茹意，謝良騏，王新亮，肖保國，金小明，馬存根*，柴智，樊慧杰*

1山西中醫(yī)藥大學(xué)多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西晉中 030619；2復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025；3美國印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院，印第安納波利斯 46202

神經(jīng)管畸形(neural tube defects，NTDs)是常見的嚴(yán)重出生缺陷性疾病之一[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年約有9 萬例NTDs 患兒死亡，860 萬例患兒殘疾[2]。目前葉酸(folic acid)是預(yù)防NTDs 的唯一用藥，但仍有約30%的NTDs 不能被預(yù)防[3-4]，因此，亟需尋找更有效的藥物來彌補該不足。NTDs的發(fā)病機制尚不明確，但大量研究顯示，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路與NTDs 的發(fā)生密切相關(guān)[5]。有研究顯示，激活PI3K/Akt 信號通路可降低NTDs的發(fā)生率[6]。

五味子醇甲(schisandrin，SCH)是中藥五味子中可通過血腦屏障的二苯并環(huán)辛二烯(dibenzocyclooctadiene lignans)木脂素類成分[7-8]，具有抗凋亡、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[9-11]。有臨床研究報道，SCH對人體健康不會造成危害[12-13]。研究顯示，SCH對多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如阿爾茨海默病、帕金森病等)有一定的治療作用[14-15]，但其能否預(yù)防全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，atRA)誘導(dǎo)的NTDs 仍不明確。本研究利用atRA 建立NTDs 小鼠模型和PC12細(xì)胞損傷模型，觀察SCH對NTDs是否有預(yù)防作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～10 周齡SPF 級未經(jīng)產(chǎn)近交系C57BL/6 小鼠58 只(雌性40 只，雄性18 只)，體重(18±2) g，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2021-0006]。飼養(yǎng)于恒溫(22±2) ℃、相對濕度40%～60%、12 h/12 h晝夜循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下。所有動物實驗均按照《實驗動物-動物福利倫理審查指南》的倫理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。本研究方案經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(AWE20200319)。

1.1.2 細(xì)胞 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12 細(xì)胞)由山西中醫(yī)藥大學(xué)益氣活血國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室提供，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 藥物 (1)SCH購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，白色粉末狀，純度≥99%；分子式C24H32O7；分子量432.51；批號20120205。SCH 藥液配制：①動物實驗，將SCH粉末溶解于5%羧甲基纖維素鈉中配制成濃度8 mg/kg的藥液，采用超聲使其充分溶解，于4 ℃冰箱中保存，使用前恢復(fù)至室溫并充分搖勻。②細(xì)胞實驗，將SCH 粉末溶解于DMSO 中，用移液槍反復(fù)吹打至藥物粉末完全溶解，配置成濃度8000 μmol/L 的母液分裝放置于-20 ℃保存，避免反復(fù)凍融。使用時用完全培養(yǎng)基稀釋為2.5 μmol/L的濃度。

(2)葉酸購自北京斯利安藥業(yè)有限公司；規(guī)格0.4 mg/片；批號S181112。避光密封保存。葉酸藥液配制：將葉酸藥片在研磨缽中研磨成粉末狀，于電子天平上精確稱量，用生理鹽水作為溶劑溶解，將其配制成終濃度為2.44 μg/ml的葉酸藥液，再經(jīng)超聲進(jìn)一步充分溶解，將配好的藥液分裝，避光保存于4℃冰箱中。使用前恢復(fù)至室溫并充分搖勻。根據(jù)人(60 kg)︰小鼠(20 g)=1︰9.1確定小鼠的葉酸用藥劑量為61.0 μg/kg。

(3)atRA 購自美國Sigma 公司，避光密封置于-20 ℃保存；批號WXBD1910V。atRA 混懸液配制：①動物實驗中，atRA 的用藥劑量為7.5 mg/kg，如小鼠體重為20 g，則注射含有atRA 粉末0.15 mg 的混懸液。精確稱取atRA 粉末，用無水乙醇和橄欖油的混合液(無水乙醇體積︰橄欖油體積=8︰92)作為溶劑，將配好的藥液分裝，避免反復(fù)凍融，避光存儲在-20℃冰箱中。使用時提前取出，恢復(fù)至室溫并充分搖勻。②細(xì)胞實驗，將atRA 粉末溶解于DMSO 中，用移液槍反復(fù)吹打至藥物粉末完全溶解，配置成為濃度為5000 μmol/L 的母液分裝、避光放置于-20 ℃保存，使用前用完全培養(yǎng)基稀釋為2.5 μmol/L濃度。

1.1.4 試劑與儀器 磷酸化PI3K(p-PI3K)抗體(#4228S)、p-Akt 抗體(#4060)、Akt 抗體(#4685)購自美 國Cell Signaling Technology 公 司；β-actin 抗 體(AP0060)和羊抗兔IgG(ZJ2020-R)購自南京Bioworld科技有限公司。

HE 染色試劑盒(20201016)購自北京索萊寶科技有限公司；體視顯微鏡(EZ4D)、熒光顯微鏡(DM4000B LED)、冰凍切片機(CM1950)購自德國Leica公司；顯微鏡(DP72)購自日本OLYMPUS公司；電泳儀(PowerPacTM)、轉(zhuǎn)膜儀(PowerPacTM)購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像分析儀(Azure C300)購自美國Azure Biosystems公司。

1.2 實驗分組與造模 (1)動物實驗：在小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，雌鼠與雄鼠交配過夜(下午7 時至早晨7 時)，次日早晨7 時取出雌鼠檢查陰道栓，將有陰道栓的雌鼠隨機分為對照組、模型組、葉酸組與SCH 組，每組9 只。將發(fā)現(xiàn)陰道栓當(dāng)天中午記為胚胎(embryo，E)0.5 d(E 0.5 d)。在E 7.5 d時，除對照組外各組孕鼠腹腔注射atRA(7.5 mg/kg)，對照組孕鼠給予等體積橄欖油腹腔注射；在E 0.5 d－E 11.5 d，葉酸組孕鼠持續(xù)灌胃給予葉酸[61.0 μg/(kg·d)]，SCH組持續(xù)灌胃給予SCH[8.0 mg/(kg·d)]干預(yù)，對照組和模型組孕鼠則灌胃給予等體積的生理鹽水。E 11.5 d麻醉脫頸處死孕鼠，剖宮產(chǎn)分離胚胎。

(2)細(xì)胞實驗：將PC12 細(xì)胞分為對照組、模型組與SCH 組。使用atRA(20 μmol/L)處理PC12 細(xì)胞12 h，建立PC12 細(xì)胞損傷模型。在atRA 處理12 h后，使用濃度為2.5 μmol/L的SCH繼續(xù)處理24 h。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 胎鼠NTDs 發(fā)病率 在E 11.5 d 實行剖宮產(chǎn)、取出胎鼠后，于體視顯微鏡下辨別是否發(fā)生NTDs及其畸形類型，記錄、拍照并計算NTDs發(fā)病率。

1.3.2 胎鼠組織冷凍切片制備 每組隨機取出整個胎鼠組織，置于1×PBS 溶液中洗滌(3 min×3 次)，后置于4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定6～12 h；置于10%、20%、30%蔗糖溶液中進(jìn)行梯度脫水處理各24 h；3 d后用1×PBS 溶液洗滌，使用OCT(optimum cutting temperature)包埋膠制作整個胎鼠組織包塊，置于液氮中快速冷凍，保存于-80℃冰箱，用于制作冷凍切片(于胎鼠冠狀位進(jìn)行7 μm 的連續(xù)切片)，切片晾干后保存于-80 ℃冰箱，以備后續(xù)HE染色。

1.3.3 HE染色觀察胎鼠神經(jīng)管閉合情況 取出冷凍切片，按照HE染色試劑盒說明書進(jìn)行HE染色操作，待切片自然晾干后中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察各組胎鼠神經(jīng)管的發(fā)育閉合情況并拍照。

1.3.4 Western blotting 檢測胎鼠腦組織和PC12 細(xì)胞中p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平 提取各組胎鼠腦組織和PC12細(xì)胞的蛋白，計算30 μg蛋白樣本量，用合適的SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白。電泳完畢后，將分離好的蛋白凝膠用濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉搖床上封閉2 h；充分洗滌后分別加入相應(yīng)稀釋后抗體，p-PI3K 抗體(1︰1000)、p-Akt 抗體(1︰1000)、Akt 抗體(1︰1000)、β-actin 抗體(1︰5000)，4 ℃孵育過夜；次日洗滌后加入相應(yīng)的IgG(1︰5000)，置于搖床上慢速室溫孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)曝光條帶，ImageJ軟件進(jìn)行灰度值比較。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 atRA 干預(yù)孕鼠建立NTDs 胎鼠模型 體視顯微鏡下觀察各組胎鼠形態(tài)，可見正常胎鼠后腦部及后頸部外觀飽滿光滑，后腦神經(jīng)上皮完全融合，形成前、中、后腦泡，眼、耳泡，尾彎曲細(xì)長；atRA 干預(yù)后，部分胎鼠表現(xiàn)出不同的畸形類型(圖1)。

圖1 體視顯微鏡下胎鼠形態(tài)觀察Fig.1 Morphology of fetus mice under stereomicroscope

2.2 SCH 對胎鼠NTDs 發(fā)病率的影響 與對照組比較，其他各組胎鼠NTDs發(fā)病率均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，葉酸組和SCH 組胎鼠NTDs 發(fā)病率降低(P<0.01)；與葉酸組比較，SCH 組胎鼠NTDs 發(fā)病率降低(P<0.01，表1)。

表1 各組胎鼠NTDs發(fā)病率比較Tab.1 The incidence of NTDs in each group of mice

HE染色結(jié)果顯示，對照組、SCH組、葉酸組胎鼠中腦、后腦、末腦、間腦、端腦、四腦室等各結(jié)構(gòu)發(fā)育良好，外觀光滑，發(fā)育狀態(tài)良好；模型組胎鼠只見中腦、間腦、端腦，而后腦、末腦被破壞，神經(jīng)組織外露；對照組、SCH 組、葉酸組胎鼠神經(jīng)管管腔規(guī)則，閉合良好，各結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊；模型組胎鼠神經(jīng)管呈現(xiàn)未閉合狀態(tài)(圖2)。

圖2 各組胎鼠神經(jīng)管閉合情況(HE染色)Fig.2 Neural tube closure in each group of fetal mice (HE staining)

2.3 SCH 對胎鼠腦組織中p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組胎鼠腦組織中p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，葉酸組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，SCH 組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)；與葉酸組比較，SCH 組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05，圖3)。

圖3 各組NTDs胎鼠腦組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平Fig.3 Protein expression levels of p-PI3K and p-Akt in brain tissue of NTDs fetal mice in each group

2.4 SCH 對各組PC12 細(xì)胞p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，SCH 組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05，圖4)。

圖4 各組PC12細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平Fig.4 Protein expression levels of p-PI3K and p-Akt in each group of PC12 cells

3 討 論

NTDs是常見的出生缺陷性疾病[16]，主要包括脊柱裂(spinal bifida)、無腦兒(anencephaly)和其他畸形類型[17]，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率為0.5‰～2.0‰[18]。中國出生缺陷防治報告指出，我國目前出生缺陷發(fā)生率為5.6%，每年新增出生缺陷患兒約90萬例，其中NTDs 占2%左右[19]。我國的NTDs 發(fā)病呈現(xiàn)明顯的地域差異，北方地區(qū)是NTDs 的高發(fā)區(qū)，其中山西呂梁的發(fā)病率達(dá)5.57‰[20-21]。有報道指出，NTDs 患兒呈現(xiàn)明顯的性別差異，女患兒發(fā)病率∶男患兒發(fā)病率=3∶1[22]。NTDs呈現(xiàn)高病死率和高致殘率，患兒一般在孕期即流產(chǎn)，僅小部分患兒可出生，出生后大部分會在短時間內(nèi)死亡，平均壽命不到1 年[23-24]，是導(dǎo)致死胎、死產(chǎn)和新生兒死亡的主要誘因，給家庭和社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)[25]。目前NTDs 發(fā)病機制尚不完全清楚，且其主要預(yù)防藥物葉酸仍然存在不足。因此，尋找更加有效的NTDs 預(yù)防藥物顯得尤為重要。近年來，草本植物的提取物由于其突出的生物活性越來越受到關(guān)注。

atRA 作為一種維生素A 的生物活性形式，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[26]，是誘導(dǎo)小鼠NTDs的常用藥物[27-28]。本課題組前期研究顯示，五子衍宗丸(WYP)可較好地預(yù)防atRA 誘導(dǎo)的NTDs 胎鼠發(fā)病[29]。大量研究顯示，SCH 可發(fā)揮多種藥理作用，如神經(jīng)保護(hù)、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、增強小鼠的學(xué)習(xí)與認(rèn)知能力等[30]。此外，本課題組利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了“藥物WYP主要單體成分—NTDs 關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)，提示SCH 與NTDs 關(guān)系密切[31]；2022年中國藥典顯示，SCH是WYP的主要質(zhì)控成分之一[32-33]。因此，雖未有SCH預(yù)防NTDs的相關(guān)報道，但基于前期研究，推測SCH可能具有預(yù)防NTDs 的作用。本研究觀察到，SCH 可明顯降低atRA 誘導(dǎo)的NTDs 胎鼠模型的發(fā)病率，并且SCH 組胎鼠NTDs 發(fā)病率低于葉酸組，提示SCH 對胎鼠NTDs具有更好的預(yù)防作用。

NTDs的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多條信號通路，如PI3K/Akt 信 號 通 路[6]、經(jīng) 典Wnt/β-catenin 信 號 通路[34]、平面細(xì)胞極性(planar cell polarity，PCP)信號通路[35]、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號通路[36]、音猬因子(sonic hedgehog，Shh)信號通路[37]、維甲酸代謝通路[38]等。其中PI3K/Akt 信號通路更受關(guān)注，被認(rèn)為是神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵通路，與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)；通過激活該通路的關(guān)鍵分子，可增強或抑制其下游因子，進(jìn)而減少NTDs的發(fā)生[6]。同時，PI3K/Akt 信號通路也是一條抗細(xì)胞凋亡保護(hù)性通路，其激活能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[39]，而這正與NTDs 的基本發(fā)病機制(神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡)相契合[40]。因此，激活PI3K/Akt信號通路成為多種藥物治療疾病的作用靶點[41-42]。Akt為PI3K下游重要的靶激酶，也是調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要因子[43]。Akt激酶的磷酸化是PI3K/Akt信號通路被激活的主要表現(xiàn)[44]。事實上，SCH 通過正向激活PI3K/Akt 信號通路減輕疾病癥狀，已在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中得到驗證，如SCH 激活PI3K/Akt 信號通路改善帕金森病小鼠運動障礙[45]。

本研究的小鼠體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，SCH 可影響PI3K/Akt 信號通路主要蛋白的表達(dá)，上調(diào)p-PI3K 和p-Akt 表達(dá)水平，降低NTDs 的發(fā)病率；采用SCH 進(jìn)一步干預(yù)損傷后的神經(jīng)元樣細(xì)胞，可增強p-PI3K、p-Akt 的表達(dá)，提示SCH 可能激活PI3K/Akt 信號通路。由此可見，SCH 降低NTDs 發(fā)病率的作用機制可能是通過激活PI3K/Akt信號通路而實現(xiàn)的。

綜上所述，SCH 可降低小鼠NTDs 發(fā)病率，且其預(yù)防作用優(yōu)于葉酸；這種預(yù)防作用可能與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。