA法 采用SALSA probe mix P021（MRC Holland）［2-4］，經(jīng)變性、雜交、連接反應(yīng)、PCR 反應(yīng)和ABI 3500 遺傳分析儀毛細(xì)管電泳分析產(chǎn)物，試驗(yàn)檢測過程中各檢測方法的參數(shù)設(shè)定、檢測及結(jié)果判定均嚴(yán)格遵循相應(yīng)的說明書或操作說明。

1.2.4 PCR/CE 方法 人類SMN1和SMN2基因檢測試劑盒（熒光PCR-毛細(xì)管電泳法）（廈門百歐迅生物科技有限公司），經(jīng)PCR 反應(yīng)和ABI 3500 遺傳分析儀毛細(xì)管電泳分析產(chǎn)物，試驗(yàn)檢測過程中各檢測方法的參數(shù)設(shè)定、檢測及結(jié)果判定均嚴(yán)格遵循相應(yīng)的說明書或操作說明。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用4 × 4 交叉表用SPSS（19.0版）軟件分別統(tǒng)計(jì)SMN1 和SMN2 基因0、1、2、3、≥ 4檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

共檢測337例樣本，1例因MLPA法檢測結(jié)果無法按照說明書判讀剔除，經(jīng)PCR/CE 方法與MLPA法檢測并有完整的檢測結(jié)果的樣本共336 例，其中純合缺失型（患者）50 例（14.9 %），雜合缺失型（攜帶者）65 例（19.3%），無缺失型221 例（65.8%）。熒光PCR-毛細(xì)管電泳法試劑檢出SMN1和SMN2基因拷貝數(shù)為0、1、2、3、≥ 4 的結(jié)果與MLPA 方法檢測結(jié)果完全一致。見表1。336 例樣本采用4×4 交叉表用SPSS 軟件分別統(tǒng)計(jì)SMN1和SMN2基因0、1、2、3 ≥ 4 檢測結(jié)果，Kappa：1，總符合率：100%，見表2-5。

表1 PCR/CE 法與MLPA 法檢測各不同樣本類型結(jié)果匯總表Tab.1 Summary of results for different sample types Detected by PCR/CE and MLPA

表2 SMN1 基因外顯子7 檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Tab.2 Statistical analysis of SMN1 gene exon 7 detection results

表3 SMN1 基因外顯子8 檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Tab.3 Statistical analysis of SMN1 gene exon 8 detection results

表4 SMN2 基因外顯子7 檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Tab.4 Statistical analysis of SMN2 gene exon 7 detection results

表5 SMN2 基因外顯子8 檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Tab.5 Statistical analysis of SMN2 gene exon 8 detection results

3 討論

SMA 基因診斷的結(jié)果應(yīng)用于區(qū)分患者、攜帶者及正常人，對(duì)患者進(jìn)行臨床分型及病情評(píng)估，解釋疾病的發(fā)生發(fā)展，開展藥物治療、多學(xué)科管理和定期隨訪，以延長患者生存周期、提高運(yùn)動(dòng)功能、延緩和減輕并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［10］。同時(shí)，為患者及家庭提供遺傳咨詢，包括遺傳病因、傳遞模式、再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、產(chǎn)前診斷或植入前遺傳學(xué)檢測等再生育選擇以及家庭成員攜帶者篩查建議等相關(guān)信息和指導(dǎo)。

SMA 基因診斷原則建議同時(shí)報(bào)告SMN1和SMN2的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)分析包括SMN1和SMN2的外顯子7 和8［10］。由于基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，且約95%為缺失型變異基因致病特點(diǎn)，SMN基因拷貝數(shù)檢測為已成為SMA 檢測的首選方法。

PCR-RFLP 方法有酶切不徹底的隱患，在臨床上只能診斷SMN1純合缺失的患者，不能檢測SMN拷貝數(shù)。qPCR技術(shù)現(xiàn)已成為分子診斷領(lǐng)域的重要技術(shù)，其操作簡單、快速經(jīng)濟(jì)、靈敏度高、高通量等優(yōu)勢，在SMN基因拷貝數(shù)檢測中愈加受到重視［14］。其根據(jù)采用不同的熒光技術(shù)分為兩類：TaqMan 系統(tǒng)和SYBR Green 系統(tǒng)。但因設(shè)備型號(hào)差異而無統(tǒng)一的操作技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，所以qPCR 在臨床應(yīng)用的穩(wěn)定性還有待提高［14-15］。NGS 技術(shù)，相對(duì)于一代測序技術(shù)，有著更高數(shù)量級(jí)的測序通量，所以也稱之為高通量測序，多應(yīng)用于SMA 與其他表型易混淆的肌肉疾病初篩，另外在SMN2拷貝數(shù)分析方面，NGS還有待更多的證據(jù)證明其準(zhǔn)確性和可靠性。已有大量的研究數(shù)據(jù)表明NGS 可以直接計(jì)算SMN1拷貝數(shù)，但篩查或診斷SMN1微小變異仍存在很大困難，目前在我國，NGS 尚未成為SMA 的常規(guī)檢測方法。MLPA 技術(shù)是一種高效、特異的基因檢測技術(shù)，其包含SMN區(qū)域和其他染色體上的許多對(duì)照探針，可以用于SMN 基因的總拷貝數(shù)參考或系統(tǒng)質(zhì)量控制，因此，用MLPA 分析SMN 基因拷貝數(shù)比其他方法更準(zhǔn)確、更有效，該技術(shù)除明確區(qū)分患者、攜帶者及正常人，同時(shí)檢測患者的SMN2拷貝數(shù)，是目前臨床上SMA 基因檢測金標(biāo)準(zhǔn)［21-22］。但MLPA 因試劑非國產(chǎn)化，其耗材貴、操作步驟較復(fù)雜和檢測時(shí)間長等缺點(diǎn)限制其在臨床中的應(yīng)用。

PCR/CE法適用于人樣本中SMN1基因和SMN2基因第7 號(hào)外顯子和第8 號(hào)外顯子拷貝數(shù)（0、1、2、3、≥ 4）的檢測，用于SMA 的輔助診斷。與目前臨床上SMA 診斷金標(biāo)準(zhǔn)MLPA 技術(shù)比較。本次試驗(yàn)336 例樣本中，SMN1基因外顯子7 拷貝數(shù)分布0、1、2、3 的樣本分別為50 例、65 例、211 例、10 例；本中心50 例純合缺失型均為患者，65 例雜合缺失型受試者均為攜帶者，無復(fù)合雜合突變型患者，無缺失型221 例，SMN1基因陽性樣本占全部研究樣本的34.2%；SMN2基因外顯子7拷貝數(shù)檢測的準(zhǔn)確性在全部人群中進(jìn)行考察，0、1、2、3、≥ 4 的樣本分別為6 例、78 例、197 例、56 例、9 例；在熒光PCR/CE法試劑檢測范圍內(nèi)，其檢測結(jié)果與MLPA 方法檢測結(jié)果完全一致。TAN 等［17］評(píng)價(jià)了qPCR、滴式數(shù)字PCR、高分辨率熔融分析、PCR/CE 法和MLPA 五種方法在SMA 篩查中的檢測性能，其得出的結(jié)論是以上方法中PCR/CE 法是最可靠的方法，在定量SMN1和SMN2的拷貝數(shù)方面與MLPA 具有良好的一致性，與我們本次研究的結(jié)果相符。方玉琴等［18］報(bào)道了CE 法在單基因病攜帶者篩查應(yīng)用中是一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。

綜上所述，本研究PCR/CE 法試劑產(chǎn)品設(shè)計(jì)與目前臨床上SMA 基因拷貝數(shù)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法MLPA 完全一致，可同時(shí)檢測SMN1和SMN2基因外顯子7 和8，且可相對(duì)定量至4 拷貝，結(jié)果可靠并可獲得完整的基因信息，本次研究納入的336 例合格樣本檢測結(jié)果表明，PCR/CE 法試劑檢測SMN1和SMN2各基因不同拷貝數(shù)檢測結(jié)果總符合率均為100%，且具有簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)。適用于SMA 缺失型患者的輔助診斷和1+0 型攜帶者檢測，其檢出率約95%。但該方法存在一定局限性，其不能檢出SMN1基因內(nèi)點(diǎn)突變以及2+0 型攜帶者。未來需要研究開發(fā)可以檢測單核苷酸變化的PCR/CE 法，以更適用于適用于SMA 輔助診斷和攜帶者檢測。

【Author contributions】LI Shaoying performed the experiments and wrote the article.HE Jianchun，ZHAO Gengye，XIAN Jiajia，HUANG Lingling，ZHANG Huimin and ZHANG Mincong performed the ex?periments.HE Wenzhi and MA Xiaoyan revised the article.LI Qing designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.