關(guān)鍵詞： 木霉菌；微波誘變；鹽脅迫；耐鹽性

中圖分類號： S432.44 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 06?0019?07

土壤鹽堿化已成為全球面臨的主要威脅之一，其對全球糧食安全、植物生長、作物產(chǎn)量、土壤結(jié)構(gòu)、微生物多樣性等構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1-2]。據(jù)報(bào)道，全球有1.13×108 hm² 土地受到土壤鹽堿化的影響，其中，中國有3.67×106 hm² 土地受到土壤鹽堿化的威脅，占中國可利用土地總面積的4.88%[3]。研究表明：土壤中過量的鹽對植物造成的傷害主要包括滲透脅迫和氧化脅迫[4]。例如：鹽脅迫可導(dǎo)致小麥葉面積減少、葉綠素含量降低、脯氨酸和丙二醛含量顯著增加等負(fù)面影響，最終導(dǎo)致小麥產(chǎn)量降低[5]；可產(chǎn)生過量的活性氧，導(dǎo)致苦瓜植株產(chǎn)量降低和氧化損傷[6]。木霉菌（Trichoderma spp.） 作為一類重要的有益真菌和生防因子[7]，不僅可以抑制病原菌生長和減少植物病害發(fā)生，還可以促進(jìn)植株生長發(fā)育并抵抗多種脅迫[8]。ZHANG 等[9]研究發(fā)現(xiàn)： 長枝木霉T6 菌株可提高小麥抗氧化防御酶的活性，從而增強(qiáng)小麥對鹽脅迫的耐受性；RAWAT 等[10]研究發(fā)現(xiàn)：4 株木霉菌株（TRU-21、TRU-14、TRU-33和TRU-176） 可通過調(diào)節(jié)指狀谷子的生理生化反應(yīng)以適應(yīng)鹽脅迫，從而減少鹽脅迫對植株的有害影響。但是，土壤鹽堿化會(huì)直接影響土壤中的有益微生物種群、代謝活動(dòng)及其多樣性和豐度[11]。例如：鹽脅迫會(huì)抑制有益非嗜鹽微生物的生長，甚至導(dǎo)致其只能以休眠孢子的形式存活[12]；在高鹽環(huán)境下，木霉菌的生長受到較為顯著的抑制作用，其耐鹽和解鹽性能顯著降低，且不穩(wěn)定[13]。因此，尋找一種能顯著提高木霉菌株鹽脅迫耐受性的方法已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

誘變育種是提高微生物耐鹽性的途徑之一，其中，微波誘變不僅具有避免有毒物質(zhì)產(chǎn)生、操作方便、可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量突變體等優(yōu)點(diǎn)[14-15]，還可以提高微生物對逆境的適應(yīng)能力[16]。MOHAMED 等[17]研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)γ 射線誘導(dǎo)的哈茨木霉耐鹽突變體，其生長速率、產(chǎn)孢量、抑制番茄枯萎病病原尖孢鐮孢菌的生物活性等均高于野生型菌株；王惠[18]利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了耐鹽性強(qiáng)和熱穩(wěn)定性高的木聚糖酶Xyn22 定點(diǎn)突變體T10Y；程開勇等[19]研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)微波誘變獲得的木霉T6 突變體，其耐鹽性和生長速率均強(qiáng)于原始菌株。目前，鮮有利用微波誘變進(jìn)行耐鹽木霉菌株T-LJ 和T-YM 選育的研究報(bào)道，因此，本研究以從鹽堿土中分離獲得的2 株木霉菌株（T-LJ 和T-YM） 為原始菌株進(jìn)行微波誘變處理，篩選微波誘變時(shí)間，并利用鹽溶液模擬鹽脅迫，測定誘變菌株的耐鹽性，以期為開發(fā)木霉生物制劑和利用木霉緩解土壤鹽堿化提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試木霉菌株T-LJ 和T-YM 均保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。供試氯化鈉（分析純） 由天津市北辰方正試劑廠提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化

將低溫保存的木霉菌株T-LJ 和T-YM 接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂糖培養(yǎng)基（PDA） 中央，密封后置于28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)5d，備用。

1.2.2 木霉菌孢子懸浮液的制備

待活化的木霉菌株T-LJ 和T-YM 產(chǎn)生大量分生孢子后，利用移液槍加入無菌水沖洗菌落表面的分生孢子，并將洗脫的分生孢子轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，漩渦混勻1 min，使分生孢子分散混勻。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用無菌水將其密度稀釋至1×10⁶ CFU/mL，備用。

1.2.3 木霉菌微波誘變處理

分別取木霉菌株T-LJ 和T-YM 分生孢子懸浮液1 mL， 置于700 W 格蘭仕T770D20T-TD（W0） 型微波爐中進(jìn)行誘變處理，微波誘變時(shí)間分別設(shè)置為0 （對照）、15、30、45、60 和75 s。誘變過程中，每間隔5 s 將孢子懸浮液從微波爐中取出，置于冰水浴中浸泡5 s，以消除熱效應(yīng)，之后再繼續(xù)置于微波爐中照射誘變。取微波誘變處理后的孢子懸浮液200 μL，用涂布器均勻涂布于PDA 平板，在超凈工作臺內(nèi)晾干，置于25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，備用。每個(gè)處理重復(fù)6 次。

1.2.4 誘變菌株菌落直徑的測量

先使用無菌打孔器（直徑6 mm），在經(jīng)微波誘變和培養(yǎng)的菌落邊緣制取菌餅，并接種于PDA培養(yǎng)基中央；再置于25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、2 和3 d 后，利用游標(biāo)卡尺和十字交叉法測量菌落直徑，并計(jì)算菌落直徑增加量[20]。每個(gè)處理重復(fù)6 次。

1.2.5 誘變菌株耐鹽性的測定

取6 個(gè)PDA 培養(yǎng)基， 滅菌后自然冷卻至40～50 ℃，在超凈工作臺內(nèi)分別向其中加入NaCl0、1.2、1.8、2.4、3.0 和3.6 g，輕輕晃動(dòng)混勻后，向每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入含鹽PDA 培養(yǎng)基20 mL，冷卻凝固后，即為0 （對照，無菌水）、10、20、30、40 和50 mg/mL 的鹽脅迫。先使用無菌打孔器（直徑6 mm），在經(jīng)微波誘變和培養(yǎng)的菌落邊緣制取菌餅，并接種于不同鹽脅迫的含鹽PDA培養(yǎng)基中央；再置于25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d，之后利用游標(biāo)卡尺和十字交叉法測量菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)4 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2016 整理數(shù)據(jù)，并使用SPSS 19.0的Duncan’s 新復(fù)極差法分析不同處理間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波誘變對木霉T-LJ菌株生長的影響

由表1 可知：不同微波誘變時(shí)間對木霉TLJ菌株的生長具有顯著影響。當(dāng)微波誘變時(shí)間為30 s 時(shí)，培養(yǎng)2 和3 d 后，誘變菌株T-LJ 的菌落直徑顯著小于原始菌株，菌落直徑增加量分別降低10.5% 和12.2%；當(dāng)微波誘變時(shí)間為60 s 時(shí)，培養(yǎng)1 和2 d 后，誘變菌株T-LJ 的菌落直徑顯著大于其他誘變處理，其菌落直徑增加量較原始菌株分別提高了60.0% 和7.9%。

2.2 微波誘變對木霉T-YM菌株生長的影響

由表1 還可知： 不同誘變時(shí)間對木霉TYM菌株的生長具有顯著影響。當(dāng)微波誘變時(shí)間為15 s 時(shí)，培養(yǎng)1 d 后，誘變菌株T-YM 的菌落直徑增加量較原始菌株提高33.3%；但在培養(yǎng)2和3 d 后，其菌落直徑與原始菌株無顯著差異。當(dāng)微波誘變時(shí)間為30 s 時(shí)，培養(yǎng)3 d 后，誘變菌株T-YM 的菌落直徑增加量較原始菌株顯著低17.1%；但在培養(yǎng)1 和2 d 后，其菌落直徑增加量與原始菌株無顯著差異。當(dāng)微波誘變時(shí)間為45 s時(shí)，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，誘變菌株T-YM 的菌落直徑均顯著小于原始菌株。當(dāng)微波誘變時(shí)間為60 s時(shí)，培養(yǎng)2 d 后，誘變菌株T-YM 的菌落直徑增加量較原始菌株提高5.4%；但在培養(yǎng)1 d 后，其菌落直徑增加量與原始菌株無顯著差異。

2.3 微波誘變對木霉T-LJ菌株耐鹽性的影響

由表2和圖1可知：不同微波誘變時(shí)間對木霉T-LJ 菌株耐鹽性的影響不同。隨著鹽質(zhì)量濃度的增加，木霉T-LJ 菌株對鹽脅迫的耐受能力逐漸降低。當(dāng)鹽脅迫為10 mg/mL 時(shí)，誘變菌株T-LJ 的菌落直徑與原始菌株無顯著差異；當(dāng)鹽脅迫為20 mg/mL 時(shí)，不同時(shí)間段誘變菌株T-LJ 的菌落直徑多數(shù)大于原始菌株T-LJ，當(dāng)微波誘變時(shí)間為75 s 時(shí)，誘變菌株T-LJ 的菌落直徑較原始菌株提高20.0%；當(dāng)鹽脅迫大于20 mg/mL、誘變時(shí)間為75 s 時(shí)，誘變菌株T-LJ 的菌落直徑均顯著大于原始菌株。

2.4 微波誘變對木霉T-YM菌株耐鹽性的影響

由表2和圖2可知：不同微波誘變時(shí)間對木霉T-YM 菌株耐鹽性的影響不同。隨著鹽質(zhì)量濃度的增加，木霉T-YM 菌株對鹽脅迫的耐受能力逐漸降低。當(dāng)鹽脅迫為10 mg/mL 時(shí)，誘變菌株T-YM 的菌落直徑與原始菌株無顯著差異；當(dāng)鹽脅迫為20 mg/mL 時(shí)，誘變菌株T-YM 的菌落直徑顯著大于原始菌株，其中，經(jīng)30 s 誘變的菌株菌落直徑較原始菌株提高30.8%；當(dāng)鹽脅迫為30 mg/mL 時(shí)，經(jīng)60 s 誘變的菌株菌落直徑較原始菌株提高60.5%；當(dāng)鹽脅迫為50 mg/mL 時(shí)，經(jīng)15、60 和75 s 誘變的菌株菌落直徑較原始菌株提高19.2%。

3 討論

土壤鹽堿化是嚴(yán)重限制生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一，嚴(yán)重威脅著作物的安全生產(chǎn)和食品安全[21]。傳統(tǒng)的鹽堿化修復(fù)手段存在破壞土壤結(jié)構(gòu)、修復(fù)時(shí)間長、成本較高等弊端[22]。微生物修復(fù)鹽漬化土壤具有高效、無污染等優(yōu)勢，但已有研究表明：高濃度鹽脅迫會(huì)顯著抑制微生物的生長[23-24]。因此，獲得耐鹽能力強(qiáng)的菌株和尋找其高效誘變方法已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，微生物菌株改良方法包括隨機(jī)物理或化學(xué)誘變、定點(diǎn)誘變等[25]，其中，微波誘變具有操作簡便、突變效率高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于菌株改良[12]。

3.1微波誘變對木霉菌生長的影響

微波輻射會(huì)導(dǎo)致微生物體內(nèi)的DNA 分子發(fā)生相互碰撞，使其結(jié)構(gòu)改變，從而改變微生物本身的某些特性[26]。張樹武等[27]通過紫外誘變手段改良深綠木霉T-YM 菌株，誘變菌株的菌絲干質(zhì)量和生長速率顯著高于原始菌株；程開勇等[19]研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)微波誘變60 s，長枝木霉T6 的生長速率和產(chǎn)孢量顯著高于原始菌株；李瑋等[28]研究發(fā)現(xiàn)：在相同培養(yǎng)時(shí)間下，木霉突變菌株CM-5的菌落直徑顯著大于未誘變菌株JK-15；康萍芝等[29]研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)紫外誘變獲得的木霉突變菌株T32-5-10m，其生長速率和產(chǎn)孢量顯著高于原始菌株。本研究以從鹽堿土分離獲得的2 株木霉菌株T-LJ 和T-YM 為原始菌株，進(jìn)行微波誘變處理，當(dāng)誘變時(shí)間為60 s 時(shí)，可以顯著增加木霉菌株T-LJ 的菌落直徑；當(dāng)誘變時(shí)間為15 s 時(shí)，可以顯著增加木霉菌株T-YM 的菌落直徑。

3.2 微波誘變對木霉菌耐鹽性的影響

已有研究表明：經(jīng)誘變選育獲得的木霉突變菌株，不僅耐鹽能力有所提高，且其對農(nóng)藥的耐受、對病原菌的拮抗、產(chǎn)生大量有益物質(zhì)等方面均有積極作用。張樹武等[27]研究表明：紫外誘變可顯著提高木霉T-YM 突變菌株的耐鹽能力；薛應(yīng)鈺等[30]通過微波誘變獲得長枝木霉T6 突變菌株，該菌株的溶磷能力強(qiáng)于原始菌株，且可顯著提升對病原菌的拮抗能力；程開勇等[15， 19]通過微波誘變手段改良木霉T-YS 菌株，改良后菌株的產(chǎn)孢量和生長速率均顯著高于原始菌株，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)長枝木霉T6 改良菌株的耐鹽和解鹽能力顯著強(qiáng)于原始菌株；RAMANGOUDA 等[31]研究發(fā)現(xiàn)：誘變獲得的木霉突變體N2-2，其對多菌靈的耐受能力較原始菌株大幅提升。本研究利用不同質(zhì)量濃度的含鹽培養(yǎng)基模擬鹽脅迫發(fā)現(xiàn)：當(dāng)鹽脅迫≥20 mg/mL 時(shí)，經(jīng)不同誘變時(shí)間處理后，誘變菌株T-LJ 和T-YM 的平均產(chǎn)孢量和菌落直徑均高于原始菌株。

目前誘變選育主要集中在作物育種方面[32-34]。微波誘變是一種高效選育耐鹽木霉突變菌株的方法，選擇合適的誘變時(shí)間和誘變方法可以顯著提升木霉菌株的耐鹽性，因此，研究微波誘變在微生物選育中的應(yīng)用及其誘變機(jī)制，具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究獲得了影響木霉菌株T-LJ 和T-YM生長和高效耐鹽的關(guān)鍵微波誘變參數(shù)。當(dāng)誘變時(shí)間為60 s 時(shí)，可顯著提高菌株T-LJ 的生長；當(dāng)誘變時(shí)間為15 s 時(shí)，可顯著提高菌株T-YM 的生長。當(dāng)誘變時(shí)間為75 s 時(shí)，可顯著提高菌株TLJ的耐鹽性；當(dāng)誘變時(shí)間為30～60 s 時(shí)，可顯著提高菌株T-YM 的耐鹽性。

責(zé)任編輯：何謦成