陳曉霞,路曉慶,張桓虎

(1. 山西醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院,山西 太原 030001;2. 山西省腫瘤醫(yī)院,山西 太原 030001)

普通念珠藻(圖1)俗稱地皮菜[1],屬于藍(lán)藻門念珠藻屬[2],在全國(guó)各地均有所分布,因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特殊的生物活性,而具有重要的藥用價(jià)值[3]。地皮菜中重要的組成部分水應(yīng)激蛋白,屬于酸性多肽,等電點(diǎn)(PI)位于4.3～4.8[4-5]。目前,水應(yīng)激蛋白已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于念珠藻屬中,但其在地皮菜中的含量更為豐富,其中,細(xì)胞外基質(zhì)總蛋白量可達(dá)83.6%[6]。水應(yīng)激蛋白的一些生物學(xué)活性,包括抗輻射、抗干旱和抗瘤性等都顯示其具有重要的研究?jī)r(jià)值[7]。

圖1 野生的念珠藻[1]Fig.1 Wild N. commune vauch[1]

1 水應(yīng)激蛋白的來源

地皮菜由細(xì)胞細(xì)絲和大量細(xì)胞外基質(zhì)組成,水應(yīng)激蛋白則是地皮菜細(xì)胞外基質(zhì)的特征性成分[8],對(duì)于維持細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能具有重要作用[9],可通過基因表達(dá)及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生。這些具有異質(zhì)性,在基因型中具有高度的多樣化,所表達(dá)的一系列蛋白被統(tǒng)稱為水應(yīng)激蛋白[8]。其經(jīng)胞內(nèi)降解和修飾后,相對(duì)分子量大小各異。Sokamoto等[10]報(bào)道稱:水應(yīng)激蛋白是1個(gè)單拷貝基因,由1個(gè)單順反子的操縱子調(diào)控,其各種亞型可能是由于脫酰胺、共價(jià)修飾或者是由蛋白酶水解構(gòu)成。

2 水應(yīng)激蛋白的結(jié)構(gòu)

目前,關(guān)于水應(yīng)激蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)尚未明確。同源建模作為一種模擬蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的常規(guī)技術(shù),具有很強(qiáng)的權(quán)威性[11]。而蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)(SWISS-MODEL)是目前最具有權(quán)威性的系統(tǒng)[12-13]。根據(jù)已知的水應(yīng)激蛋白基因片段,使用SWISS-MODEL對(duì)水應(yīng)激蛋白的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè),結(jié)果見圖2。其具體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定還需要依賴核磁共振和X線晶體學(xué)等技術(shù)的輔助驗(yàn)證。蛋白結(jié)合位點(diǎn)仍需要借助肺通氣功能(PFT)成像功能化探針等技術(shù)進(jìn)一步確定,以期尋找出特異性識(shí)別位點(diǎn)[14]。

圖2 水應(yīng)激蛋白的3D預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)Fig.2 3D predictive structure of N. commune vauch

3 水應(yīng)激蛋白的制備

3.1 水應(yīng)激蛋白的提取和分離

目前對(duì)地皮菜的研究多集中于水應(yīng)激蛋白的活性功能方面,運(yùn)用合適的手段從地皮菜中提取分離出高質(zhì)量的水應(yīng)激蛋白具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。目前,主要通過水提法、鹽提法和酸提法等方式提取植物蛋白[15]。由于水應(yīng)激蛋白在干燥念珠藻中的含量較為豐富,因此,可采用生物化學(xué)手段,如:丙酮硫酸銨沉淀法[16-17]。該方法簡(jiǎn)單快捷,能有效提取水應(yīng)激蛋白[18]。但仍存在一些問題,例如:分離不充分時(shí),會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)混于樣品中。另外,較長(zhǎng)時(shí)間的樣品浸泡,會(huì)影響丙酮對(duì)水應(yīng)激蛋白的修飾。針對(duì)上述問題,應(yīng)繼續(xù)研究相關(guān)的水應(yīng)激蛋白提取、分離方法,以期尋找出更合適的提取方案,來增加提取純度,為水應(yīng)激蛋白的深度提純和開發(fā)創(chuàng)造條件。

3.2 水應(yīng)激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

除了物理方法外,也可通過基因重組技術(shù)誘導(dǎo)原核系統(tǒng)對(duì)水應(yīng)激蛋白進(jìn)行大量表達(dá)[19]?？紤]到遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面,大腸桿菌已成為眾多異源蛋白質(zhì)的首選表達(dá)系統(tǒng)[20]。

目前,學(xué)者們通過對(duì)表達(dá)與純化條件的不斷優(yōu)化,成功獲得了具有生物活性的水應(yīng)激蛋白[17],為其開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。此外,進(jìn)一步的截短優(yōu)化,成功獲取到了免疫反應(yīng)小、安全性高的活性肽,并明確了截?cái)囿w活性片段的生物活性[17],也為研究水應(yīng)激蛋白各保守結(jié)構(gòu),細(xì)化各結(jié)構(gòu)域的生物活性創(chuàng)造了條件[21]。

4 水應(yīng)激蛋白的生物活性

4.1 抗干旱作用

干旱脅迫是導(dǎo)致作物減產(chǎn)的重要環(huán)境因素[22]。植物可感知缺水信號(hào),并啟動(dòng)應(yīng)對(duì)策略的能力被定義為抗旱能力[23]。地皮菜在干旱或濕潤(rùn)的環(huán)境中都具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。在干旱過程中,能處于一種“靜息”狀態(tài),降低生存活動(dòng),此過程可長(zhǎng)達(dá)100年[24]。而當(dāng)水源充足時(shí),便會(huì)迅速恢復(fù)其原有的生存能力,重新進(jìn)行呼吸及光合作用[25]。早在20世紀(jì)80年代,學(xué)者們已經(jīng)在結(jié)構(gòu)、生理和生化水平上對(duì)地皮菜的干燥耐受性進(jìn)行了研究[26]。Ye等[27]報(bào)道了水應(yīng)激蛋白在藍(lán)藻類生物抵抗干旱環(huán)境中起到的關(guān)鍵作用。Scherer等[28]研究發(fā)現(xiàn):當(dāng)菌落經(jīng)受干燥和再水化的重復(fù)循環(huán)時(shí),地皮菜會(huì)積累一組新的酸性蛋白質(zhì),即為水應(yīng)激蛋白;其經(jīng)由再水化后,分泌到細(xì)胞外多糖鞘中,以維持基質(zhì)的保護(hù)作用,為細(xì)胞提供生存保護(hù)[6,29]。總之,水應(yīng)激蛋白在地皮菜遭遇環(huán)境脅迫,特別是在干旱時(shí),發(fā)揮著重要作用,即水應(yīng)激蛋白可能是一種具有細(xì)胞應(yīng)激抗性的蛋白。

4.2 抗輻射作用

地皮菜可適應(yīng)具有高水平輻射的環(huán)境[10]。在黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng),會(huì)造成水應(yīng)激蛋白的缺失,而紫外線會(huì)影響水應(yīng)激蛋白mRNA的擴(kuò)增,導(dǎo)致水應(yīng)激蛋白分泌增加,使擴(kuò)增比例最高可達(dá)4倍[30]。由此說明:水應(yīng)激蛋白在抗輻射中發(fā)揮著重要作用[9]?，F(xiàn)今社會(huì)發(fā)展迅速,人們受到輻射損傷的風(fēng)險(xiǎn)大大增加,因此,需要不斷尋找更為有效、安全的抗輻射藥物。Peng等[31]和倫博書等[32]研究認(rèn)為:部分中藥具有輻射保護(hù)作用,可抗自由基,抑制DNA的損傷,且具有更少的副作用。因此,地皮草中的水應(yīng)激蛋白有望被開發(fā)為一種新的抗輻射制劑。

4.3 抗腫瘤活性

近年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞水應(yīng)激蛋白的抗癌功效也進(jìn)行了一系列研究。Guo等[5]的研究結(jié)果證實(shí):水應(yīng)激蛋白可通過殺滅結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116、HT-29和SW480)來阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,而這種殺傷作用對(duì)正常腸上皮細(xì)胞幾乎無影響。水應(yīng)激蛋白還可通過G1/S阻滯誘導(dǎo)生長(zhǎng),介導(dǎo)含半胱氨酸蛋白酶(caspase)依賴途徑,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[5]。通過靶向受體FZD1,水應(yīng)激蛋白通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路,從而發(fā)揮抗結(jié)腸癌的效應(yīng)[17]。同時(shí),郭松佳[33]進(jìn)行了裸鼠實(shí)驗(yàn),同樣證實(shí)了在機(jī)體水平,水應(yīng)激蛋白可以損傷腫瘤細(xì)胞,而對(duì)正常細(xì)胞無影響。

在腫瘤發(fā)展過程中,腫瘤轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要環(huán)節(jié),通?？赏ㄟ^黏附改變,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移開端[34]。近年來,郭松佳等[35]發(fā)現(xiàn):水應(yīng)激蛋白能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和浸潤(rùn)。這一過程是通過促進(jìn)人結(jié)直腸腺癌上皮細(xì)胞(DLD1)細(xì)胞間的黏附,以降低細(xì)胞-基質(zhì)間黏附的實(shí)現(xiàn),同時(shí),此過程由鈣黏蛋白E(E-cadherin)及神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)等關(guān)鍵分子以及下調(diào)PI3K/ AKT/mTOR通路激活自噬介導(dǎo),證實(shí)了念珠藻水應(yīng)激蛋白具有顯著的抗結(jié)腸癌活性[36]。目前,本課題組正在研究水應(yīng)激蛋白抗胃癌及對(duì)其他腫瘤的效果,以期可以為腫瘤患者提供新的治療方法。

4.4 糖苷酶活性

水應(yīng)激蛋白具有β-D-半乳糖苷酶活性,并且與1,4-β-D-木糖苷酶活性相關(guān),可參與細(xì)胞周圍高分子聚合物的水解[37]。β-D-半乳糖苷酶通過催化乳糖,可進(jìn)一步水解生成葡萄糖和半乳糖[38]。1,4-β-D-木糖苷酶在木聚糖降解的過程中起著重要的作用,可通過木糖和木糖寡糖的非還原末端連續(xù)去除β-木糖基殘基,從而在木聚糖水解期間減輕內(nèi)切木聚糖酶的終產(chǎn)物抑制效應(yīng)。降解之后的木糖對(duì)于念珠藻共生的細(xì)菌及真菌生長(zhǎng)過程均具有重要作用,可幫助細(xì)胞擴(kuò)散,從而擴(kuò)大該藍(lán)藻的菌落[39]。

5 應(yīng)用前景與展望

5.1 提取工藝的優(yōu)化

目前,水應(yīng)激蛋白的提取工藝,諸如:丙酮沉淀提取法具有殘留雜質(zhì)多、會(huì)破壞有效成分等缺點(diǎn),而基因工程表達(dá)的蛋白常常會(huì)形成不溶性的包涵體,喪失其原有生物功能。因此,尋找合適的蛋白提取工藝,尤其是將各法所提取的蛋白在各項(xiàng)指標(biāo)上進(jìn)行比對(duì),具有重要意義。

5.2 農(nóng)作物抗旱及抗輻射的應(yīng)用

對(duì)于植物抗干旱能力的提高已成為目前作物研究的一大熱點(diǎn)。但尚未有過表達(dá)水應(yīng)激蛋白能否改善作物抗干旱能力的相關(guān)報(bào)道,因此,深入利用水應(yīng)激蛋白的抗旱特性,有望提高作物抵御嚴(yán)重干旱和抗紫外線輻射的能力。

5.3 抗消化系統(tǒng)腫瘤的應(yīng)用前景與對(duì)分子機(jī)制的研究

目前,水應(yīng)激蛋白對(duì)于腫瘤細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚,并且缺乏其激活下游信號(hào)通路的機(jī)制說明。根據(jù)已獲取的基因序列,對(duì)水應(yīng)激蛋白及受體蛋白的結(jié)合效果進(jìn)行模擬,以尋找受體蛋白,對(duì)于篩選出靶標(biāo)受體具有重要的參考價(jià)值。目前,國(guó)內(nèi)外研究者仍在不斷挖掘中草藥中的抗癌成分,并以此為基礎(chǔ),提取了大量有抗癌潛力的成分。研究提示:水應(yīng)激蛋白在消化道腫瘤中可能發(fā)揮著重要的作用,具有重大的研究意義。

5.4 蛋白制劑的開發(fā)

藥物研發(fā)人員可以根據(jù)水應(yīng)激蛋白的特性,利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)進(jìn)一步開發(fā)出適用于腫瘤患者的蛋白藥物?；蚬こ炭梢詫?shí)現(xiàn)水應(yīng)激蛋白的大量制備。然而對(duì)于蛋白質(zhì)類藥物而言,其相對(duì)分子量大,給藥周期長(zhǎng)而頻繁。如何利用新的生物技術(shù),以提高水應(yīng)激蛋白的生物利用度,對(duì)水應(yīng)激蛋白進(jìn)行改造修飾,穩(wěn)定其生物活性,仍值得進(jìn)一步研究。因此,水應(yīng)激蛋白仍具有巨大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力。