關(guān)鍵詞： 云南松；原生質(zhì)體制備；酶解法；優(yōu)化體系

中圖分類號(hào)： S791.257.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1004–390X （2024） 06?0133?09

植物原生質(zhì)體是指通過(guò)質(zhì)壁分離去除細(xì)胞壁后剩下的、由單層細(xì)胞膜包裹著的、有活力的原生質(zhì)團(tuán)[1]，它較易從木質(zhì)化程度較低的植物組織材料中獲得。葉片因易獲得和易分解，是制備原生質(zhì)體常用的理想材料[2]。原生質(zhì)體無(wú)細(xì)胞壁的支撐和保護(hù)作用，外源大分子物質(zhì)DNA、質(zhì)粒、病毒、細(xì)胞器等容易攝入，是遺傳操作和基因轉(zhuǎn)移的良好材料，也是基因功能驗(yàn)證、亞細(xì)胞定位、蛋白互作等研究的理想受體[3-5]。保持活性的原生質(zhì)體含有細(xì)胞的完整遺傳信息，不僅可以進(jìn)行體細(xì)胞雜交、細(xì)胞融合和突變體篩選培育，還能夠克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的問(wèn)題[6]。此外，由于具有細(xì)胞全能性，原生質(zhì)體還是進(jìn)行細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂與分化、膜透性及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等研究的基礎(chǔ)材料[7]。

在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryzasativa）、煙草（Nicotiana tabacum） 等模式植物中，原生質(zhì)體分離純化體系較為成熟且應(yīng)用廣泛，而木本植物原生質(zhì)體的制備和應(yīng)用相較于草本植物、農(nóng)作物、微生物等起步較晚[8]。草本植物因其生長(zhǎng)周期短，在原生質(zhì)體制備、培養(yǎng)等方面較為完善，特別是擬南芥、煙草等模式植物的原生質(zhì)體，已廣泛應(yīng)用于基因功能研究[9]。木本植物原生質(zhì)體研究以棗（Ziziphus jujuba）[10]、梨（Scurrulaphilippensis）[11]、桑樹（Morus alba）[12]、茶樹（Camellia sinensis）[13]等植物居多，而鮮有針葉森林樹種的相關(guān)研究[14]。松科（Pinaceae） 是裸子植物中最大的一類，且為主要的森林樹種，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[15]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)的發(fā)展，松科松屬（Pinus） 植物的種質(zhì)創(chuàng)新、遺傳改良、次生代謝途徑調(diào)控等研究得到快速發(fā)展[16]。雖然基因功能鑒定、亞細(xì)胞定位、蛋白互作等可以在模式植物（如煙草和擬南芥） 的原生質(zhì)體中異源表達(dá)和定位，但可能與本體表達(dá)存在差異[17-18]。此外，因植物物種間的基因型、幼嫩程度、細(xì)胞壁組成成分等不同，目前尚未建立通用的原生質(zhì)體分離純化體系[19]。因此，建立松屬植物的原生質(zhì)體分離純化體系，對(duì)于其種質(zhì)創(chuàng)新、遺傳轉(zhuǎn)化、基因功能驗(yàn)證及挖掘具有重要意義。

云南松（P. yunnanensis） 為松科松屬常綠喬木，是西南地區(qū)荒山造林的先鋒樹種和重要經(jīng)濟(jì)林木[20]。近年來(lái)，云南松遺傳資源大量流失或消失，對(duì)現(xiàn)有遺傳資源進(jìn)行保存或改良尤為重要。云南松生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)基因功能鑒定及預(yù)測(cè)已成為研究熱點(diǎn)[21-23]，建立高效的云南松原生質(zhì)體分離純化體系是進(jìn)行種質(zhì)資源改良、亞細(xì)胞定位、蛋白互作等研究的前提[24]，但目前未見云南松原生質(zhì)體制備相關(guān)的研究報(bào)道，極大限制了云南松種質(zhì)創(chuàng)新、基因工程等方面的研究?；诖?，本研究使用酶解法，以云南松幼苗為試驗(yàn)材料，探究纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、離析酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、甘露醇濃度、真空處理時(shí)間、酶解條件和離心條件對(duì)原生質(zhì)體制備的影響，以期為松科植物的體細(xì)胞雜交和基因功能研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物

云南松種子于2020年11月采自云南省宜良縣花園林場(chǎng)（24o92′N，103o14′E，海拔1 600 m），采后于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。種子經(jīng)始溫50 ℃ 熱水熱激浸泡48 h 后，播種于組培瓶中萌發(fā)生長(zhǎng)30 d。萌發(fā)條件為：溫度（23±2） ℃，光照時(shí)間16 h/d，光照強(qiáng)度2100～2500 lx。試驗(yàn)地點(diǎn)為西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

纖維素酶（cellulase R-10，CE） 和離析酶（macerozymeR-10，MA） 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司（上海）；甘露醇、蔗糖、2-（N-嗎啉） 乙磺酸一水化合物[2-（N-morpholino）ethanesulfonic acidmonohydrate，MES]、牛血清蛋白（bovine" serumalbumin，BSA）、固體臺(tái)盼藍(lán)、氯化鉀、氯化鈉、二水合氯化鈣、磷酸二氫鉀、碘化鉀、硝酸鉀、七水合硫酸鎂、五水合硫酸銅、磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 等常規(guī)試劑均購(gòu)自索萊寶科技有限公司（北京）。

1.1.3 供試溶液配制

W5 溶液：含4.500g/L 氯化鈉、9.190g/L二水合氯化鈣、0.186 g/L 氯化鉀、0.213 g/L MES，溶劑為純水，pH 為5.8。

2×CPW緩沖液：含0.0272g/L 磷酸二氫鉀、0.0160g/L 碘化鉀、0.1010g/L 硝酸鉀、0.2450g/L七水合硫酸鎂、0.0250mg/L 五水合硫酸銅，溶劑為純水，pH 為5.8。

酶解液（現(xiàn)用現(xiàn)配）：在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0% 的纖維素酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6% 的離析酶、0.3 mol/L甘露醇、500 μL 2×CPW 緩沖液、21.325 g/L MES、74.550μg/L 氯化鉀中加入8 mL 純水，并于55 ℃恒溫水中水浴溶解， 溶液冷卻至室溫后加入0.0147mg/L 二水合氯化鈣、3.0000g/L 牛血清蛋白，調(diào)節(jié)pH 至 5.8，加純水定容至10mL。

0.1% 臺(tái)盼藍(lán)（現(xiàn)用現(xiàn)配）： 稱取1.0g臺(tái)盼藍(lán)，以PBS為溶劑溶解，pH 為7.4，定容至1 L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原生質(zhì)體的分離

待云南松種子萌發(fā)生長(zhǎng)至約30 d，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的實(shí)生幼苗，分別稱取針葉、莖和根各（0.100±0.002） g，用預(yù)先滅菌的手術(shù)刀快速切成1～2 mm 的小段后放入裝有酶解液10 mL 的離心管中，用錫紙包裹離心管，真空處理后置于不同條件的搖床上進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后，用70 μm的細(xì)胞濾網(wǎng)分別過(guò)濾根、莖、葉的組織細(xì)胞酶解液混合物，得到組織細(xì)胞懸液并裝入15 mL 離心管備用。

1.2.2 不同因素對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：云南松幼嫩針葉在1.00% 纖維素酶、0.60% 離析酶和0.3 mol/L 甘露醇的酶解液中真空處理10min 后，以4h、28 ℃、180 r/min的條件進(jìn)行酶解，再以180 r/min 離心5 min，可以觀察到有活力的原生質(zhì)體。因此，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)以下試驗(yàn)。

（1） 酶解液中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

① 酶解液中的纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.75%、1.00%、1.25% 和1.50%，其他條件同預(yù)試驗(yàn)，制備原生質(zhì)體；② 離析酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.60%、0.80%、1.00% 和1.20%，纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為①中得到的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其他條件同預(yù)試驗(yàn)，制備原生質(zhì)體。

（2） 甘露醇濃度

設(shè)置甘露醇濃度為0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 mol/L，纖維素酶和離析酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1） 中得到的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其他條件同預(yù)試驗(yàn)，制備原生質(zhì)體。

（3） 真空處理時(shí)間和酶解條件

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：未進(jìn)行真空處理的原生質(zhì)體產(chǎn)量約為真空處理的1/3，且酶解時(shí)間相差約5 倍。在（1）、（2） 中得到的最適酶解液成分（纖維素酶、離析酶和甘露醇） 及預(yù)試驗(yàn)離心條件的基礎(chǔ)上探討真空處理和酶解條件對(duì)原生質(zhì)體分離的影響。真空處理時(shí)間設(shè)置為5、10、15、20和25 min，在5 個(gè)真空處理時(shí)間條件下進(jìn)行酶解條件（酶解溫度、酶解轉(zhuǎn)速、酶解時(shí)間） 的L₁₆（3⁴） 試驗(yàn)，其中酶解溫度設(shè)置為24、26、28 和30 ℃，酶解轉(zhuǎn)速設(shè)置為80、130、180 和230 r/min，酶解時(shí)間設(shè)置為3.0、3.5、4.0 和4.5 h。

篩選出制備針葉原生質(zhì)體的最佳條件后，以優(yōu)化體系對(duì)云南松幼嫩根、莖進(jìn)行原生質(zhì)體分離與純化，并對(duì)制備效果進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)。

1.2.3 原生質(zhì)體的純化

將1.2.1 節(jié)得到的組織細(xì)胞懸液進(jìn)行第1 次離心，棄去上清液；加入等體積W5 溶液進(jìn)行第2 次離心，棄去上清液；加入等體積0.3 mol/L 甘露醇溶液進(jìn)行第3次離心，棄去多余上清液，留下上清液約1.0 mL 重懸沉淀，即可得到較為純凈的原生質(zhì)體懸液。3次離心條件均為：先將離心時(shí)間設(shè)置為5 min （預(yù)試驗(yàn)結(jié)果），探索600、800和1000 r/min 中的最佳轉(zhuǎn)速；得到最佳轉(zhuǎn)速后，在最佳轉(zhuǎn)速下探索3、5、7 和9 min 中的最佳離心時(shí)間。

1.2.4 原生質(zhì)體的產(chǎn)量計(jì)算及活力檢測(cè)

采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量，利用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)法測(cè)定細(xì)胞活力。取純化后的原生質(zhì)體懸液0.9 mL 于試管中，再加入0.1% 臺(tái)盼藍(lán)染液0.1 mL 混勻，室溫避光反應(yīng)3 min，輕柔搖晃后吸取20 μL 滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（25×16型） 上，蓋上蓋玻片后在Axio Vision系統(tǒng)下觀察、拍照，并按照公式計(jì)算原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力：原生質(zhì)體產(chǎn)量=（5 個(gè)中方格內(nèi)原生質(zhì)體總數(shù)/80×400×10⁴×稀釋倍數(shù)）/組織總質(zhì)量；原生質(zhì)體活力=（原生質(zhì)體總數(shù)?顯藍(lán)色的原生質(zhì)體數(shù)）/原生質(zhì)體總數(shù)×100%。5個(gè)中方格指4 個(gè)角和1 個(gè)中央的中方格，1 個(gè)中方格有16 個(gè)小格，計(jì)數(shù)遵循計(jì)上不計(jì)下、計(jì)左不計(jì)右的原則。每組處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)計(jì)數(shù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007整理數(shù)據(jù)；采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析；采用Origin 21.0制圖。數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南松不同組織原生質(zhì)體的制備效果

云南松的不同組織在相同條件下進(jìn)行酶解，其針葉組織細(xì)胞懸液綠色較深，莖段組織細(xì)胞懸液綠色較淺，根組織細(xì)胞懸液呈淡黃色；依次對(duì)針葉、莖段、根的染色結(jié)果進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：視野中呈綠色的原生質(zhì)體逐漸減少，橢圓形細(xì)胞也逐漸減少，組織碎片逐漸增多（圖1）。因此，在同一制備程序下，云南松實(shí)生幼苗針葉的原生質(zhì)體制備效果優(yōu)于莖和根，在后續(xù)研究中對(duì)針葉原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)針葉原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

由圖2a 可知：在0.60% 離析酶處理下，隨著纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力先升高后降低，當(dāng)纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值，為7.09×10⁷個(gè)/g，活力為61.37%；當(dāng)纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25% 時(shí)，活力達(dá)到最大值，為65.01%，產(chǎn)量為6.11×10⁷個(gè)/g。因此，1.00% 纖維素酶為制備原生質(zhì)體的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由圖2b 可知：在1.00% 纖維素酶處理下，隨著離析酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，活力呈鋸齒形變化，當(dāng)離析酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.80% 時(shí)，產(chǎn)量和活力都達(dá)到最大值，分別為5.71×10⁷個(gè)/g 和75.27%。綜上所述，1.00% 纖維素酶和0.80% 離析酶的組合為云南松針葉原生質(zhì)體制備的較適酶解體系。

2.3 甘露醇濃度對(duì)針葉原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

由圖3 可知：甘露醇濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)顯著影響原生質(zhì)體的活力。當(dāng)甘露醇濃度為0.2 和0.6 mol/L 時(shí)，原生質(zhì)體活力較低，約為50%，且這2 個(gè)處理間差異不顯著；隨著甘露醇濃度的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，為4×10⁷～6×10⁷ 個(gè)/g；當(dāng)甘露醇濃度為0.3 mol/L 時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為5.88×10⁷ 個(gè)/g。

2.4 真空處理時(shí)間及酶解條件對(duì)針葉原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

由圖4 可知：隨著真空處理時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)，5～15 min 是制備原生質(zhì)體較適宜的真空處理時(shí)間，而真空處理25 min 不利于原生質(zhì)體的制備；當(dāng)真空處理時(shí)間一定時(shí)，3.5 和4.0 h 是較適宜的酶解時(shí)間；當(dāng)真空處理時(shí)間為10min，酶解時(shí)間為3.5h 時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解溫度和轉(zhuǎn)速的升高而升高；當(dāng)真空處理時(shí)間為10min，酶解時(shí)間為4.0h 時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解溫度和轉(zhuǎn)速呈先升高后降低的趨勢(shì)，在酶解溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速130 r/min 時(shí)達(dá)到最大值，為7.07×10⁷個(gè)/g。綜上所述，酶解前真空處理10 min，以26 ℃、130 r/min酶解4 h，原生質(zhì)體的產(chǎn)量可達(dá)最大值。

2.5 離心時(shí)間及速度對(duì)針葉原生質(zhì)體純化的影響

由圖5a 可知：隨著離心時(shí)間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，離心5 min時(shí)，其產(chǎn)量（5.88×10⁷ 個(gè)/g） 和活力顯著高于其他處理。由圖5b 可知：隨著離心速度的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)離心速度為800 r/min 時(shí)，其產(chǎn)量（5.75×10⁷ 個(gè)/g） 和活力（72.98%） 顯著高于其他處理；當(dāng)離心速度升至1000 r/min 時(shí)，原生質(zhì)體活力較800 r/min 時(shí)降低了約10%。綜上所述，純化過(guò)程中800 r/min、離心5 min 是原生質(zhì)體純化的最佳條件。

2.6 優(yōu)化體系對(duì)根、莖原生質(zhì)體制備效果評(píng)價(jià)

由圖6a 可知：對(duì)云南松幼嫩根、莖進(jìn)行原生質(zhì)體分離與純化，其產(chǎn)量分別為4.35×10⁷ 和5.27×10⁷ 個(gè)/g，均顯著低于葉的產(chǎn)量（5.98×10⁷ 個(gè)/g），且根的產(chǎn)量顯著低于莖的產(chǎn)量。由圖6b 可知：根、莖的原生質(zhì)體活力分別為67.69% 和69.83%，均低于針葉原生質(zhì)體活力（72.22%），且根原生質(zhì)體活力顯著低于葉?？梢姡狙芯拷⒌脑|(zhì)體制備及優(yōu)化技術(shù)體系為云南松不同組織的原生質(zhì)體分離純化提供了可行方案。

3 討論

3.1 酶解液成分對(duì)植物原生質(zhì)體制備的影響

采用酶解法高效分離、純化大量有活力的植物原生質(zhì)體，受到多種因素的影響，其中，酶解液的酶種類及濃度、滲透壓調(diào)節(jié)劑等是影響植物原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的關(guān)鍵因素[25]。通常根據(jù)不同植物材料使用不同濃度配比的纖維素酶、離析酶、果膠酶和半纖維素酶中的2～3 種進(jìn)行酶解[26]。在酶解過(guò)程中，若酶濃度過(guò)低，可能酶解不完全，原生質(zhì)體聚集成團(tuán)；若濃度過(guò)高，原生質(zhì)體破裂，活性不高[27]。以1.5% 纖維素酶+0.3% 離析酶+0.5% 果膠酶的酶解液組合分離茶樹（Camelliasinensis） 葉片原生質(zhì)體的效果最好[28]；以1.50%纖維素酶+0.75% 果膠酶是酶解柳枝稷（Panicumvirgatum） 的最適組合[29]；使用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶、離析酶和半纖維素酶組合處理梭梭（Haloxylon ammodendron） 同化枝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：0.4%離析酶R-10+1.0% 纖維素酶R-10 是分離其原生質(zhì)體的最優(yōu)酶解組合[30]； 對(duì)馬鈴薯（Solanumtuberosum） 葉片原生質(zhì)體的研究表明：纖維素酶和離析酶的酶解作用大于果膠酶[31]。本研究采用的云南松幼苗較為幼嫩，細(xì)胞壁去除相對(duì)容易，綜合考慮成本等因素，選擇纖維素酶和離析酶進(jìn)行酶解，結(jié)果表明：與其他組織相比，針葉分離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力都較高。適宜的酶解液滲透壓能維持原生質(zhì)體活性和質(zhì)膜穩(wěn)定性，使酶和底物的結(jié)合更充分[32]。常用甘露醇、蔗糖、葡萄糖、山梨醇等作為分離原生質(zhì)體的滲透壓穩(wěn)定劑[33]。在萱草（Hemerocallis fulva） 原生質(zhì)體的分離中，與甘露醇相比，蔗糖和葡萄糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑時(shí)制得的原生質(zhì)體產(chǎn)量較低[34]。在本研究中，當(dāng)甘露醇濃度為0.3 mol/L 時(shí)，分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量高達(dá)5.88×107 個(gè)/g，活力達(dá)62.86%，與擬南芥[35]、楊樹[36]和茶樹[13]原生質(zhì)體分離時(shí)的最適甘露醇濃度相差不大。此外，酶解液中的其他因素也會(huì)影響原生質(zhì)體制備的效率，如酶解液的pH、pH 穩(wěn)定劑、牛血清蛋白等，這些因素在優(yōu)化研究中值得進(jìn)一步探索。

3.2 酶解條件對(duì)植物原生質(zhì)體制備的影響

酶解前是否對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理以及酶解條件對(duì)原生質(zhì)體的分離效果有重要影響。對(duì)于葉面積較大且葉表皮易去除的組織材料，通常通過(guò)撕去葉片表皮，使葉肉細(xì)胞與酶解液充分接觸，從而縮短酶解時(shí)間，提高原生質(zhì)體的獲得率[37]。在酶解前進(jìn)行抽真空處理，也可提升酶解效率。在分離菊花（Chrysanthemum morifolium） 花瓣和葉片的原生質(zhì)體過(guò)程中，酶解前抽真空5 min，原生質(zhì)體的產(chǎn)量相較于其他處理提高了579 倍和14 倍；與抽真空20 min 處理相比，抽真空30 min 處理獲得的原生質(zhì)體數(shù)量減少約40%[25]。在本研究的前期試驗(yàn)中，酶解前未進(jìn)行抽真空的處理，能觀察到原生質(zhì)體的酶解時(shí)間至少為20 h；而進(jìn)行真空處理后，酶解時(shí)間為原來(lái)的1/5，原生質(zhì)體產(chǎn)量相差3 倍。酶解時(shí)間隨物種不同有較大差異，在木本植物中，酶解時(shí)間為3～24 h 不等，隨著原生質(zhì)體制備方法的優(yōu)化，酶解時(shí)間逐漸縮短[38]。

在本研究中，真空處理、酶解溫度及搖床轉(zhuǎn)速一定時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。酶解時(shí)振蕩與否或搖床轉(zhuǎn)速也會(huì)對(duì)原生質(zhì)體的制備效率產(chǎn)生重要影響。在制備杜鵑（Rhododendron simsii） 原生質(zhì)體時(shí)， 使用靜置、振蕩、靜置與振蕩相結(jié)合的方式進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間長(zhǎng)達(dá)14 h，產(chǎn)量也較低[39]。與原生質(zhì)體制備相關(guān)的纖維素酶、離析酶、果膠酶等，較適宜的反應(yīng)溫度為40～50 ℃，但一般植物材料最高耐受溫度為35 ℃，所以酶解溫度一般選擇在35 ℃以下。本研究發(fā)現(xiàn)：酶解溫度為24～30 ℃ 時(shí)，對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響不大，這可能是酶解溫度變化梯度不大或溫度變化在云南松耐受溫度范圍內(nèi)，在后續(xù)研究中需進(jìn)一步優(yōu)化。

3.3 分離材料對(duì)植物原生質(zhì)體制備的影響

分離材料是影響植物原生質(zhì)體分離效率的重要因素，有研究認(rèn)為：選擇合適的材料可以顯著影響原生質(zhì)體的制備效果[40]。材料的木質(zhì)化程度、生理狀態(tài)等均會(huì)影響原生質(zhì)體分離的效果。使用相同制備條件分離和純化同一材料、不同組織的原生質(zhì)體，結(jié)果顯示：蘭花原生質(zhì)體產(chǎn)量的順序?yàn)槿~基gt;根gt;嫩葉gt;花蒂[4]；茶樹原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力為嫩葉gt;根gt;枝條[28]。使用相同制備條件分離和純化不同材料、同一組織的原生質(zhì)體，結(jié)果顯示：紫風(fēng)車菊花花瓣的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均大于帝王水晶菊花花瓣[25]。本研究發(fā)現(xiàn)：幼嫩針葉制備的原生質(zhì)體，其產(chǎn)量和活力均優(yōu)于根和莖，這與對(duì)杉木（Cunninghamia lanceolata） 的研究結(jié)果一致[41]。在后續(xù)研究中，可以利用建立的原生質(zhì)體制備體系分離不同生長(zhǎng)環(huán)境及不同幼嫩程度的云南松組織。

4 結(jié)論

本研究以云南松幼苗為試驗(yàn)材料，通過(guò)探索原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵影響因素，建立了云南松原生質(zhì)體制備及優(yōu)化的技術(shù)體系。云南松幼嫩針葉原生質(zhì)體的制備方法為：先置于1.00% 纖維素酶+0.80% 離析酶+0.3mol/L 甘露醇的酶解液中抽真空10min，然后以4 h、26 ℃、130 r/min 的條件進(jìn)行酶解，再用180r/min 離心5min，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)5.98×10⁷個(gè)/g，活力為72.22%。利用該技術(shù)體系可以為后續(xù)云南松原生質(zhì)體培養(yǎng)、融合及瞬時(shí)表達(dá)體系等研究提供重要技術(shù)支撐。

責(zé)任編輯：何謦成