梁瑞強(qiáng),劉彤彤,羅嬌依,曹 進(jìn),孫姍姍

(中國(guó)食品藥品檢定研究院 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(食品質(zhì)量與安全),北京 100050)

蛋白類抗原是引起食物過(guò)敏的主要因素,其中蝦肉又屬于主要的過(guò)敏食物[1-2]。在臨床上,曾有因食用蝦而導(dǎo)致過(guò)敏的報(bào)道,蝦肉過(guò)敏可引起皮膚刺激和消化系統(tǒng)紊亂,更嚴(yán)重的情況會(huì)導(dǎo)致血管性水腫和休克[3]。蝦過(guò)敏原主要包括原肌球蛋白、肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白和血藍(lán)蛋白等,因此,針對(duì)這些過(guò)敏原的性質(zhì)特點(diǎn),免疫學(xué)技術(shù)、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等分析蝦過(guò)敏原的方法相繼出現(xiàn)[4-8]。目前,我國(guó)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求:對(duì)可能引起過(guò)敏反應(yīng)的食品及其制品進(jìn)行相關(guān)標(biāo)注和提示[9]。

對(duì)于食品過(guò)敏原的檢測(cè),技術(shù)人員常采用實(shí)時(shí)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)法(RT-PCR)或酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[10]。RT-PCR是通過(guò)測(cè)定與過(guò)敏原蛋白質(zhì)相關(guān)的DNA片段而得到過(guò)敏原蛋白的含量,若過(guò)敏原蛋白的基因序列中有未知基因序列,則該方法不適用。ELISA法的基本原理是抗體和抗原的相互作用,如果樣品中非過(guò)敏原蛋白與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng),則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外,光譜法、電泳法、比色法和液相色譜法等雖然都可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定,從而應(yīng)用于食品過(guò)敏原檢測(cè),但對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品也不適用。相比于上述技術(shù)手段,超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS)不僅可以通過(guò)離子質(zhì)荷比(m/z)的差異同時(shí)鑒定多種蛋白質(zhì),還能通過(guò)測(cè)定目標(biāo)肽段來(lái)定量蛋白質(zhì)含量,具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化進(jìn)樣的優(yōu)勢(shì)[11]。采用UPLC-MS法進(jìn)行過(guò)敏原定量分析不僅可以避免ELISA法檢測(cè)時(shí)可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)的缺點(diǎn),還能一定程度上彌補(bǔ)RT-PCR法遇到未知基因序列而無(wú)法定量的不足。通常,使用質(zhì)譜技術(shù)研究食品過(guò)敏原的對(duì)象主要集中在含有牛奶、堅(jiān)果類和大豆成分的食品。如,含有牛奶的飲料、水果制品和烘烤類食品,含有各類堅(jiān)果(核桃仁、杏仁等)的預(yù)包裝食品,含有大豆成分的復(fù)雜加工食品等,但對(duì)于肉制品中蝦類過(guò)敏原的研究相對(duì)較少。因此,基于食品安全監(jiān)管需求、技術(shù)優(yōu)勢(shì)和現(xiàn)有研究的短板,采用UPLC-MS技術(shù)開(kāi)發(fā)肉制品中蝦過(guò)敏原的檢測(cè)方法是一個(gè)具有前景的方向。

由于蛋白質(zhì)具有分子量大、電荷多等特點(diǎn),單純依靠質(zhì)荷比(m/z)并不能直接實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定,需要采用合適的酶解方法將目標(biāo)蛋白質(zhì)降解成肽段,再?gòu)闹袑ふ夷軌虼淼鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)和含量特點(diǎn)的專屬性肽段(特征肽段)進(jìn)行分析。筆者課題組劉彤彤等[12]前期研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)獲得肉制品中蝦過(guò)敏原的特征肽段,并完成了使用UPLC-MS技術(shù)檢測(cè)過(guò)敏原含量方法的開(kāi)發(fā)。對(duì)于具體含量測(cè)定方法,不僅需要保證使用此方法進(jìn)行檢測(cè)所得結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信程度,而且還要評(píng)定測(cè)量不確定度,以使測(cè)定方法的結(jié)果較為客觀。

因此,本研究的目的在于通過(guò)測(cè)量不確定度來(lái)表征所開(kāi)發(fā)的UPLC-MS檢測(cè)結(jié)果的合理離散度并評(píng)估測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量,并建立該方法測(cè)定肉制品中蝦過(guò)敏原含量的不確定度數(shù)學(xué)模型,分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中引入不確定度的分量和占比,得到對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響的主要因素,以期為在實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景中使用此方法的操作過(guò)程提供合理建議,也為提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度和置信度提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

UPLC-Xevo TQ-S型超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀、胰蛋白酶(質(zhì)譜級(jí),1 mg),美國(guó)沃特世公司;Synergy HT型酶標(biāo)儀,德國(guó)BioTek 公司;B-491型恒溫水浴鍋,瑞士步琪公司;AL204、XP205型電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司;SORVALL Legend MICRO21 R型離心機(jī),美國(guó)賽默飛世爾科技公司;ZWY-240型渦旋振蕩器,美國(guó)Scientific Industries 公司。

1.2 試劑

甲酸、乙腈(質(zhì)譜純)、胰蛋白酶(質(zhì)譜級(jí),1 mg),美國(guó)賽默飛世爾科技公司;三羥甲基氨基甲烷(分析純),美國(guó)西格瑪奧德里奇公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)片劑,北京索萊寶科技有限公司;鹽酸(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Bradford 蛋白測(cè)定試劑盒,美國(guó)伯樂(lè)公司;對(duì)照品肽段:IR-9(序列為IVELEEER,純度≥97.05%,批號(hào)為P200720-XT642878),內(nèi)標(biāo)肽段為IR-9*(序列為IVEL*EEER,純度≥95.40%,批號(hào)為P200720-XT818725),上海吉爾生化有限公司;實(shí)驗(yàn)用水由H2O pro-DI-B型超純水器(德國(guó)賽多利斯公司)制備。

PBS溶液:取PBS 片劑1片加 100 mL 超純水超聲溶解后,混勻即得。

胰蛋白酶溶液:用 1 mL 超純水溶解胰蛋白酶即得,質(zhì)量濃度為 1 mg/mL。

1.3 樣品

從京東商城購(gòu)買包含蝦類成分的肉制品(包括不同品牌的香腸、肉丸和火腿等)作為樣品,共20批;空白樣品(牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鱸魚、黑魚、鯉魚、黃鱔等比例混合)購(gòu)于北京物美超市。由于蝦類屬于節(jié)肢動(dòng)物門生物,與脊索動(dòng)物門中哺乳綱、鳥(niǎo)綱和硬骨魚綱的親源性較遠(yuǎn),故選為陰性基質(zhì);另因以上肉類常作為混雜肉類制成熟食預(yù)包裝食品,故選為研究基質(zhì)對(duì)象。所有樣品儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。

1.4 儀器及分析條件

在前期的方法開(kāi)發(fā)工作中,通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了蝦過(guò)敏原蛋白的特征肽段,并合成了對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)肽段。將特征肽段作為對(duì)照品(外標(biāo)),同位素內(nèi)標(biāo)肽段作為內(nèi)標(biāo),使用UPLC-Xevo TQ-S質(zhì)譜自帶的IntelliStart技術(shù)自動(dòng)得到內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)的質(zhì)譜條件和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)通道參數(shù),并根據(jù)在超高效液相色譜上外標(biāo)、內(nèi)標(biāo)的色譜行為優(yōu)化得到合適的色譜條件。

具體色譜條件為色譜柱UPLC HSS T3(150 mm×2.1 mm,1.8 μm,美國(guó)沃特世公司)、柱溫30 ℃、進(jìn)樣量5 μL、流速0.3 mL/min。流動(dòng)相:A相為0.1%甲酸-水溶液(體積分?jǐn)?shù)),B相為乙腈。梯度洗脫程序:0 min,V(A)∶V(B)=82∶18;0.5 min,V(A)∶V(B)=82∶18;8.0 min,V(A)∶V(B)=55∶45,8.3 min,V(A)∶V(B)=18∶82;8.6 min,V(A)∶V(B)=18∶82 ;9.0 min,V(A)∶V(B)=82∶18;11.5 min,V(A)∶V(B)=82∶18。

質(zhì)譜條件為利用正離子掃描方式的電噴離子源(ESI+),掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),毛細(xì)管電壓3.2 kV,去溶劑氣溫度500 ℃,離子源溫度150 ℃,脫溶劑氣流量800 L/h,錐孔氣流量為150 L/h。MRM通道參數(shù)見(jiàn)表1,其中565.5→917.6為外標(biāo)肽段IR-9的定量離子對(duì),569.0→924.7為內(nèi)標(biāo)肽段IR-9*的定量離子對(duì)。

表1 蝦過(guò)敏原肽段MRM通道參數(shù)

1.5 對(duì)照品溶液的制備

在前期方法開(kāi)發(fā)階段,根據(jù)樣品中待測(cè)成分的大致含量范圍確定了標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的工作范圍,從而得到對(duì)照品溶液的制備方法。

分別精確稱取1.04 mg外標(biāo)IR-9、0.76 mg內(nèi)標(biāo)IR-9*,用1 mL Tris-HCl(50 mmol/L)溶液溶解,得到外標(biāo)溶液IR-9濃度為893.8 μmol/L、內(nèi)標(biāo)溶液IR-9*濃度為638.1 μmol/L。再分別吸取外標(biāo)溶液112.0 μL,用50 mmol/L Tris-HCl溶液定容至5 mL,內(nèi)標(biāo)溶液31.3 μL,用50 mmol/L Tris-HCl溶液定容至2 mL,得到外標(biāo)儲(chǔ)備溶液濃度為20 μmol/L、內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液濃度為10 μmol/L。進(jìn)一步稀釋得到濃度為5 μmol/L外標(biāo)中間溶液和濃度為2.5 μmol/L的內(nèi)標(biāo)中間溶液。取適量外標(biāo)中間溶液,再加入內(nèi)標(biāo)中間溶液,用水稀釋定容,分別配制成外標(biāo)濃度為0.001、0.01、0.1、0.5和2.0 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(各濃度工作溶液均含有0.1 μmol/L內(nèi)標(biāo)溶液)。

1.6 樣品溶液的制備

根據(jù)樣品的性質(zhì)特點(diǎn)并參照文獻(xiàn)[11]所述樣品處理方法,對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行研究,得到了本研究的樣品溶液制備方法。

在50 mL離心管中精密稱取樣品5 g。用移液器準(zhǔn)確加入30 mL PBS溶液,超聲提取30 min。設(shè)置10 000 r/min的轉(zhuǎn)速,溫度為15 ℃,離心10 min。量取上清液5 mL,加乙腈5 mL,渦旋振蕩1 min后靜置,棄上清液,用1 mL PBS溶液復(fù)溶殘?jiān)?并經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。準(zhǔn)確移取上述濾液500 μL,加入40 μL 2.5 μmol/L內(nèi)標(biāo)溶液、10 μL胰蛋白酶液,渦旋混勻,于37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)16 h,取出并加入體積分?jǐn)?shù)10%的甲酸-水溶液10 μL以終止反應(yīng),補(bǔ)超純水至1 mL。設(shè)置10 000 r/min的轉(zhuǎn)速,溫度為4 ℃,離心10 min,得到待分析的上清溶液。

1.7 數(shù)學(xué)模型的建立

據(jù)《測(cè)量不確定度表示指南》規(guī)定:測(cè)量不確定度評(píng)定步驟時(shí),首先要建立數(shù)學(xué)模型,具體數(shù)學(xué)模型應(yīng)當(dāng)包含所有對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度有影響的修正值和修正因子。在測(cè)量中,當(dāng)被測(cè)量值(即輸出量)由其他量(即輸入量)通過(guò)函數(shù)來(lái)確定時(shí),可以得到一個(gè)數(shù)學(xué)模型,這樣建立的數(shù)學(xué)模型可用來(lái)計(jì)算測(cè)量結(jié)果,也能用來(lái)評(píng)定測(cè)量結(jié)果的不確定度。實(shí)際情況中,對(duì)于一些檢測(cè)方法,雖然有些輸入量對(duì)測(cè)量結(jié)果有影響,但由于信息量的缺乏,在具體測(cè)量時(shí)無(wú)法定量計(jì)算它們對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響,從而無(wú)法得到與輸出量相關(guān)的解析表達(dá)式;也有些輸入量由于對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響很小,從而可以被忽略不計(jì),這時(shí)測(cè)量不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型才可以與計(jì)算公式相同。

根據(jù)樣品處理過(guò)程,得到蝦過(guò)敏原含量的計(jì)算公式式(1),此式描述了被測(cè)量(蝦過(guò)敏原含量,即輸出量)與酶解液中外標(biāo)濃度(輸入量)之間的函數(shù)關(guān)系,因此將式(1)作為本次不確定度的評(píng)定數(shù)學(xué)模型。

(1)

式中:X為每1 kg樣品中蝦過(guò)敏原的質(zhì)量,mg/kg;c為酶解溶液中外標(biāo)的濃度,μmol/L;V1為提取樣品時(shí)加入PBS溶液的體積,mL;V2為酶解溶液的定容體積,mL;V3為待酶解樣品提取溶液的體積,mL;m為稱樣量,g;M為蝦過(guò)敏原(蛋白質(zhì))的摩爾質(zhì)量,32 663 g/mol;1 000為換算系數(shù)。

1.8 不確定度來(lái)源分析

綜上可知,本研究方法的不確定度來(lái)源主要包括樣品稱量、重復(fù)性試驗(yàn)、方法準(zhǔn)確度、樣品前處理過(guò)程和樣品溶液測(cè)定過(guò)程,同時(shí)每個(gè)過(guò)程引入的不確定度又有各自的分量,結(jié)合文獻(xiàn)[13-14]將這些不確定度來(lái)源和相互關(guān)系用“魚骨圖”表示,具體見(jiàn)圖1。

圖1 不確定度來(lái)源分析Fig.1 Analysis of uncertainty sources

1.9 樣品稱量引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度um,rel

本研究用使用萬(wàn)分之一電子天平稱樣,每次稱量會(huì)引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度,而樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由多次稱量的不確定度合成。單次稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度以及樣品稱量引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線不確定度的計(jì)算見(jiàn)式(2)～(3)。

(2)

式中:um,rel(n)為單次稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;um為單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度,g。

(3)

式中:um,rel為供試品稱量過(guò)程引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur,rel

平行稱量同一肉制品樣品6份,按1.6所示方法處理,得到6次測(cè)定結(jié)果的均值。由于此不確定度分量對(duì)應(yīng)的測(cè)量值屬于多次獨(dú)立重復(fù)測(cè)量的結(jié)果,可按照A類不確定度評(píng)定[15],具體計(jì)算見(jiàn)式(4)。

(4)

式中:ur為重復(fù)性試驗(yàn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度,mg/kg;ur,rel為重復(fù)性試驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;Sr為n份平行樣品含量測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差,mg/kg;ci為單份樣品的含量測(cè)定結(jié)果,mg/kg;c0為n份平行樣品含量測(cè)定結(jié)果的平均值,mg/kg;n為樣品重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定的次數(shù)。

1.11 方法準(zhǔn)確度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ua,rel

方法準(zhǔn)確度一般用回收率來(lái)表示。本次回收率試驗(yàn)過(guò)程中選取3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo),在每個(gè)濃度水平中平行處理6份樣品,共得出回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)18個(gè),可計(jì)算得到回收率的平均值。按照顯著性檢驗(yàn)(t檢驗(yàn)),若回收率的平均值與100%的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,引入的不確定度即用回收率平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算[13],具體計(jì)算見(jiàn)式(5)。

(5)

式中:ua為回收率平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度,%;ua,rel為方法準(zhǔn)確度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;Sa為回收率平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差;ai為單次回收率,%;a0為回收率的平均值,%;n為回收率測(cè)定的次數(shù)(n=18)。

1.12 樣品前處理過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uxv,rel

樣品的前處理過(guò)程用到了不同量程的移液器進(jìn)行吸液,分別為1～10 mL移液器吸液10 mL,0.5～5 mL移液器吸液5 mL,100～1 000 μL移液器分別吸液1、0.5和0.44 mL,10～100 μL移液器吸液40 μL(0.04 mL)以及0.5～10 μL移液器吸液10 μL(0.01 mL),共經(jīng)7次操作,具體計(jì)算見(jiàn)式(6)。

(6)

式中:uxv,rel為前處理過(guò)程取引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;u(v1),u(v2),…,u(vi)分別為用移液器吸液體積為v1,v2,…,vi時(shí)的引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;n1,n2,…,ni為用移液槍進(jìn)行吸液v1,v2,…,vi的操作次數(shù)。而每次吸液操作引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度又由移液器的校準(zhǔn)u1(vi)、溫度效應(yīng)u2(T,vi)和吸液體積重復(fù)性u(píng)3(vi)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度3個(gè)分量合成得到。

u1(vi)的計(jì)算見(jiàn)式(7)。

(7)

式中:u1(vi)為移液器校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;Evi為移液器對(duì)應(yīng)吸液體積的允許誤差,mL;vi為移液器對(duì)應(yīng)的吸液體積,mL;k為包含因子。

u2(T,vi)的計(jì)算見(jiàn)式(8)。

(8)

式中:V為量具取液或者定容的體積,mL;ΔT為實(shí)驗(yàn)環(huán)境的實(shí)際溫度與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)溫度(20 ℃)的偏差,℃(本次取值為5 ℃);2.1×10-4為水的膨脹系數(shù),℃-1。

u3(vi)的計(jì)算見(jiàn)式(9)。

u3(vi)=Svi/vi

(9)

式中:Svi為用移液器吸取樣品前處理操作中對(duì)應(yīng)的各吸液體積的水10次并進(jìn)行稱量的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差,mL;vi為用移液器吸取樣品前處理操作中對(duì)應(yīng)的各吸液體積,mL。

1.13 樣品溶液測(cè)定過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uxc,rel

樣品溶液測(cè)定過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由對(duì)照品純度up,rel、對(duì)照品稱量uω,rel、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制us,rel和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合uL,rel這4部分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成得到,具體計(jì)算見(jiàn)式(10)。

(10)

up,rel的計(jì)算見(jiàn)式(11)。

(11)

式中:up,rel為對(duì)照品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;Ep為對(duì)照品純度允許誤差,%;p為對(duì)照品純度,%。

uω,rel的計(jì)算見(jiàn)式(12)。

(12)

式中:uω,rel為對(duì)照品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;uω為對(duì)照品稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度;ω為稱取對(duì)照品的質(zhì)量,g。

本實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中進(jìn)行了100～1 000 μL移液器吸液1 mL、0.5 mL,10～100 μL移液槍吸液0.1 mL,20～200 μL移液槍吸液185.8 μL、112.0 μL,0.5～5 mL移液槍吸液2.5mL,10 mL容量瓶定容,5 mL容量瓶定容,共8種操作。因此us,rel的計(jì)算見(jiàn)式(13)。

(13)

式中:us,rel為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;uv1、uv2、…、uvi分別為使用不同量具(不同規(guī)格移液器或容量瓶)的吸液或定容體積為v1、v2、…、vi時(shí)的產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;n1、n2、…、ni為吸液或定容體積為v1、v2、…、vi時(shí)對(duì)應(yīng)量具的使用次數(shù)。每次吸液或定容的操作產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度又由量具的校準(zhǔn)u1(vi)、溫度效應(yīng)u2(T,vi)和量具體積重復(fù)性u(píng)3(vi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成得到。對(duì)應(yīng)的計(jì)算方法參照1.12中的公式(7)～(9)。

uL,rel的計(jì)算見(jiàn)式(14)～(16)。

(14)

(15)

(16)

式中:SL為標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差;a和b分別為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距和斜率;n為擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn)數(shù);p為樣品的測(cè)定次數(shù);C0為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度的平均值;C為樣品溶液中待測(cè)成分濃度的平均值;C0j為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的濃度;Aaj為各標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的實(shí)際響應(yīng)值;Aj為根據(jù)回歸方程計(jì)算的各點(diǎn)理論響應(yīng)值;uL為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度;uL,rel為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

1.14 方法的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度

方法的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(uc,rel)由各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量通過(guò)式(17)計(jì)算。

(17)

方法的相對(duì)擴(kuò)展不確定度(Urel)計(jì)算見(jiàn)式(18)。

Urel=kuc,rel

(18)

式中:uc,rel為方法的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

方法的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度(uc)的計(jì)算見(jiàn)式(19)。

uc=uc,relX

(19)

式中:X為重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果均值。

方法的擴(kuò)展不確定度(U)計(jì)算見(jiàn)式(20)。

U=kuc

(20)

2 結(jié)果與討論

2.1 um,rel計(jì)算結(jié)果

2.2 ur,rel計(jì)算結(jié)果

2.3 ua,rel計(jì)算結(jié)果

2.4 uxv,rel計(jì)算結(jié)果

2.4.1 移液器的校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(vi)

2.4.2 溫度效應(yīng)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(T,vi)

2.4.3 吸液體積重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3(vi)

據(jù)式(9)計(jì)算,u3(10 mL)=0.007 59,u3 (5 mL)=0.000 314,u3(1 mL)=0.000 895,u3(0.5 mL)=0.001 21,u3(0.44 mL)=0.001 06,u3(0.04 mL)=0.001 43,u1(0.01 mL)=0.007 67。

2.4.4 前處理過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定合成

根據(jù)2.4.1～2.4.3節(jié)的計(jì)算結(jié)果,可以合成不同移液器在各自吸液體積時(shí)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度,具體計(jì)算如下

結(jié)合前處理過(guò)程中不同移液器吸液不同體積操作的次數(shù),據(jù)式(6)合成前處理過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度,具體結(jié)果為

2.5 uxc,rel計(jì)算結(jié)果

2.5.1 對(duì)照品純度和對(duì)照品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度up,rel、uω,rel

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度us,rel

對(duì)于100～1 000 μL移液器,吸液1 mL、0.5 mL產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度在2.4.1節(jié)中已說(shuō)明,分別為u1 mL=0.003 62,u0.5 mL=0.005 94。

按照2.4.2所述,據(jù)式(8),溫度效應(yīng)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為0.000 606。

體積重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按2.4.3節(jié)所述參照公式(9)計(jì)算的得到。各移液槍體積重復(fù)性不確定分別為u3(0.1 mL)=0.004 28,u3(185.8 μL)=0.003 05,u3(112 μL)=0.002 57,u3(2.5 mL)=0.000 903。容量瓶體積重復(fù)性不確定度計(jì)算過(guò)程為:分別對(duì)5 mL、10 mL容量瓶用超純水定容,稱質(zhì)量,重復(fù)此操作10次,用得到的稱量數(shù)據(jù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差,進(jìn)而得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:u3(5 mL A)=0.000 333;u3(10 mL A)=0.001 50。

對(duì)每次吸液或定容的操作產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成,結(jié)果如下

根據(jù)式(13)合成標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度us,rel

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uL,rel

外標(biāo)IR-9的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.848 4x-0.008 6,相關(guān)系數(shù)r2=1(n=5,相關(guān)系數(shù)大于 0.999)。橫坐標(biāo)為外標(biāo)的物質(zhì)的量濃度,縱坐標(biāo)為外標(biāo)峰面積與同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值乘以內(nèi)標(biāo)濃度。據(jù)式(14)～(16),標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度C0j分別為0.001、0.01、0.1、0.5和2.0 μmol/L;Aaj分別為0.002 0、0.017 0、0.171 0、0.901 0和3.691 0;Aj分別為-0.006 8、0.009 9、0.176 2、0.915 6和3.688 2。重復(fù)性試驗(yàn)中樣品溶液中待測(cè)成分濃度的平均值C為0.107 μmol/L,C0為0.522 2 μmol/L,b和a分別為1.848 4和-0.008 6。通過(guò)以上數(shù)據(jù)可計(jì)算得到uL=0.003 95 μmol/L。

2.5.4 樣品溶液測(cè)定過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成

據(jù)式(10),結(jié)合2.5.1～2.5.3節(jié)的計(jì)算結(jié)果,對(duì)樣品溶液測(cè)定過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行合成,uxc,rel的具體結(jié)果為

2.6 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度計(jì)算

據(jù)式(17)計(jì)算,由各不確定度分量合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc,rel為

據(jù)式(18),取置信度為95%時(shí)的擴(kuò)展因子k=2,得到方法的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為Urel=2×0.057 9=0.116。

據(jù)式(19),其中X取重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果均值,20.90 mg/kg,得方法的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc=0.057 9×20.90=1.21 mg/kg。

據(jù)式(20),仍取置信度為95%時(shí)的包含因子k=2,計(jì)算得到方法的擴(kuò)展不確定度U=2×1.21=2.42 mg/kg。

因此,運(yùn)用本方法定量分析肉制品中蝦過(guò)敏原含量的結(jié)果為(20.90±2.42) mg/kg。

2.7 各不確定度分量的占比

綜上可知,本方法引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由樣品稱量、重復(fù)性試驗(yàn)、方法準(zhǔn)確度、樣品前處理過(guò)程和樣品溶液測(cè)定過(guò)程5部分產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成得到,各不確定度分量的占比見(jiàn)表2。由表2可直觀看出,用此方法進(jìn)行定量分析,檢測(cè)結(jié)果的不確定度主要來(lái)源于樣品溶液測(cè)定過(guò)程。進(jìn)一步觀察全部不確定度評(píng)定過(guò)程可知,樣品溶液測(cè)定過(guò)程不確定度的主要來(lái)源為對(duì)照品純度、對(duì)照品稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合,占比分別為0.4%、33.5%、21.8%和44.4%。

表2 UPLC-MS測(cè)定肉制品中蝦過(guò)敏原含量的不確定度分量占比

2.8 分析討論

結(jié)合不確定度評(píng)定結(jié)果和2.7節(jié)所示不確定度分量占比分析可知,對(duì)照品的稱量和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程產(chǎn)生了較大的不確定度。

對(duì)于對(duì)照品的稱量,本次實(shí)驗(yàn)采用的是十萬(wàn)分之一天平,稱取1.04 mg,而十萬(wàn)分之一天平的實(shí)際分度值為0.01 mg,如果按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)凡例中的要求“‘精密稱定’系指稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所取重量的千分之一”(注:此處的“重量”即為“質(zhì)量”),則用該天平稱樣至少應(yīng)為10 mg,才能使得稱樣品的千分之一不小于天平的實(shí)際分度值[20]。由于本次研究過(guò)程得到的合成肽段較少,可能導(dǎo)致不確定度的放大。因此,在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中,稱量對(duì)照品的質(zhì)量應(yīng)確保大于所使用天平的最小稱樣量。

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程,本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為0.001～2.000 μmol/L,跨越3個(gè)數(shù)量級(jí)。這可能導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度的平均值偏差的平方和變大,由式(14)可知,該值放大會(huì)增加標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。因此,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)根據(jù)樣品中待測(cè)成分的實(shí)際含量合理配制標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的濃度范圍。

從前期方法開(kāi)發(fā)階段對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果可知,蝦過(guò)敏原含量最低值2.3 mg/kg,最高值為448.1 mg/kg。依據(jù)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》可知,被測(cè)組分含量在1～1 000 mg/kg時(shí),實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)應(yīng)在3.8%～11%(重復(fù)測(cè)定次數(shù)至少為6)[21]。在2.6節(jié)中所列方法的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.116(即11.6%),雖然實(shí)際檢測(cè)時(shí)通常制備2份平行樣,但為盡可能避免不確定度影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,所以在使用本方法檢測(cè)樣品中蝦過(guò)敏原含量時(shí),報(bào)告的檢測(cè)結(jié)果最好帶有與結(jié)果單位相同的測(cè)量不確定度[22]。

3 結(jié)論

本研究評(píng)定了用UPLC-MS法測(cè)定肉制品中蝦過(guò)敏原含量過(guò)程存在的不確定度,發(fā)現(xiàn)定量分析結(jié)果的不確定度主要來(lái)源是樣品溶液測(cè)定過(guò)程,而其中對(duì)照品的稱量和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合產(chǎn)生的不確定度較大,應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中采取增大對(duì)照品稱樣量和合理化標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液濃度范圍等方式以減少不確定度,并在報(bào)告檢測(cè)結(jié)果時(shí)附帶與結(jié)果單位相同的不確定度。本研究將所開(kāi)發(fā)的蝦過(guò)敏原含量測(cè)定方法中可能產(chǎn)生的不確定影響進(jìn)行定量表示,可為后期準(zhǔn)確測(cè)定肉制品中蝦源過(guò)敏原的含量提供科學(xué)依據(jù)。