關(guān)鍵詞： 煙粉虱；BtPMaT1 基因；RNA 干擾（RNAi）；煙草

中圖分類號(hào)： S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1004–390X （2024） 06?0010?09

煙草（Nicotiana tabacum） 是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，不僅可以帶來(lái)大量稅收，還可以使種植地?zé)熮r(nóng)實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)增收[1]。但煙葉生產(chǎn)一直受到病毒病困擾，一旦感染病毒，煙草經(jīng)濟(jì)價(jià)值將大幅下降，給國(guó)家和煙農(nóng)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。病毒病主要通過(guò)刺吸式口器昆蟲(chóng)刺吸煙草葉片汁液傳播[3]，其中煙粉虱（Bemisia tabaci） 是主要的傳播媒介[4]。煙粉虱隸屬于半翅目（Hemiptera） 粉虱科（Aleyrodidae），最初發(fā)現(xiàn)于中東、北非和地中海等熱帶和亞熱帶地區(qū)[5]。自20 世紀(jì)80 年代以來(lái)，煙粉虱通過(guò)進(jìn)出口花卉苗木在世界各地迅速傳播，目前已在90 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛暴發(fā)[6]。1949 年，中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)煙粉虱[7]，但當(dāng)時(shí)僅為零星現(xiàn)象，并未造成廣泛危害；直到20 世紀(jì)90 年代，煙粉虱傳播加劇，才引起廣泛關(guān)注[8]。目前，煙粉虱的防治主要依賴化學(xué)防治[9]，但由于藥劑的不合理使用以及煙粉虱易產(chǎn)生抗藥性，其危害愈發(fā)嚴(yán)重[10-11]。同時(shí)，隨著“綠色煙葉”“有機(jī)煙葉”等概念的興起，化學(xué)藥劑的使用將受到越來(lái)越嚴(yán)格的限制[12]。

植物可通過(guò)產(chǎn)生次生代謝物獲得抗蟲(chóng)性，如番茄通過(guò)分泌酚糖抵抗煙粉虱[13]。酚糖是一類重要的抗蟲(chóng)次生代謝產(chǎn)物，能夠抑制昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，但酚糖對(duì)植物有一定的毒性，因此，在害蟲(chóng)離去后，植物需要迅速降解多余的酚糖。植物利用酚糖丙二?；D(zhuǎn)移酶（phenolic glucoside malonyltransferase，PMaT） 催化酚糖的丙二?；磻?yīng)，實(shí)現(xiàn)解毒作用。XIA 等[13]研究表明：煙粉虱的BtPMaT1 基因與植物的PMaT 是同源基因，且煙粉虱BtPMaT1 基因的同源基因僅存在于植物和少量真菌中，說(shuō)明煙粉虱從植物中獲得這一基因，體現(xiàn)了生物界普遍存在的水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。RNA 干擾（RNA interference，RNAi） 是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA 誘發(fā)的、同源mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象，其作用是沉默相關(guān)基因。RNAi 具有高度特異性、高效性、高穩(wěn)定性等突出特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于作物基因功能研究、抗病、抗蟲(chóng)害、提高作物品質(zhì)等領(lǐng)域[14-15]。XIA 等[13]利用RNA 干擾煙粉虱的BtPMaT1基因，并成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因番茄品系，使煙粉虱對(duì)酚糖敏感，煙粉虱取食轉(zhuǎn)基因番茄7 d后，死亡率為93.35%。煙草和番茄均為茄科作物，因此推測(cè)煙田的煙粉虱亦能通過(guò)BtPMaT1 基因降解煙草產(chǎn)生的酚糖，從而避免對(duì)煙草的毒害。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究構(gòu)建了BtPMaT1基因的RNAi 載體并轉(zhuǎn)化煙草，隨后檢測(cè)轉(zhuǎn)化RNAi煙草對(duì)煙粉虱的抗性，以期為培育抗煙粉虱的煙草品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1供試材料

2023年在云南省玉溪市紅塔區(qū)（102°21′32″E，24°12′22″N，海拔1650 m） 進(jìn)行試驗(yàn)，供試煙草材料為雪茄煙品種云雪6 號(hào)，由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司提供。煙粉虱材料采自云南11 個(gè)不同煙區(qū)的煙田，包括保山市和玉溪市采樣點(diǎn)各2 個(gè)、昆明市采樣點(diǎn)1 個(gè)、臨滄市和文山壯族苗族自治州采樣點(diǎn)各3 個(gè)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

收集煙草上的煙粉虱，提取其總RNA 并克隆煙粉虱BtPMaT1基因，獲得該基因序列。與煙草中相應(yīng)基因進(jìn)行比對(duì)， 在基因保守區(qū)設(shè)計(jì)RNAi靶標(biāo)位點(diǎn)，構(gòu)建RNAi 載體，轉(zhuǎn)化至云雪6 號(hào)煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。選取團(tuán)棵期轉(zhuǎn)基因煙草和云雪6 號(hào)煙草作為材料，接種煙粉虱，觀測(cè)煙株上的煙粉虱數(shù)量，統(tǒng)計(jì)蟲(chóng)量比，評(píng)價(jià)RNAi沉默BtPMaT1基因煙草對(duì)煙粉虱的抗性。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 煙粉虱BtPMaT1基因序列克隆

采用TRIzol Reagent （Invitrogen， Cat 155960-26CN） 提取煙粉虱總RNA，采用Qiagen RNeasy迷你植物試劑盒（Cat 74104） 提取煙草的RNA。在冰上配置10 μL 的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，包括總RNA 2 μg、50 μmol/L oligo （dT） 1 μL、10 mmol/LdNTP 1 μL 以及適量經(jīng)DEPC 處理的水。將該體系在65 ℃ 溫浴5 min后，迅速置于冰上1 min。向上述體系中加入10× RT Buffer 2 μL、25 mmol/LMgCl2 4 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL、40 U/μL RNase-OUT 1 μL 和200 U/μL SuperScript Ⅲ RT 1 μL，在50 ℃ 下保持50 min，并在85 ℃ 下使酶失活，在冰上冷卻終止反應(yīng)，即獲得cDNA。采用Primer5 軟件設(shè)計(jì)特異引物（F：ATGTCGATATCGAGCTCAGTGGCCGTACTAAACG，R：TCAGCAGCTCCGCTTTTCCAATAACTTAAGATCATC），以NEB Q5 高保真酶為聚合酶，以cDNA 為模板，用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以獲得11 個(gè)煙田煙粉虱的BtPMaT1 基因片段。PCR 擴(kuò)增體系為50.0 μL，包括：模版DNA 1.0 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL， 5×Buffer 10.0 μL，10 mmol/L Dntp 混合物1.0 μL，Q5 DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 35.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：① 98 ℃5 min，② 98 ℃ 30 s，③ 58 ℃ 30 s，④ 72 ℃ 30 s，步驟②至④共循環(huán)35 次，⑤ 72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

使用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR 產(chǎn)物，再使用瓊脂糖凝膠DNA 純化試劑盒回收產(chǎn)物?；厥蘸蟮漠a(chǎn)物通過(guò)ClonExpress?Ⅱ快速克隆試劑盒連接到原核表達(dá)載體pET-32a 上，并轉(zhuǎn)化到JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)菌落PCR 鑒定陽(yáng)性克隆，最后提取質(zhì)粒，送至測(cè)序公司分析測(cè)序結(jié)果。

1.3.2基因序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建以及RNAi載體的構(gòu)建與煙草轉(zhuǎn)化

將獲得的煙粉虱BtPMaT1 基因序列與文獻(xiàn)[13]中公開(kāi)的煙粉虱BtPMaT1 基因序列、NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的煙草NtPMaT1 基因序列進(jìn)行比對(duì)（ClustalW），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)?；贐tPMaT1 基因的測(cè)序結(jié)果，從所有煙粉虱序列中挑選出相似度最高且最為保守的區(qū)間，設(shè)計(jì)BtPMaT1 基因RNAi沉默的靶標(biāo)位點(diǎn)，盡可能多地同時(shí)沉默不同類型煙粉虱，并保證不沉默煙草中的NtPMaT1 基因，即不影響煙草NtPMaT1 基因的酚糖解毒功能。

針對(duì)篩選出的RNAi 靶標(biāo)片段序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的RNAi 引物；利用內(nèi)含子分隔靶標(biāo)位點(diǎn)的序列，通過(guò)BP 重組反應(yīng)，將該片段構(gòu)建到gateway中間載體中，再分別以正向和反向構(gòu)建入植物RNAi 表達(dá)載體pHELLSGATE12 （由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所吳建強(qiáng)課題組提供） 中（圖1）[16]。對(duì)獲得的pHELLSGATE12 陽(yáng)性載體，分別通過(guò)XbaⅠ和XhoⅠ酶切進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化后，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中是否含有pHELLSGATE12 載體上的NPTⅡ抗性基因，從而獲得具有煙粉虱BtPMaT1 基因RNAi 載體的陽(yáng)性煙株。

1.3.3 RNAi煙草創(chuàng)制

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，將含有RNAi 載體（pHELLSGATE12） 的農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)。在LB 培養(yǎng)基中添加適量卡那霉素，37 ℃ 條件下培養(yǎng)過(guò)夜，待菌液OD600 值為0.6～0.8。選取健康煙草葉片，先用70% 乙醇消毒處理30 s，再用無(wú)菌水沖洗3 次。切取直徑5～7 mm 的葉片圓盤，注意保持邊緣完整，避免機(jī)械損傷。將菌液稀釋到OD600 值為0.2～0.5，加入100 μmol/L 乙酰丁香酮誘導(dǎo)農(nóng)桿菌的感染能力。將葉盤浸入菌液中，輕輕振蕩10～15 min，使菌液充分接觸葉片表面；取出葉盤，用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液，平鋪于無(wú)選擇性誘導(dǎo)MS 培養(yǎng)基上，于25 ℃ 暗培養(yǎng)2～3 d，促進(jìn)農(nóng)桿菌侵染。將侵染后的葉盤轉(zhuǎn)移至含有50 mg/L 卡那霉素的篩選培養(yǎng)基中，于25 ℃、光照16 h/黑暗8 h 條件下培養(yǎng)3～4 周，觀察葉盤是否形成愈傷組織和芽點(diǎn)，若形成芽點(diǎn)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因成功。將長(zhǎng)出的芽分離，轉(zhuǎn)移至含卡那霉素的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 周。挑選健康芽轉(zhuǎn)移至不含抗生素的生根培養(yǎng)基中，待其生根后移栽到土壤中繼續(xù)培養(yǎng)。提取煙草DNA，通過(guò)PCR 檢測(cè)是否含有pHELLSGATE12 載體上的NPTⅡ抗性基因，最終篩選得到具有煙粉虱Bt-PMaT1 基因RNAi 載體的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙株。

1.3.4 煙草農(nóng)藝性狀測(cè)量

于煙草團(tuán)棵期測(cè)量農(nóng)藝性狀。使用鋼卷尺測(cè)量從煙草基部土壤表面至植株頂端的高度，即為株高；有效葉數(shù)為除去子葉和枯葉的葉片數(shù)量；最大葉長(zhǎng)、最大葉寬為中部葉最大葉片的長(zhǎng)和寬；最大莖圍為煙草莖高約1/3 處的圓周長(zhǎng)；節(jié)距為煙草株高1/3 處上下各3 個(gè)葉位、共計(jì)6 個(gè)葉位節(jié)距的平均值。

1.3.5 RNAi煙草植株對(duì)煙粉虱的抗性評(píng)估

在日光溫室中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因煙草至團(tuán)棵期，選取10 株長(zhǎng)勢(shì)一致的轉(zhuǎn)基因煙草，再選取10 株生長(zhǎng)相近的非轉(zhuǎn)基因云雪6 號(hào)煙草作為對(duì)照，分別放入10 個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)籠中，每籠放置2 株（轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草各1 株），每株接種30 頭煙粉虱。在接種后的7、14、21、28 和35 d，統(tǒng)計(jì)煙粉虱的活蟲(chóng)數(shù)，并按照公式計(jì)算蟲(chóng)量比（r）：r=某一煙草品種總蟲(chóng)數(shù)/全部煙草品種的平均蟲(chóng)數(shù)，其中，總蟲(chóng)數(shù)包括蟲(chóng)卵在內(nèi)的所有蟲(chóng)齡段煙粉虱。根據(jù)趙文娟等[17]對(duì)抗蟲(chóng)性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，r≥1.00 為高感；0.60≤rlt;1.00 為敏感；0.40≤rlt;0.60 為中抗；0.19≤rlt;0.40 為抗性；0≤rlt;0.19 為高抗。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用MEGA 7.0.26 進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。其他數(shù)據(jù)使用Excel 2020 初步處理后，通過(guò)SPSS 22.0 進(jìn)行t 檢驗(yàn)和作圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1煙粉虱BtPMaT1基因序列

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：煙粉虱BtPMaT1片段約為1 500 bp，與預(yù)期一致。對(duì)每條序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明：11個(gè)煙田的煙粉虱BtPMaT1基因序列各不相同，呈多樣性和不同程度的特異性，即不同煙區(qū)的煙粉虱BtPMaT1基因存在不同程度的變異。

2.2煙粉虱BtPMaT1基因序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果

進(jìn)一步構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖2） 顯示：1、3、4、5、6、7、8、9 這8 個(gè)區(qū)域的煙粉虱同源性較近，可聚為一類；而2、10 和11 這3 個(gè)區(qū)域的煙粉虱同源性較遠(yuǎn)，各自為一類，因此，共聚為4 類。此外，與文獻(xiàn)[13] 中的煙粉虱BtPMaT1基因序列及NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的煙草NtPMaT1基因序列比對(duì)結(jié)果顯示：云南11 個(gè)煙田的煙粉虱BtPMaT1 基因與文獻(xiàn)中煙粉虱和煙草的同源基因關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能是由于云南煙田的煙粉虱BtPMaT1 基因來(lái)源于其他植物，這一差異為后續(xù)RNAi 靶標(biāo)位點(diǎn)的設(shè)計(jì)提供了便利。

2.3煙粉虱BtPMaT1基因RNAi靶標(biāo)片段的篩選結(jié)果

序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)：11個(gè)煙田的煙粉虱BtPMaT1基因在530～970 位置上高度相似（圖3a）。進(jìn)一步選取LOC_1 區(qū)域，并將其與文獻(xiàn)[13] 中的煙粉虱BtPMaT1 基因以及煙草NtPMaT1 基因進(jìn)行了雙序列比對(duì)，結(jié)果（圖3b～c） 顯示：連續(xù)20～23nt的序列在煙粉虱BtPMaT1 基因和煙草NtPMaT1基因之間無(wú)法匹配，表明沉默該靶標(biāo)片段不影響煙草的酚糖解毒功能。因此，該區(qū)域?yàn)镽NAi 靶標(biāo)片段的最佳選擇。

2.4 煙粉虱BtPMaT1基因RNAi載體的構(gòu)建與煙草轉(zhuǎn)化

針對(duì)篩選出的RNAi 靶標(biāo)片段序列，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的RNAi 引物（F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCAAACAGACCTCCAGCAATTGC；R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCGGTGGGTCGTCTCCATGT）。經(jīng)PCR 擴(kuò)增，獲得約400 bp 的片段，與預(yù)期一致。煙粉虱BtPMaT1 基因RNAi 載體驗(yàn)證結(jié)果表明載體構(gòu)建成功（圖4），可用于煙草轉(zhuǎn)化。

2.5 RNAi 煙草植株對(duì)煙粉虱的抗性

由表1 可知：RNAi 煙草的農(nóng)藝性狀與對(duì)照煙草無(wú)明顯差異。由圖5 和表2 可知：接種14～35 d，轉(zhuǎn)基因煙草的蟲(chóng)量極顯著低于對(duì)照煙草，對(duì)照組的抗蟲(chóng)性在試驗(yàn)期均為高感，RNAi 煙草的抗性隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，14 d 時(shí)為中抗，從21 d 起達(dá)到抗性。在試驗(yàn)35 d 時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草上的活蟲(chóng)數(shù)僅約為對(duì)照煙草的1/8。

3討論

3.1云南煙田煙粉虱的危害及特異性

煙粉虱具有喜溫、喜濕、喜光等生活習(xí)性[18]，其對(duì)煙草的危害主要體現(xiàn)在刺吸煙葉汁液，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)衰弱，并傳播如煙草曲葉病、曲莖病等病毒病[19]。云南地區(qū)氣候溫暖、濕潤(rùn)且日照時(shí)間長(zhǎng)，是煙草的主要產(chǎn)區(qū)，也是煙粉虱危害的重點(diǎn)區(qū)域，特別是在濕熱的雪茄煙、晾曬煙和香料煙主產(chǎn)區(qū)，煙粉虱危害更為嚴(yán)重[20]。由于煙粉虱具有多樣性、易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，防治難度逐年增加。本研究供試煙粉虱采自云南的主要煙葉產(chǎn)區(qū)，具有代表性。然而，云南煙田的煙粉虱與其他地區(qū)或作物上的煙粉虱基因型存在差異。煙粉虱基因型多樣性的原因主要包括以下幾個(gè)方面：（1） 物種復(fù)合體：作為遺傳多樣性豐富的物種復(fù)合體，煙粉虱包含了多個(gè)形態(tài)上難以區(qū)分、但遺傳組成有顯著差異的隱種[21-23]；（2） 生物型的存在：煙粉虱由多個(gè)具有遺傳分化的生物型組成[24]；（3） 地理種群的分化：不同地理種群之間的煙粉虱也表現(xiàn)出遺傳多樣性[25]；（4） 水平基因轉(zhuǎn)移：煙粉虱通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移獲得新的功能基因，如植物源的BtFAD2-9 基因，有助于煙粉虱自主合成PUFA 和PGE2，從而增強(qiáng)其生殖能力[26]，這使得煙粉虱能適應(yīng)不同的環(huán)境，進(jìn)一步增加了其基因型的多樣性[27]；（5） 次生共生體的影響：煙粉虱及其次級(jí)寄生蟲(chóng)種群中的次生內(nèi)共生菌也表現(xiàn)出基因型的多樣性[28]。這些因素共同作用，使云南煙田的煙粉虱BtPMaT1 基因序列存在較大的變異。

3.2 RNAi 技術(shù)在植物抗蟲(chóng)領(lǐng)域的研究應(yīng)用

RNAi 技術(shù)在植物抗蟲(chóng)領(lǐng)域具有巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。該技術(shù)通過(guò)表達(dá)雙鏈RNA（dsRNA），靶向并抑制害蟲(chóng)的特定基因表達(dá)，從而達(dá)到抗蟲(chóng)的目的。RNAi 技術(shù)依賴于核苷酸互補(bǔ)配對(duì)的方式，將特定的dsRNA 引入害蟲(chóng)體內(nèi)，導(dǎo)致其靶基因沉默，從而阻礙害蟲(chóng)的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖，最終導(dǎo)致害蟲(chóng)死亡[29]。這一策略具有高度的靶向性和特異性，在防治害蟲(chóng)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。盡管RNAi 技術(shù)在抗蟲(chóng)領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大潛力，但傳統(tǒng)的細(xì)胞核介導(dǎo)的RNAi 技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)。如：dsRNA 在植物細(xì)胞中的表達(dá)水平通常較低，且長(zhǎng)鏈dsRNA易被植物自身的Dicer 酶切割降解，導(dǎo)致其生物活性和穩(wěn)定性受限[29-30]，限制了RNAi 的效果及其在植物抗蟲(chóng)中的應(yīng)用。為解決這些問(wèn)題，研究人員提出了質(zhì)體介導(dǎo)的RNAi 技術(shù)，這一方法有效地提高了抗蟲(chóng)效率。質(zhì)體是植物細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，能夠有效積累dsRNA 并避免其降解。因此，通過(guò)質(zhì)體介導(dǎo)的RNAi 技術(shù)，植物可以在較低的表達(dá)水平下保持較高的RNAi 活性，從而提高抗蟲(chóng)效果和穩(wěn)定性[31]。

此外，Bt毒素與RNAi 技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用是一種前景廣闊的綜合防控策略，它不僅可以增強(qiáng)植物對(duì)害蟲(chóng)的防控效果，還能延緩害蟲(chóng)對(duì)Bt蛋白的抗性進(jìn)化。通過(guò)將RNAi 技術(shù)與Bt 毒素結(jié)合，植物能夠利用RNAi 的序列特異性和種屬特異性，精確地靶向特定的害蟲(chóng)種類進(jìn)行有效防治，從而降低害蟲(chóng)的適應(yīng)性，提高防治的持久性和效果[32]。但是，RNAi 抗蟲(chóng)技術(shù)在商業(yè)化和實(shí)際應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，如何高效地在植物體內(nèi)產(chǎn)生足夠多的穩(wěn)定dsRNA，且確保其能夠被害蟲(chóng)有效攝取并傳遞到靶基因，是目前要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。研究表明：dsRNA 需要通過(guò)害蟲(chóng)的攝食或其他途徑進(jìn)入體內(nèi)才能發(fā)揮作用[30， 33]，因此，如何優(yōu)化dsRNA 的遞送方式，確保其在害蟲(chóng)體內(nèi)的穩(wěn)定性，是需要進(jìn)一步解決的技術(shù)難題。此外，外源dsRNA 的安全性和生物安全性評(píng)估也是RNAi 技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用中不可忽視的重點(diǎn)問(wèn)題。雖然RNAi 技術(shù)對(duì)非靶標(biāo)生物的影響較小，但仍需進(jìn)行全面的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以確保其不會(huì)對(duì)環(huán)境和其他物種產(chǎn)生不良影響。綜上所述，RNAi 介導(dǎo)的植物抗蟲(chóng)技術(shù)具有巨大的應(yīng)用潛力，通過(guò)不斷優(yōu)化技術(shù)和解決當(dāng)前的問(wèn)題，RNAi 有望成為一種既安全又高效的害蟲(chóng)管理工具。這一技術(shù)不僅能減少對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的依賴，還符合可持續(xù)農(nóng)業(yè)的環(huán)保要求，推動(dòng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)向更加綠色、環(huán)保的方向發(fā)展。

3.3煙田煙粉虱防治措施

煙粉虱是煙草種植中嚴(yán)重的害蟲(chóng)，防治措施通常包括生物防治、化學(xué)防治、物理防治、農(nóng)業(yè)防治等多種方法。煙粉虱種群多樣、適應(yīng)性極強(qiáng)，單一的防治手段難以有效控制其危害。因此，綜合應(yīng)用多種防治策略是最佳的途徑。在傳統(tǒng)的防治手段中，化學(xué)農(nóng)藥的使用雖能有效減輕煙粉虱的危害，但隨著時(shí)間的推移，煙粉虱對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的抗藥性逐漸增強(qiáng)，防治效果逐漸下降。煙草基因工程育種手段旨在培育抗煙粉虱的煙草新品系，但由于煙草天然抗性基因匱乏，這一途徑的應(yīng)用受到了一定限制[34]。因此，本研究采用RNAi 技術(shù)，沉默煙粉虱BtPMaT1 基因的表達(dá)，煙粉虱在取食轉(zhuǎn)基因煙草后，失去了對(duì)煙草中酚糖類有毒物質(zhì)的解毒功能，從而有效控制了煙粉虱繁殖，提升了煙草的抗蟲(chóng)性。與傳統(tǒng)的煙粉虱防治方法相比，RNAi 技術(shù)在防治煙粉虱方面具有以下優(yōu)勢(shì)。（1） 高特異性。RNAi 技術(shù)能夠精確靶向特定基因，選擇性地沉默煙粉虱體內(nèi)的關(guān)鍵基因，從而減少對(duì)非靶標(biāo)生物（如益蟲(chóng)、授粉昆蟲(chóng)或其他有益生物） 的影響，這極大地降低了對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中其他生物的危害風(fēng)險(xiǎn)[35-36]。（2） 降低抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥不同，RNAi 技術(shù)通過(guò)基因沉默機(jī)制抑制目標(biāo)昆蟲(chóng)的生理過(guò)程，而非通過(guò)化學(xué)毒素直接殺死昆蟲(chóng)。RNAi可以靶向不同的基因，從而降低害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性的概率。如果害蟲(chóng)產(chǎn)生了抗性，還可以通過(guò)調(diào)整靶基因的設(shè)計(jì)，繼續(xù)保持RNAi 技術(shù)的防治效果[37]。（3） 環(huán)保性和低殘留。RNAi 技術(shù)基于小干擾RNA （siRNA）發(fā)揮作用，這些分子在環(huán)境中較易降解，減少了殘留污染的風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，化學(xué)農(nóng)藥在施用后可能長(zhǎng)期殘留在土壤和水體中，造成環(huán)境污染和食品安全隱患。RNAi 技術(shù)符合可持續(xù)農(nóng)業(yè)的環(huán)保要求，能夠減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的化學(xué)物質(zhì)使用，降低環(huán)境污染[35]。（4） 靶向多重基因的潛力。RNAi 技術(shù)能夠同時(shí)靶向多個(gè)害蟲(chóng)生理中的關(guān)鍵基因，通過(guò)聯(lián)合干擾多個(gè)目標(biāo)基因，可以顯著增強(qiáng)防治效果，并降低害蟲(chóng)適應(yīng)性變異的可能性[38-39]，這在防治復(fù)雜害蟲(chóng)群體（如不同發(fā)育階段的煙粉虱） 時(shí)具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

4結(jié)論

本研究通過(guò)RNAi 技術(shù)在煙草中沉默煙粉虱從植物源獲得的酚糖解毒基因BtPMaT1，顯著提高了煙草對(duì)煙粉虱的抗性，為煙田煙粉虱防治提供了新的思路和方法。這一技術(shù)有望成為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)管理的重要手段。

責(zé)任編輯：何承剛