王素亭，彭琰琰，韓雪，任燕，葛國嵐，潘丹萍，高國財

（1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院兒科，鄭州 450001；2.鄭州大學附屬兒童醫(yī)院中醫(yī)科，鄭州 450000）

多發(fā)性抽動癥（TS）是兒童中最常見的精神和運動障礙疾病。其臨床表現為多發(fā)性運動和語音抽動，常伴有注意缺陷多動障礙、情緒障礙和強迫癥，部分癥狀可持續(xù)至成年[1]。TS 的病因和發(fā)病機制仍不清楚。既往研究表明，TS 的病因與遺傳因素、環(huán)境因素、神經炎癥、多巴胺系統(tǒng)、神經元凋亡等因素密切相關[2-4]。雖然近年來TS 的治療范圍不斷擴大，但目前的治療策略往往不盡如人意，且不良反應較多[5]。因此，有必要尋求新的治療方法和藥物。升清降濁制動顆粒是由酒大黃、生白芍、生甘草、僵蠶、蟬蛻、片姜黃組成的中藥顆粒，已有研究報道，升清降濁制動顆粒可明顯提高TS 患兒臨床癥狀及體征的改善效果，且藥物不良反應明顯減少[6]。以上研究表明，升清降濁制動顆?？捎糜谥委烼S。但具體機制尚不完全明確。相關研究顯示，抑制Janus 激酶2（JAK2）/信號轉導和轉錄激活子3（STAT3）通路可減輕TS 大鼠的神經炎癥[7]。而升清降濁制動顆粒對TS 大鼠的保護作用是否與調控JAK2/STAT3 信號通路有關尚不可知。因此，本研究主要探究升清降濁制動顆粒對TS 大鼠神經炎癥、多巴胺系統(tǒng)相關因子及神經元凋亡的影響以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 84 只，6 周齡體質量為200～210 g的雄性SD 大鼠購自廣東萊迪生物醫(yī)藥研究院有限公司，生產許可證號為SCXK（粵）2022-0064。所有動物實驗獲得本院動物倫理委員會的批準。

1.2 主要試劑 升清降濁制動顆粒由僵蠶、蟬蛻、片姜黃、酒大黃、全蝎、生白芍、生甘草。按照7 種藥物30∶12∶9∶6∶6∶30∶15 的比例配制而成。亞氨基二丙腈（貨號：111-94-4）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氟哌啶醇（貨號：14202011317）購自寧波大紅鷹藥業(yè)股份有限公司；JAK2 通路激活劑Coumermycin A1（貨號：C9451）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；大鼠白細胞介素（IL）-1β（貨號：E-UNEL-R0028）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，貨號：E-EL-M3063）、IL-6 （貨號：E-EL-M0044c）、大鼠多巴胺（DA，貨號：E-EL-0046c）、多巴胺轉運蛋白（DAT，貨號：E-EL-0052c） 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 試劑盒及DNA 缺口末端標記法（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：E-CK-A320）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；多巴胺D2 受體（DRD2）ELISA 試劑盒（貨號：SEA673Ra）購自武漢云克隆科技股份有限公司；兔源一抗p-JAK2 （貨號：ab32101）、p-STAT3（貨號：ab267373）、JAK2（貨號：ab108596）、STAT3（貨號：ab68153）、GAPDH（貨號：ab9485）及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（貨號：ab172730）均購自英國Abcam 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 TS 大鼠模型的構建及分組 采用連續(xù)7 d腹腔注射150 mg/（kg·d） 亞氨基二丙腈的方式構建TS 大鼠模型[8]，對照組大鼠則連續(xù)7 d 腹腔注射等量的生理鹽水。從造模開始第4 天起，若大鼠出現頭動、急速旋轉、跳躍、挖洞等刻板行為，則視為造模成功。按照隨機數字表法將SD 大鼠隨機分為對照組、TS 組、升清降濁制動顆粒低劑量組（SQJZZDL 組）、升清降濁制動顆粒高劑量組（SQJZZD-H 組）、氟哌啶醇組、Coumermycin A1 （JAK2 通路激活劑）組、升清降濁制動顆粒高劑量+Coumermycin A1 組（SQJZZD-H+Coumermycin A1 組），每組12 只。除對照組外，其他組大鼠均需構建TS 模型。建模成功后，升清降濁制動顆粒低劑量組、升清降濁制動顆粒高劑量組[9]、氟哌啶醇組[10]大鼠分別需灌胃0.645 mg/kg 升清降濁制動顆粒、2.58 mg/kg 升清降濁制動顆粒、200 μg/kg 氟哌啶醇，且均需尾靜脈注射等量的生理鹽水；Coumermycin A1 組[11]大鼠需尾靜脈注射4 mg/kg Coumermycin A1 且需灌胃等量的生理鹽水；升清降濁制動顆粒高劑量+Coumermycin A1 組大鼠需灌胃2.58 mg/kg 升清降濁制動顆粒且尾靜脈注射4 mg/kg Coumermycin A1；對照組、TS 組大鼠均需灌胃等量的生理鹽水和尾靜脈注射等體積的生理鹽水，給藥每日1 次，持續(xù)21 d。

1.3.2 標本收集 末次處理24 h 后，每組選取所有大鼠進行運動行為評分、刻板行為評分；行為評分結束后，2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），收集血清，用于IL-1β、TNF-α、IL-6 水平的檢測；血清收集后，解剖大鼠分離紋狀體，將紋狀體分為2 部分（每部分包含每組6 只大鼠的紋狀體），一部分固定于4%多聚甲醛中用于TUNEL 染色，另一部分凍存于-80 ℃中用于DA、DAT、DRD2 含量及p-JAK2、p-STAT3蛋白水平的檢測。

1.3.3 大鼠運動行為評分檢測 運動行為評分標準為：0 分表示正常活動；1 分表示過度興奮；2 分表示存在探究行為和不連續(xù)的吸鼻聲；3 分表示跑動不間斷；4 分表示不間斷跑動且伴有驚跳。

1.3.4 大鼠刻板行為評分檢測 刻板行為評分標準為：0 分表示無刻板運動；1 分表示軀體存在旋轉行為；2 分表示頭頸部運動過多；3 分表示頭頸部運動過多且伴有旋轉行為；4 分表示頭向側擺，并伴有頭頸部運動過多。

1.3.5 ELISA 檢測血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 水平及紋狀體中DA、DAT、DRD2 含量 嚴格按照試劑盒說明書檢測大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 水平及紋狀體中DA、DAT、DRD2 含量。

1.3.6 TUNEL 染色檢測大鼠紋狀體中神經元凋亡取4%多聚甲醛固定紋狀體進行包埋，切片，切片脫蠟，水化，蛋白酶K 消化，末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT 酶）孵育，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核，封片后，用熒光顯微鏡觀察神經元凋亡情況并拍照。

1.3.7 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測大鼠紋狀體中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達 取紋狀體，加入RIPA 裂解液經組織研磨儀勻漿研磨紋狀體提取總蛋白。采用2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉法測定總蛋白濃度，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉，一抗p-JAK2（1∶2 000）、p-STAT3（1∶2 000）、JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃下孵育過夜。然后與二抗（1∶2 000）在室溫下孵育1 h 后PBST 緩沖液洗膜3 次。加入ECL 發(fā)光試劑后在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中成像拍照，使用Image Lab 5.0 軟件分析蛋白質條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH 的比值表示蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，以符合正態(tài)分布的數據以均數±標準差（±s）表示。多組間的差異比較采用單因素方差分析，進一步兩兩差異比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 升清降濁制動顆粒對各組大鼠運動行為評分、刻板行為評分的影響 與對照組比較，TS 組大鼠運動行為評分、刻板行為評分升高（P＜0.05）；與TS 組比較，升清降濁制動顆粒低劑量組、升清降濁制動顆粒高劑量組、氟哌啶醇組大鼠運動行為評分、刻板行為評分降低（P＜0.05）；與TS 組比較，Coumermycin A1 組大鼠運動行為評分、刻板行為評分升高（P＜0.05）；與升清降濁制動顆粒高劑量組比較，升清降濁制動顆粒高劑量+Coumermycin A1 組大鼠運動行為評分、刻板行為評分升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠運動行為評分、刻板行為評分比較（±s）Tab.1 Comparison of motor behavior score and stereotyped behavior score of rats in each group（±s）分

表1 各組大鼠運動行為評分、刻板行為評分比較（±s）Tab.1 Comparison of motor behavior score and stereotyped behavior score of rats in each group（±s）分

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TS 組比較，#P＜0.05；與SQJZZDL 組比較，△P＜0.05；與SQJZZD-H 組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 運動行為評分 刻板行為評分對照組 12 0.43±0.06 0.12±0.01 TS 組 12 3.15±0.14* 3.23±0.11*SQJZZD-L 組 12 2.42±0.12# 1.88±0.14#SQJZZD-H 組 12 0.96±0.08#△ 0.79±0.06#△氟哌啶醇組 12 0.97±0.09#△ 0.77±0.05#△Coumermycin A1 組 12 3.83±0.14# 3.92±0.07#SQJZZD-H+Coumermycin A1 組 12 1.75±0.12▲ 1.45±0.11▲

2.2 升清降濁制動顆粒對各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 水平的影響 與對照組比較，TS 組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與TS 組比較，升清降濁制動顆粒低劑量組、升清降濁制動顆粒高劑量組、氟哌啶醇組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05）；與TS 組比較，Coumermycin A1 組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）；與升清降濁制動顆粒高劑量組比較，升清降濁制動顆粒高劑量+Coumermycin A1組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 水平比較（±s）Tab.2 Comparison of IL-1β，TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（±s） pg/mL

表2 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 水平比較（±s）Tab.2 Comparison of IL-1β，TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（±s） pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TS 組比較，#P＜0.05；與SQJZZD-L組比較，△P＜0.05；與SQJZZD-H 組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 IL-1β TNF-α IL-6對照組 12 94.45± 3.77 35.54± 1.34 46.63± 1.89 TS 組 12 373.68±15.59* 219.23±10.66* 178.85± 8.45*SQJZZD-L 組 12 302.25±11.41# 168.82± 7.37# 132.29± 5.67#SQJZZD-H 組 12 123.35± 5.06#△ 72.25± 3.41#△ 69.68± 3.23#△氟哌啶醇組 12 120.86± 4.98#△ 70.88± 3.39#△ 68.81± 3.14#△Coumermycin A1 組 12 423.26±18.86# 255.46±11.32# 229.36±10.05#SQJZZD-H+Coumermycin A1 組12 295.57±12.28▲143.34± 6.18▲108.54± 4.16▲

2.3 升清降濁制動顆粒對各組大鼠紋狀體中DA、DAT、DRD2 含量的影響 與對照組比較，TS 組大鼠紋狀體中DA、DAT 含量降低，DRD2 含量升高（P＜0.05）；與TS 組比較，升清降濁制動顆粒低劑量組、升清降濁制動顆粒高劑量組、氟哌啶醇組大鼠紋狀體中DA、DAT 含量升高，DRD2 含量降低（P＜0.05）；與TS 組比較，Coumermycin A1 組大鼠紋狀體中DA、DAT 含量降低，DRD2 含量升高（P＜0.05）；與升清降濁制動顆粒高劑量組比較，升清降濁制動顆粒高劑量+Coumermycin A1 組大鼠紋狀體中DA、DAT含量降低，DRD2 含量升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠紋狀體中DA、DAT、DRD2 含量比較（±s）Tab.3 Comparison of DA，DAT and DRD2 contents in striatum of rats in each group（±s） pg/mL

表3 各組大鼠紋狀體中DA、DAT、DRD2 含量比較（±s）Tab.3 Comparison of DA，DAT and DRD2 contents in striatum of rats in each group（±s） pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TS 組比較，#P＜0.05；與SQJZZDL 組比較，△P＜0.05；與SQJZZD-H 組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 DA DAT DRD2對照組 6 108.82±4.31 145.58±6.12 325.56±14.43 TS 組 6 52.26±2.37* 46.67±2.11* 465.54±21.14*SQJZZD-L 組 6 69.73±3.15# 79.93±3.76# 403.32±18.85#SQJZZD-H 組 6 94.46±4.78#△ 128.85±5.84#△342.45±15.56#△氟哌啶醇組 6 95.58±4.83#△ 130.05±5.79#△340.17±14.89#△CoumermycinA1 組 6 41.17±1.92# 35.85±1.67# 514.25±19.78#SQJZZD-H+CoumermycinA1 組6 78.82±3.34▲ 95.56±4.22▲ 386.67±17.14▲

2.4 升清降濁制動顆粒對各組大鼠紋狀體中神經元凋亡的影響 與對照組比較，TS 組大鼠紋狀體中神經元凋亡率升高（P＜0.05）；與TS 組比較，升清降濁制動顆粒低劑量組、升清降濁制動顆粒高劑量組、氟哌啶醇組大鼠紋狀體中神經元凋亡率降低（P＜0.05）；與TS 組比較，Coumermycin A1 組大鼠紋狀體中神經元凋亡率升高（P＜0.05）；與升清降濁制動顆粒高劑量組比較，升清降濁制動顆粒高劑量+Coumermycin A1 組大鼠紋狀體中神經元凋亡率升高（P＜0.05）。見表4。TUNEL 染色圖見OSID 二維碼。

表4 各組大鼠紋狀體中神經元凋亡率比較（±s）Tab.4 Comparison of neuronal apoptosis rate in striatum of rats in each group（±s） %

表4 各組大鼠紋狀體中神經元凋亡率比較（±s）Tab.4 Comparison of neuronal apoptosis rate in striatum of rats in each group（±s） %

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TS 組比較，#P＜0.05；與SQJZZDL 組比較，△P＜0.05；與SQJZZD-H 組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 凋亡率對照組 6 3.23±0.14 TS 組 6 15.52±0.61*SQJZZD-L 組 6 11.35±0.48#SQJZZD-H 組 6 6.52±0.32#△氟哌啶醇組 6 6.48±0.30#△Coumermycin A1 組 6 19.85±1.02#SQJZZD-H+Coumermycin A1 組 6 9.25±0.31▲

2.5 升清降濁制動顆粒對各組大鼠紋狀體中JAK2/STAT3 信號通路相關蛋白表達的影響 與對照組比較，TS 組大鼠紋狀體中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達升高（P＜0.05）；與TS 組比較，升清降濁制動顆粒低劑量組、升清降濁制動顆粒高劑量組、氟哌啶醇組大鼠紋狀體中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達降低（P＜0.05）；與TS 組比較，Coumermycin A1 組大鼠紋狀體中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達升高（P＜0.05）；與升清降濁制動顆粒高劑量組比較，升清降濁制動顆粒高劑量+Coumermycin A1 組大鼠紋狀體中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達升高（P＜0.05）。見圖1 和表5。

圖1 Western blot 檢測大鼠紋狀體中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達Fig.1 Western blot detection of p-JAK2 and p-STAT3 protein expression in rat striatum

表5 各組大鼠紋狀體中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達比較（±s）Tab.5 Comparison of p-JAK2 and p-STAT3 protein expression in striatum of rats in each group（±s）

表5 各組大鼠紋狀體中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達比較（±s）Tab.5 Comparison of p-JAK2 and p-STAT3 protein expression in striatum of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TS 組比較，#P＜0.05；與SQJZZDL 組比較，△P＜0.05；與SQJZZD-H 組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 p-JAK2/JAK2 p-STAT3/STAT3對照組 6 0.34±0.02 0.18±0.01 TS 組 6 0.84±0.08* 0.75±0.07*SQJZZD-L 組 6 0.72±0.08# 0.61±0.05#SQJZZD-H 組 6 0.45±0.02#△ 0.32±0.02#△氟哌啶醇組 6 0.43±0.03#△ 0.30±0.03#△Coumermycin A1 組 6 0.96±0.02# 0.88±0.07#SQJZZD-H+Coumermycin A1 組6 0.63±0.05▲ 0.43±0.04▲

3 討論

細胞因子是細胞通訊的重要介質，在神經炎癥中起著重要作用。在TS 大鼠中觀察到腦組織中TNF-α、IL-6 水平明顯高于正常大鼠[12]。亞氨基二丙腈會導致DA 濃度持續(xù)下降，導致生長發(fā)育過程中的DRD2 超敏反應，這可能導致動物的刻板行為[13]；DAT作為一種專門定位于DA 神經元突觸前膜的傳遞糖蛋白，其負責通過神經元再攝取調節(jié)突觸外DA 的濃度。因此，DAT 在維持DA 釋放的階段性平衡中起著重要作用[14]。先前的研究表明，與健康對照相比，TS 大鼠中DAT 的表達較低[15]。亞氨基二丙腈模型是TS 的標準動物模型，能夠全面再現TS 的行為特征[16]。本研究利用亞氨基二丙腈成功誘導了TS 大鼠模型，結果顯示，與對照組比較，TS 組大鼠運動行為評分、刻板行為評分、IL-1β、TNF-α、IL-6 水平、DRD2含量、神經元凋亡率升高，DA、DAT 含量降低，表明神經炎癥可誘導TS 大鼠神經元凋亡，進而引起DA代謝紊亂。提示抑制神經炎癥、神經元凋亡進而促進DA 平衡可能是開發(fā)新藥治療TS 的有效途徑之一。

中醫(yī)學理論認為TS 主要病機是脾虛痰聚、氣血陰虛。因此，應堅持健脾補肝、益氣活血、化痰祛風等原則來治療TS。升清降濁制動顆粒中，僵蠶有化痰熄風之功效；蟬蛻有祛風止痙之功效；片姜黃有理氣之等功效；酒大黃有蕩滌瘀濁之功效。4 種藥物聯用，可降陰中之濁陰，可升陽中之清陽，陰陽相配，調暢氣機，內外通和，契合TS 的病機。全蝎、生白芍、生甘草配合使用，共奏升清降濁、通絡止痙等功效[6]。此外，升清降濁制動顆粒的核心在升降散，其升清降濁，調暢氣機，為控制抽動之關鍵[9]。據報道，升清降濁制動顆?？擅黠@改善TS 患兒的抽動癥狀[17]。本研究結果與其是一致的，本研究顯示，升清降濁制動顆?？梢种芓S 大鼠神經炎癥、神經元凋亡，促進DA 表達，且升清降濁制動顆粒劑量越高，對應指標的變化趨勢越明顯。氟哌啶醇是DRD2 的阻斷劑，可有效改善抽動癥狀[18]。本研究選取該藥物作為陽性藥物，結果顯示，升清降濁制動顆粒高劑量組與氟哌啶醇組對應指標變化趨勢差異無統(tǒng)計學意義。提示升清降濁制動顆粒可能是治療TS 的潛在有效藥物。

JAK2/STAT3 是多種細胞因子和生長因子介導的重要轉導通路，可參與細胞增殖、分化、凋亡、遷移等過程[19]。目前關于JAK2/STAT3 通路在TS 中的研究較少，僅僅有研究顯示，抑制JAK2/STAT3 通路可改善TS 大鼠神經炎癥[7]。本研究結果顯示，與TS組比較，Coumermycin A1 組大鼠紋狀體中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達升高，TS 大鼠神經炎癥、神經元凋亡及DA 代謝紊亂現象明顯，提示JAK2/STAT3通路確實參與了TS 大鼠神經炎癥、神經元凋亡及DA代謝紊亂過程。此外，本研究還發(fā)現，升清降濁制動顆?？梢种芓S 大鼠紋狀體中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達，且升清降濁制動顆粒劑量越高，對應的蛋白表達水平越低，推測升清降濁制動顆?？赡芡ㄟ^抑制JAK2/STAT3 通路對TS 大鼠發(fā)揮保護作用。為了驗證該推測，本研究在高劑量升清降濁制動顆粒作用的基礎上給予JAK2 通路激活劑Coumermycin A1 干預TS 大鼠，結果顯示，Coumermycin A1 減弱了高劑量升清降濁制動顆粒對TS 大鼠神經炎癥、神經元凋亡的抑制作用以及對DA 表達水平的促進作用。證實了猜想的正確性，即升清降濁制動顆粒可能通過抑制JAK2/STAT3 通路對TS 大鼠發(fā)揮保護作用。

綜上所述，升清降濁制動顆?？梢种芓S 大鼠神經炎癥、神經元凋亡及促進DA 平衡，該機制可能與抑制JAK2/STAT3 信號通路有關。升清清降濁制動顆粒對TS 大鼠保護作用的機制可能還涉及其他通路，這將是本研究下一步研究的重點內容之一。