孫秋艷,郭 芳,李 春,2,馮旭東

(1.北京理工大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 化學(xué)工程系 生物化工研究所 醫(yī)藥分子科學(xué)與制劑工程工業(yè)和信息化部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081;2.清華大學(xué) 化學(xué)工程系 工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084)

三萜化合物因其種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)多樣以及具備豐富的生理藥理活性被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域,已經(jīng)成為人類(lèi)生活中不可缺少的一部分[1]。三萜化合物通過(guò)適度引入糖基修飾可增加化合物的水溶性,減少毒副作用;同時(shí),因糖基種類(lèi)及結(jié)構(gòu)的多樣性,糖基修飾又可進(jìn)一步豐富三萜化合物及其衍生物的種類(lèi),生成具有不同藥理學(xué)功能的化合物[2-3]。如,人參皂苷只有兩種苷元,即達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型,但通過(guò)不同糖基修飾衍生出的人參皂苷在25種以上[4]。目前,三萜化合物及其糖苷衍生物主要由植物提取、化學(xué)合成以及生物合成等方式獲得。由于一些特定的三萜糖苷化合物在植物中含量低且植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng),所以植物提取法耗時(shí)費(fèi)力,來(lái)源于甘草根中的甘草酸,需要挖根提取,嚴(yán)重破壞土壤生態(tài)和植被[5-6]?；瘜W(xué)法糖基修飾通常需要苛刻的反應(yīng)條件、多步驟的保護(hù)/去保護(hù)過(guò)程來(lái)控制糖修飾的區(qū)域選擇性,所以存在反應(yīng)過(guò)程煩瑣、產(chǎn)物定向性差、單糖修飾居多等缺點(diǎn)[7-8]。隨著糖基數(shù)量的增加,這些問(wèn)題更加嚴(yán)重,無(wú)法實(shí)現(xiàn)綠色可持續(xù)性生產(chǎn)。近年來(lái),通過(guò)生物酶法合成糖苷類(lèi)化合物受到了越來(lái)越多的關(guān)注。特別是,利用UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)可以解決上述問(wèn)題,因?yàn)槊复呋磻?yīng)條件溫和,以高區(qū)域選擇性將UDP-糖從供體轉(zhuǎn)移到受體,可實(shí)現(xiàn)高效合成糖苷衍生物[9-12]。

目前,越來(lái)越多的UGT被鑒定及表征,并作為綠色生物催化劑,用于合成高價(jià)值糖苷化合物[13-15]。如,UGT51催化原人參二醇糖基化生成潛在的抗癌藥物人參皂苷Rh2[16]。來(lái)源于烏拉爾甘草的UGT73C11,催化甘草次酸糖基化生成甘草次酸-3-氧-單葡萄糖(GLMG)[17]。來(lái)源于擬南芥的AtUGT78D2和AtUGT79B1催化槲皮素生成槲皮素-3-氧-葡萄糖基-木糖苷等[18]。目前報(bào)道的大多數(shù)UGT僅能實(shí)現(xiàn)單糖基修飾,對(duì)于可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上糖基修飾的UGT研究報(bào)道較少,但利用UGT實(shí)現(xiàn)二糖或多糖修飾對(duì)合成糖苷衍生物具有重要意義。由于缺少實(shí)現(xiàn)二糖或多糖修飾的UGT,這限制了糖苷衍生物的多樣性,不利于挖掘具有更多價(jià)值的糖苷衍生物。

這個(gè)故事流傳非常廣，以至于“割席斷交”成了一個(gè)成語(yǔ)，在后世常被用來(lái)表示自己的高潔不愿意同流合污。金塊代表的是世人夢(mèng)寐以求的財(cái)富，官員的豪華儀仗代表的是世人無(wú)限向往的尊貴。但是對(duì)于知識(shí)分子特別是古代士族來(lái)說(shuō)，富和貴都和所謂的“清名”成了矛盾，正因?yàn)榇蠖鄶?shù)世俗的人追求富貴，所以少數(shù)士族讀書(shū)人的特立獨(dú)行才有著“世人皆濁我獨(dú)清”的傲立于世的姿態(tài)，仿佛這是一種時(shí)尚一種無(wú)上的光榮。后人讀這個(gè)故事，大多在自覺(jué)不自覺(jué)地接受一種道德評(píng)判，即管寧是清高的，華歆是世俗的；管寧相對(duì)來(lái)說(shuō)是正面的人物值得學(xué)習(xí)，華歆相對(duì)來(lái)說(shuō)是反面人物，要接受世俗的唾棄與不屑。

金盞花苷E又稱(chēng)去葡萄糖竹節(jié)參皂苷,是從竹節(jié)參中提取得到的五環(huán)三萜糖苷類(lèi)化合物,在抑制HepG2細(xì)胞增殖擴(kuò)散方面具有重要作用[19]。目前已報(bào)道的金盞花苷E糖基修飾類(lèi)型僅有葡萄糖基修飾,特別是半乳糖作為一種重要的糖基修飾,在改善天然產(chǎn)物的藥理活性方面具有重要作用。如,在大豆皂醇B單葡萄糖醛酸(SBMG)的3號(hào)位葡萄糖醛酸再修飾一個(gè)半乳糖即形成大豆皂苷Ⅲ,其抗皰疹病毒、抗溶血、保肝能力增強(qiáng)[20-21];半乳糖修飾糖苷衍生物大豆皂苷Bb,可以治療骨質(zhì)疏松等。但鮮有對(duì)金盞花苷E進(jìn)行半乳糖修飾的報(bào)道。

來(lái)源于大豆的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶GmSGT2可以催化SBMG、甘草次酸單葡萄糖醛酸(GAMG)和尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)反應(yīng),分別生成甘草次酸單葡萄糖醛酸-半乳糖(Gal-GAMG)與大豆皂苷Ⅲ[22-23]。GAMG、SBMG同屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜化合物,結(jié)構(gòu)與金盞花苷E十分相似,因此,通過(guò)對(duì)該酶的序列及結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分析,推測(cè)GmSGT2可能具備催化金盞花苷E的功能。因此,本研究中,筆者首次對(duì)大豆糖基轉(zhuǎn)移酶GmSGT2催化金盞花苷E進(jìn)行功能驗(yàn)證,并通過(guò)分子對(duì)接研究揭示GmSGT2催化金盞花苷E與UDP-半乳糖反應(yīng)時(shí)的識(shí)別機(jī)制,以期為利用酶法合成新的半乳糖苷衍生物提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒構(gòu)建

質(zhì)粒pET28a-GmSGT2及工程菌E.coliBL21-GmSGT2 (DE3),筆者所在課題組前期構(gòu)建保存。GmSGT2基因(登錄號(hào)為AB473730.1)、E.coliDH5α與E.coliBL21(DE3),北京博邁德基因技術(shù)有限公司;pET28a質(zhì)粒,德國(guó)Novagen公司。

要評(píng)估一個(gè)P波未下傳是由于被阻滯還是被干擾所致，首先要看心房率。當(dāng)心房率足夠慢，則可診斷為阻滯。心房率過(guò)快(>135次/min)時(shí)出現(xiàn)的房室分離P波未下傳心室，通常是由生理性不應(yīng)期引起的房室傳導(dǎo)功能障礙所致，此種情況不能診斷為房室阻滯[1]。

1.2 試劑與儀器

利用AKTA純化儀對(duì)GmSGT2粗酶液進(jìn)行Ni2+柱純化,用5倍柱體積重蒸水(ddH2O)清洗Ni2+柱,再用5倍柱體積蛋白純化平衡液(50 mmol/L PBS、25 mmol/L咪唑、15 mmol/L NaCl,pH 7.4)平衡Ni2+柱,流速1.0 mL/min 將GmSGT2粗酶液過(guò)Ni2+柱,用5倍柱體積含有75 mmol/L咪唑的洗脫液(50 mmol/L PBS、75 mmol/L咪唑、15 mmol/L NaCl,pH 7.4)清洗雜蛋白,再用3倍柱體積含有225 mmol/L咪唑的洗脫液(50 mmol/L PBS、225 mmol/L咪唑、15 mmol/L NaCl,pH 7.4)洗脫目標(biāo)蛋白并收集至離心管,測(cè)定蛋白濃度,得到GmSGT2純酶。(50 mmol/L 不同pH的 PBS配制參照Thermo Scientific官網(wǎng)PBS溶液配制)。

LC-30A型超高效液相色譜儀(UPLC),日本島津公司;6460 Triple Quad型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀, Agilent公司;PowerPac 3000gajf 電泳儀,Bio-Rad有限公司;DK-8D型恒溫水浴鍋,上海一恒科技有限公司;AKTA純化儀, GE Healthcare公司;Jinbio低溫高壓細(xì)胞破碎儀,廣州聚能納米生物科技股份有限公司;Avanti-JXN-26型高速冷凍離心機(jī),貝克曼庫(kù)爾特公司;Nanodrop 2000c型超微量分光光度計(jì),賽默飛世爾科技公司。

1.3 GmSGT2工程菌株的培養(yǎng)與純化

將構(gòu)建成功的BL21接種到含有50 μg/mL卡那青霉素的30 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng),按照體積分?jǐn)?shù)1%的接種量,將種子液接種至新鮮LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.8,加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),16 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)后8 000 r/min離心2 min收集菌體,按照體積比1∶40加入50 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4-NaCl緩沖液(PBS,pH 7.5)重懸菌體,在4 ℃、100 MPa條件下,利用低溫超高壓破碎儀破碎4次,12 000 r/min離心30 min,收集上清液,得到粗酶液。

所用引物由安升達(dá)(天津)生物科技有限公司合成;金盞花苷E,天津伐木易生物科技有限公司;UDP-阿拉伯糖(UDP-Ara)、UDP-半乳糖(UDP-Gal),廣州昂飛生物科技有限公司; UDP-木糖(UDP-Xyl)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)、UDP-鼠李糖(UDP-Rha),蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司;齊墩果酸、白樺脂酸,阿拉丁試劑(上海)有限公司;3-氧-葡萄糖-齊墩果酸、28-氧-葡萄糖-齊墩果酸、3,28-氧-雙葡萄糖-齊墩果酸、3-氧-葡萄糖-白樺脂酸、28-氧-葡萄糖-白樺脂酸,自制;其他所用化學(xué)藥品均為市售分析純。

1.4 金盞花苷E半乳糖苷衍生物檢測(cè)方法

反應(yīng)樣用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,利用UPLC檢測(cè),檢測(cè)條件:色譜柱Agilent公司的InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)、檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm、流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%磷酸(B)、流速為0.3 mL/min、柱溫箱40 ℃、上樣量3 μL,具體梯度洗脫程序?yàn)?～1.0 min 60% B溶液、1～2.4 min 43% B溶液、2.4～2.6 min 40% B溶液、2.6～3.4 min 30%B溶液、3.4～4.25 min 24% B溶液、4.25～4.6 min 5% B溶液、4.6～5.0 min 0% B溶液、5.0～6.5 min 0% B溶液、6.5～7.0 min 60% B溶液、7.0～9.5 min 60% B溶液。LCMS檢測(cè)條件同UPLC檢測(cè)方法,流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%甲酸(B),采用陰離子與陽(yáng)離子雙模式檢測(cè)。

2) 墻體水平位移時(shí)程曲線(xiàn)：在此選擇三個(gè)有代表性的墻體水平位移監(jiān)測(cè)點(diǎn)ZQT-01、ZQT-03、ZQT-23隨著土方開(kāi)挖的變形時(shí)程曲線(xiàn)進(jìn)行分析，三個(gè)測(cè)點(diǎn)的變形時(shí)程曲線(xiàn)見(jiàn)圖3～圖5。

1.5 GmSGT2酶學(xué)性質(zhì)表征

因?yàn)镚mSGT2可以催化SBMG與UDP-Gal反應(yīng)生成大豆皂苷Ⅲ,還可催化GAMG生成GAMG-Gal,同時(shí)SBMG與GAMG都屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜化合物,且3號(hào)位均修飾一個(gè)葡萄糖醛酸,金盞花苷E均符合以上結(jié)構(gòu)特征。因此,以UDP-Gal為糖基供體,金盞花苷E為糖基受體,探究GmSGT2的催化活性,結(jié)果如圖1所示。

1.課內(nèi)：開(kāi)展“以學(xué)生為主體，教師為主導(dǎo)，訓(xùn)練為主線(xiàn)”的情境教學(xué)法，進(jìn)行情境教學(xué)探索與研究。課堂教學(xué)中采用“貼近生活展現(xiàn)情境”“引導(dǎo)學(xué)生擴(kuò)寫(xiě)，描述情境”“利用音樂(lè)渲染情境”三情境法開(kāi)展課堂教學(xué)，喚醒他們自身對(duì)生活的感受，使學(xué)生由被動(dòng)的學(xué)習(xí)者，變?yōu)橛兄饔^情感積極參與的藝術(shù)再創(chuàng)造者。進(jìn)行情境教學(xué)法探索與研究對(duì)老師的知識(shí)、能力及奉獻(xiàn)精神提出了更高的要求，需要老師精心設(shè)計(jì)教學(xué)內(nèi)容，同時(shí)借助多媒體技術(shù)，將同學(xué)們帶入詩(shī)境；做好適當(dāng)鋪墊，憑借詩(shī)境，弄清詩(shī)意；反復(fù)吟誦，咀嚼詩(shī)句，體驗(yàn)詩(shī)情。

病理表現(xiàn) 灰黃色腫物1枚，表面光滑，包膜完整，切面灰黃色，質(zhì)中，局部見(jiàn)鈣化。光鏡下可見(jiàn)典型的細(xì)胞致密區(qū)(Antoni A區(qū))及細(xì)胞疏松區(qū)(Antoni B區(qū))，瘤細(xì)胞呈編織狀排列，未見(jiàn)明確柵欄狀結(jié)構(gòu)(圖3)，免疫組織化學(xué)檢查顯示：波形蛋白 (彌漫強(qiáng)+)、S-100(彌漫強(qiáng)+)(圖4)。結(jié)合形態(tài)及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，考慮為神經(jīng)鞘瘤。

為了探究GmSGT2的最適溫度,構(gòu)建100 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)體系同熱穩(wěn)定性,在不同反應(yīng)溫度(25、30、35、40、45、50、55和60 ℃)條件下反應(yīng)時(shí)間2 h,加400 μL甲醇終止反應(yīng),UPLC檢測(cè)。定義在40 ℃下 GmSGT2 催化金盞花苷E反應(yīng)的酶活為100%。

為了探究GmSGT2的最適pH,構(gòu)建100 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)體系同上,使用不同pH的50 mmol/L緩沖液定容至100 μL,在35 ℃條件下反應(yīng)2 h,加400 μL甲醇終止反應(yīng),UPLC檢測(cè),其中,pH 5～6的緩沖液為檸檬酸鈉-檸檬酸,pH 6～8的緩沖液為Na2HPO4-NaH2PO4,pH 8～9的緩沖液為T(mén)ris-HCl,pH 9～14的緩沖液為Na2CO3-NaHCO3。定義在pH 9.0 Tris-HCl條件下,GmSGT2 催化金盞花苷E反應(yīng)的酶活為100%。

為了探究GmSGT2糖供體特異性,構(gòu)建100 μL反應(yīng)體系,分別使用UDP-Ara、UDP-Gal、UDP-Xyl、UDP-Glc、UDP-GlcA和UDP-Rha作為糖供體,金盞花苷E為糖基受體,反應(yīng)體系同上,在35 ℃條件下反應(yīng)2 h;探究GmSGT2底物特異性,構(gòu)建100 μL反應(yīng)體系, UDP-Gal為糖基供體,分別使用金盞花苷E、齊墩果酸、白樺脂酸、3-氧-葡萄糖-齊墩果酸和28-氧-葡萄糖-齊墩果酸、3,28-氧-雙葡萄糖-齊墩果酸、3-氧-葡萄糖-白樺脂酸、28-氧-葡萄糖-白樺脂酸作為糖基受體,反應(yīng)體系同上,在35 ℃條件下反應(yīng)2 h,加400 μL甲醇終止反應(yīng),UPLC檢測(cè)。

由原始的決策原則[10]可知，當(dāng)證據(jù)融合后出現(xiàn)兩個(gè)或者多個(gè)可信度值相同且最大時(shí)，原始準(zhǔn)則無(wú)法判斷。若選擇某元素作為結(jié)果可能導(dǎo)致誤判。為了解決以上問(wèn)題，改進(jìn)后的決策原則的結(jié)果滿(mǎn)足式(7)。

為了探究GmSGT2催化金盞花苷E的酶活影響,設(shè)計(jì)兩組實(shí)驗(yàn),構(gòu)建100 μL反應(yīng)體系,實(shí)驗(yàn)組一:GmSGT2 50 μg,金盞花苷E 500 μmol/L,UDP-Gal 500 μmol/L,pH7.5的50 mmol/L PBS緩沖液定容至100 μL,35 ℃水浴鍋,反應(yīng)時(shí)間分別為1、2、3、4、5和6 h,加400 μL甲醇終止反應(yīng),12 000 r/min離心1 min,過(guò)膜,利用UPLC進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組二:GmSGT2 100 μg,其反應(yīng)體系、反應(yīng)時(shí)間、檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)組一。

1.6 GmSGT2催化金盞花苷E動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

為了測(cè)定GmSGT2對(duì)金盞花苷E的催化效率,構(gòu)建100 μL反應(yīng)體系,加入GmSGT2 25 μg,UDP-Gal 50 mmol/L,金盞花苷E 濃度分別為0.05、0.08、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2和5 mmol/L,在最適溫度、pH條件下反應(yīng)10 min,加400 μL甲醇終止反應(yīng),UPLC檢測(cè);利用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行擬合。

1.7 蛋白分子對(duì)接

UDP-Gal和金盞花苷E使用ChemBioDraw 12.0 and ChemBio3D 12.0進(jìn)行修飾。利用SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)對(duì)GmSGT2蛋白同源建模,獲得GmSGT2的3D結(jié)構(gòu),利用AutoDockTools-1.5.6進(jìn)行對(duì)接分析,使用PyMOL 1.8進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 GmSGT2催化金盞花苷E生成半乳糖苷衍生物及MS分析結(jié)果

為了探究GmSGT2在35 ℃條件下的熱穩(wěn)定性,構(gòu)建100 μL反應(yīng)體系,加入GmSGT2 50 μg,金盞花苷E 500 μmol/L,UDP-Gal 500 μmol/L(無(wú)特殊說(shuō)明,底物濃度均為500 μmol/L),pH 7.5的50 mmol/L PBS定容至100 μL,將GmSGT2置于35 ℃的水浴鍋,分別取不同時(shí)間(0、0.5、1.0、1.5、2、3、4、5和6 h)的蛋白在35 ℃反應(yīng)1 h后,加400 μL甲醇終止反應(yīng),12 000 r/min離心1 min,過(guò)膜,利用UPLC進(jìn)行檢測(cè)。定義GmSGT2 催化金盞花苷E 0 h反應(yīng)的酶活為100%。

圖1 GmSGT2催化金盞花苷E生成半乳糖苷衍生物Fig.1 Synthesis of galactoside derivatives from calunduloside E by GmSGT2

教師介紹：20世紀(jì)初期，一些生物學(xué)家已經(jīng)在一些昆蟲(chóng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了性染色體。教師展示雄果蠅的染色體圖、男性的染色體圖，并提出問(wèn)題：（1）X染色體、Y染色體大小相同嗎？（2）X染色體都比Y染色體大嗎？（3）X染色體、Y染色體是同源染色體嗎？（4）所有生物都有性染色體嗎？教師展示X染色體、Y染色體的同源區(qū)段和非同源區(qū)段的圖片，以此加深學(xué)生對(duì)性染色體的認(rèn)識(shí)。

2.2 GmSGT2催化底物特異性

以常用的UDP-Ara、UDP-Xyl、UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-Rha和UDP-GlcA作為糖基供體,以金盞花苷E為糖基受體,探究了GmSGT2的糖供體特異性,結(jié)果如圖2所示。

由圖1可知:GmSGT2可催化金盞花苷E與UDP-Gal反應(yīng),僅在3.4 min出現(xiàn)1個(gè)新峰,推測(cè)為金盞花苷E-半乳糖;對(duì)新峰進(jìn)行LC-ESI-MS分析(圖1(c)),新峰分子量為794.6,與推測(cè)結(jié)果一致,說(shuō)明GmSGT2催化金盞花苷E僅生成金盞花苷E-半乳糖,無(wú)其他副產(chǎn)物生成。

圖2 GmSGT2的糖基受體、糖基供體特異性Fig.2 Specificity of sugar acceptor and donor of GmSGT2

由圖2可知:GmSGT2催化UDP-Gal與金盞花苷E反應(yīng)活性最高,金盞花苷E轉(zhuǎn)化率為64.72%,催化UDP-Glc、UDP-Xyl和UDP-Ara反應(yīng)的酶活性次之,金盞花苷E轉(zhuǎn)化率分別為24.43%、22.59%和16.03%, 這與文獻(xiàn)[23]報(bào)道一致,GmSGT2更偏好于UDP-Gal為糖基供體。這可能與GmSGT2天然催化活性有關(guān),GmSGT2催化SBMG與UDP-Gal反應(yīng)生成大豆皂苷Ⅲ[22]。

GmSGT2還可催化3-氧-葡萄糖-齊墩果酸、3,28-氧-雙葡萄糖-齊墩果酸、3-氧-葡萄糖-白樺脂酸與UDP-Gal反應(yīng);GmSGT2不能催化28-氧-葡萄糖-齊墩果酸、28-氧-葡萄糖-白樺脂酸,說(shuō)明GmSGT2僅能實(shí)現(xiàn)3號(hào)位糖上加糖,不能實(shí)現(xiàn)28號(hào)位糖上加糖。雖然同為五環(huán)三萜單糖修飾化合物,但催化金盞花苷E的效率要高于其他化合物,這可能是因?yàn)槠?號(hào)位修飾的是葡萄糖,而非葡萄糖醛酸,因?yàn)镾BMG作為天然底物,其修飾就是葡萄糖醛酸,與金盞花苷E結(jié)構(gòu)更接近。

2.3 GmSGT2催化金盞花苷E反應(yīng)酶學(xué)性質(zhì)表征

探究不同反應(yīng)條件下GmSGT2催化金盞花苷E的酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果見(jiàn)圖3(a)～(c)。

圖3 溫度、pH、孵育時(shí)間和酶量對(duì)轉(zhuǎn)化率或酶活的影響Fig.3 Effects of temperature,pH,incubation time and enzyme concentration on the conversion rate or enzyme activity

由圖3(b)可知:當(dāng)pH為7.5時(shí),GmSGT2酶活最高,GmSGT2催化金盞花苷E的最適pH約為7.5;在pH為7.5～9的緩沖液中,堿性GmSGT2酶活較高,均在80%以上。在相同pH不同類(lèi)型緩沖液中,GmSGT2催化金盞花苷E的酶活也不一樣,在pH為6的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液中,其相對(duì)酶活僅有63.13%,而在pH為6的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中,其相對(duì)酶活為87.20%,相差了24.07%。即使是相同pH的不同緩沖液也會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響,這與文獻(xiàn)[23-24]結(jié)果一致。與多數(shù)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶催化特點(diǎn)相似,GmSGT2催化反應(yīng)的最適pH為7～9,偏堿性。

由圖3(a)可知:GmSGT2催化金盞花苷E的最適溫度是40 ℃,當(dāng)溫度為35 ℃時(shí),相對(duì)酶活為89.40%;當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí),GmSGT2相對(duì)酶活受到較大影響,相對(duì)酶活為48.36%,GmSGT2受溫度影響較大。這與GmSGT2催化GLMG的結(jié)果相似,在45 ℃條件下,GmSGT2催化GLMG的相對(duì)酶活約為最適溫度下的48%,活性下降明顯,但GmSGT2催化GAMG受溫度影響比GLMG與金盞花苷E的影響較小。與其他UGT性質(zhì)相似,如UGT73P28催化環(huán)黃芪醇反應(yīng)的最適溫度是37 ℃,而UGT催化反應(yīng)的最適溫度為35～40 ℃[24]。

由圖3(c)可知:當(dāng)孵育0.5 h后,GmSGT2對(duì)金盞花苷E和UDP-Gal的相對(duì)酶活依然有90.32%;孵育2 h后,GmSGT2相對(duì)活性剩余74.23%,GmSGT2催化活性下降相對(duì)緩慢;在2 h之后,穩(wěn)定性急劇下降,孵育3 h后,GmSGT2相對(duì)酶活為35.93%;經(jīng)過(guò)5 h的孵育,GmSGT2相對(duì)酶活性?xún)H剩9.76%。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證GmSGT2催化金盞花苷E與UDP-Gal反應(yīng)酶活,設(shè)置不同酶量反應(yīng)、定點(diǎn)時(shí)間取樣檢測(cè),結(jié)果如圖3(d)所示。由圖3(d)可知:與GmSGT2熱穩(wěn)定性趨勢(shì)一致,當(dāng)控制GmSGT2為50 μg時(shí),反應(yīng)3 h后,金盞花苷E轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定,轉(zhuǎn)化率為72.67%;當(dāng)酶量增加至100 μg,保持其他反應(yīng)條件不變,金盞花苷濃度仍為0.5 mmol/L,3 h后金盞花苷E的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95.03%,說(shuō)明在相同時(shí)間內(nèi),限制金盞花苷E轉(zhuǎn)化率的主要原因是有效酶分子數(shù)量,通過(guò)增大酶量,金盞花苷E轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%。在100 μg酶量的反應(yīng)體系下,當(dāng)金盞花苷E濃度為250 μmol/L時(shí),可實(shí)現(xiàn)底物100%轉(zhuǎn)化。

GmSGT2從大豆cDNA中克隆獲得,所用引物為GmSGT2-F:5′-C￣G￣C￣G￣G￣A￣T￣C￣C￣A￣T￣G￣G￣A￣G￣A￣A￣G￣A￣A￣G￣A￣A￣G￣G￣G￣T￣G￣A￣G￣C￣T￣A￣A-3′,GmSGT2-R:5′-A￣T￣A￣A￣G￣A￣A￣T￣G￣C￣G￣G￣C￣C￣G￣C￣T￣T￣A￣A￣G￣G￣A￣T￣T￣G￣G￣G￣T￣G￣C￣G￣G￣T￣C￣T￣C￣T￣T￣G￣A-3′。引物包含2個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)BamHⅠ、NotⅠ,分別位于GmSGT2的5′端和3′端。將6個(gè)組氨酸殘基融合到重組酶GmSGT2的N端,消化連接GmSGT2基因至表達(dá)載體pET28a,構(gòu)建pET28a-GmSGT2質(zhì)粒。將得到的質(zhì)粒通過(guò)大腸轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 GmSGT2催化金盞花苷E的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

利用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行擬合,結(jié)果如圖4所示。

圖4 GmSGT2米氏動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定Fig.4 Michaelis constant of GmSGT2

由圖4可知:GmSGT2催化金盞花苷E反應(yīng)的Km(Km為酶催化反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度)為(0.12±0.03) mmol/L,kcat(kcat為催化常數(shù))為(0.32±0.02) s-1,催化效率kcat/Km是(2.71±0.22) L/(mmol·s),與文獻(xiàn)[23]的結(jié)果相比,GmSGT2催化GAMG的催化效率kcat/Km是0.78 L/(mmol·s),GmSGT2催化金盞花苷E的催化效率kcat/Km是催化GAMG 的3.4倍[23]。由此可見(jiàn),GmSGT2催化UDP-Gal反應(yīng)時(shí),金盞花苷E是更好的糖基受體。

2.5 GmSGT2分子對(duì)接

通過(guò)SWISS-MODEL,GmSGT2同源建模的參數(shù)分別為Seq Identity:65.50%;GMQE:0.89;QMEAN:-1.26,說(shuō)明UGT73P12可以作為GmSGT2模型[9],通過(guò)AUTODOCK-Vina對(duì)接,結(jié)果如圖5所示。

圖5 GmSGT2催化金盞花苷E與UDP-Gal反應(yīng)的底物識(shí)別機(jī)制Fig.5 Substrate recognition mechanism of GmSGT2 toward calunduloside E and UDP-Ga-Gal

由圖5可知:Ser19、Ala146、Arg260、Tyr262、Ser291、Leu353、Trp370、Asn371、Thr372和Glu391發(fā)揮底物識(shí)別作用,His20作為催化氨基酸,與Asp123-金盞花苷E形成復(fù)合體,催化金盞花苷E反應(yīng)生成半乳糖苷衍生物,這與已報(bào)道的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶底物催化機(jī)制一致[24-25]。通過(guò)分子對(duì)接闡明GmSGT2底物識(shí)別機(jī)制,便于理解GmSGT2催化的反應(yīng)機(jī)制。

選擇李維平主編的《蛋白質(zhì)工程》[9]為教材．該書(shū)為“案例版”生物工程系列規(guī)劃教材，普通高等教育“十二五”規(guī)劃教材．

3 結(jié)論

GmSGT2催化金盞花苷E與UDP-Gal反應(yīng)得到新的糖苷衍生物金盞花苷E-半乳糖。GmSGT2還可催化3-氧-葡萄糖-齊墩果酸、3,28-氧-雙葡萄糖-齊墩果酸、3-氧-葡萄糖-白樺脂酸與UDP-Gal反應(yīng)生成新的半乳糖苷衍生物。GmSGT2催化金盞花苷E的最適溫度、pH分別為40 ℃、7.5,這與多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶特征一致。在最適溫度、pH反應(yīng)條件下,GmSGT2催化金盞花苷E的催化效率kcat/Km為(2.71±0.22) L/(mmol·s)。

通過(guò)分子對(duì)接分析發(fā)現(xiàn),Ser19、Ala146、Arg260、Tyr262、Ser291、Leu353、Trp370、Asn371、Thr372和Glu391發(fā)揮底物識(shí)別作用,His20-Asp123-金盞花苷E形成復(fù)合體,催化金盞花苷E反應(yīng)生成半乳糖苷衍生物。