關(guān)鍵詞： 饑餓；能量代謝轉(zhuǎn)換；脂肪自噬；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）

中圖分類號： S865.13 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 06?0048?11

自噬是一種高度保守的分解代謝過程，通過將清除的長壽命蛋白質(zhì)和細(xì)胞器輸送到液泡或溶酶體進(jìn)行降解，維持細(xì)胞的能量穩(wěn)態(tài)[1]。OHSUMI[2]研究發(fā)現(xiàn)：饑餓狀態(tài)下，酵母細(xì)胞會啟動自噬維持自身存活。隨后多項研究證實這一機(jī)制在其他真核細(xì)胞中也成立。因此，饑餓狀態(tài)下機(jī)體會啟動自噬，降解受損細(xì)胞器、大分子物質(zhì)等成分以維持細(xì)胞內(nèi)正常的生理活動及穩(wěn)態(tài)。

饑餓狀態(tài)下，哺乳動物體內(nèi)儲存的糖原大量消耗，肝外組織無法從血液中獲得充足的葡萄糖，為維持機(jī)體的正?；顒?，肝臟中的糖異生作用加速，肝臟和肌肉中的脂肪酸氧化也加速，同時動員蛋白質(zhì)分解。脂肪是所有營養(yǎng)物質(zhì)中單位質(zhì)量能量最高的化合物，也是動物的主要能量儲存形式。在真核生物中，從膳食中獲取的脂肪經(jīng)機(jī)體消化吸收后轉(zhuǎn)化為甘油三酯，并進(jìn)一步被包裝為脂滴（lipid droplets，LDs）。 在能量短缺時，LDs可以通過自噬等途徑降解，釋放游離脂肪酸，通過脂肪酸β-氧化產(chǎn)生能量[3]。最新研究表明：自噬和LDs在抵御營養(yǎng)應(yīng)激方面發(fā)揮著互補(bǔ)作用[4]。FAN 等[5]通過LDs 和自噬標(biāo)記物的共定位檢測，證實饑餓會誘導(dǎo)脂肪自噬。CHEN 等[6]的研究也表明：在應(yīng)激刺激下，LDs通過自噬或脂肪酶介導(dǎo)的脂肪分解迅速釋放脂肪酸，并通過與線粒體的相互作用，快速將脂肪酸轉(zhuǎn)移到線粒體中燃燒，從而促進(jìn)產(chǎn)能。LIU 等[7]合成了一種“變色”生物熒光探針DPABP-BI，通過改變熒光發(fā)射波長識別LDs，并追蹤其自噬動態(tài)過程，發(fā)現(xiàn)溶酶體通過自噬消化LDs，參與細(xì)胞能量代謝。細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)通過自噬體轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體分解的過程稱為脂噬作用，簡稱為脂噬，是調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)水平的一種新途徑。然而，目前仍不清楚LDs 和自噬體如何相互作用[8]。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated proteinkinase，AMPK） 是維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的重要能量傳感器。據(jù)報道，激活的AMPK 可通過磷酸化mTORC1、ULK1 和PIK3C3/VPS34 復(fù)合物中的自噬相關(guān)蛋白直接促進(jìn)自噬，或通過調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子的自噬相關(guān)基因（如FOXO3、TFEB 和BRD4）的表達(dá)間接促進(jìn)自噬。葡萄糖耗盡的細(xì)胞通過主要的能量感應(yīng)激酶AMPK 誘導(dǎo)自噬，以獲得生存所需的能量[9]。PI3K/Akt 信號通路會被多種細(xì)胞刺激或毒性損傷激活，并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、生長、存活等基本細(xì)胞功能。已有研究表明：激活PI3K/Akt 信號通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)和能量代謝等[10]。Akt 下游作用底物種類繁多，活化的Akt 能夠負(fù)向調(diào)控TSC2，使其磷酸化被抑制，隨即負(fù)向調(diào)控mTOR 通路使其激活，啟動細(xì)胞自噬。FOXO1 作為細(xì)胞氧化還原信號的開關(guān)，調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡的轉(zhuǎn)化，在低氧化應(yīng)激環(huán)境中，F(xiàn)OXO1 從細(xì)胞核中排出，修飾成Ac-FOXO1，與胞漿中的ATG7 結(jié)合，促進(jìn)自噬，保護(hù)細(xì)胞；而在高氧化應(yīng)激環(huán)境中，F(xiàn)OXO1定位于細(xì)胞核，促進(jìn)促凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。因此，饑餓情況下的脂噬作用機(jī)制可能與上述通路激活有關(guān)。

禁食能夠誘發(fā)機(jī)體發(fā)生能量轉(zhuǎn)換等多種反應(yīng)，現(xiàn)階段已有多種短期禁食模式被開發(fā)用于健康干預(yù)，但尚未明確禁食過程中脂質(zhì)代謝作為機(jī)體主要能量來源的發(fā)生時間及其與自噬的關(guān)系。因此，本研究分別通過禁食24 和48 h 誘導(dǎo)正常小鼠發(fā)生自噬，觀察小鼠能量代謝的變化和肝臟脂質(zhì)自噬應(yīng)答，探究饑餓條件下小鼠能量代謝的調(diào)節(jié)通路及機(jī)制，為短期禁食作為肥胖癥或代謝性疾病的健康干預(yù)手段提供更深入的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗動物和分組

45只8周齡SPF級健康C57/B6小鼠（19～21 g），由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。將小鼠隨機(jī)平均分為3 組，即0 h 禁食組（對照組）、24 h 禁食組和48 h 禁食組。0 h 禁食組正常供給飲用水和食物，24 和48 h 禁食組僅提供飲用水。

1.1.2 主要試驗材料和試劑

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA） 蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）、30% 丙烯酰胺—亞甲基雙丙烯酰胺（acrylamide-bisacrylamide， Acr-Bis， 體積比29∶1）、 10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、一抗稀釋液等Westernblotting試劑均產(chǎn)自Beyotime （中國）；甘氨酸和Albumin Bovine V 產(chǎn)自Solarbio （中國）；抗LC-3B 抗體、抗P62/SQSTM1 抗體和抗β-actin 抗體產(chǎn)自Sigma （美國）；抗P-AMPK 抗體、抗AMPK抗體、抗FOXO1 抗體和抗P-FOXO1 抗體產(chǎn)自CST （美國），抗TOM20 抗體產(chǎn)自Abclonal （中國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 體質(zhì)量和血糖監(jiān)測

試驗當(dāng)天，8：0 0 撤走食物開始禁食處理，記為試驗第0 小時，稱取各組小鼠體質(zhì)量，此后，24 和48 h 禁食組小鼠分別測定24 和48 h 時的體質(zhì)量。同時，0 h 用采血針刺破小鼠尾靜脈，用干凈紗布吸去第1 滴血，取第2 滴靜脈血，使用Roche 血糖儀測量并記錄血糖值，此后，每隔8 h 測定1 次血糖，即：24 h 禁食組小鼠測定0、8、16、24 h 的血糖，48 h 禁食組小鼠測定0、8、16、24、32、40、48 h 的血糖。

1.2.2 組織取材和臟器指數(shù)測定

饑餓試驗結(jié)束后，小鼠在麻醉狀態(tài)下用75%乙醇進(jìn)行體表消毒，用眼科剪沿腹中線剪開，于冰上快速取心、肝、脾、肺、腎、腦和胸腺，稱量各臟器質(zhì)量，然后按照公式計算各只小鼠的臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

1.2.3 過碘酸雪夫染色

為檢測禁食對小鼠肝糖原的影響，進(jìn)行肝臟組織的過碘酸雪夫 （periodic acid-Schiff，PAS） 染色。將肝臟組織浸于10% 中性福爾馬林中固定24～48 h，之后進(jìn)行石蠟包埋、切片（3 μm） 和晾干。石蠟切片脫蠟后，經(jīng)自來水沖洗，置于氧化劑中室溫氧化5～8min；用自來水清洗后，將樣本放入Schiff Reagent 染料中，置于室溫陰暗處浸染10～20 min，用蘇木素染細(xì)胞核1～2 min，再用酸性分化液分化2～5s，自來水沖洗返藍(lán)，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4 透射電鏡觀察

用2.5% 戊二醛對肝臟組織進(jìn)行預(yù)固定，漂洗后去除殘留血跡，將組織修剪至1 mm³，放入新固定液于4 ℃ 固定過夜；之后，在4 ℃條件下，用1% OsO₄固定2 h，梯度乙醇脫水后用Epon-812 樹脂包埋，使用Leica UC-7 超薄切片機(jī)制備厚約60 nm 的連續(xù)切片，將超薄切片加載到100目銅網(wǎng)上，并用2% 乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，最后用JEM-1400plus 透射電子顯微鏡在120 kV 下觀察并拍照，以進(jìn)一步觀察饑餓后各組小鼠肝臟的糖原顆粒和線粒體狀態(tài)。

1.2.5 q-PCR檢測

稱量肝臟組織50～100 mg，使用RNA 提取試劑盒提取總RNA，再使用超微量分光光度計檢測總RNA 濃度；使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，RR-047A） 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR （q-PCR） 擴(kuò)增。以GAPDH 作為內(nèi)參基因，采用2?△△Ct 法計算目的基因/內(nèi)參基因的相對表達(dá)量。通過q-PCR 法檢測小鼠肝臟組織中與糖代謝、脂代謝和自噬相關(guān)的基因mRNA 表達(dá)水平。

1.2.6 Western-blotting檢測

切取組織蛋白樣品約50 mg 放入1.5 mL 離心管中，加入通用蛋白抽提試劑（含1 μmol/L 的PMSF 蛋白酶抑制劑，檢測蛋白磷酸化時，再加入1 μmol/L 的蛋白磷酸化酶抑制劑） 50 μL，使用高頻組織勻漿儀于70 Hz 研磨35 s，然后冰上靜置30～60 min，分離出總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，再制備蛋白樣品。采用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，隨后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，室溫封閉2 h，4 ℃ 孵育一抗（LC3B、P62、TOM20、AMPK、P-AMPK、FOXO1和P-FOXO1） 過夜。清洗未結(jié)合的一抗，根據(jù)一抗種屬室溫孵育相應(yīng)二抗2 h；清洗未結(jié)合的二抗，加入顯影劑，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白顯影。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，兩組間比較采用t 檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；使用GraphPad Prism 5 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 饑餓對小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響

由圖1 可知：與0 h 對照組小鼠相比，24和48h禁食組小鼠的體質(zhì)量均極顯著下降，降幅分別為9.05% 和16.00%；與24h禁食組相比，48h禁食組小鼠的體質(zhì)量顯著下降，降幅為7.60%。由表1 可知：與0h對照組小鼠相比，24和48h禁食組小鼠的肝臟指數(shù)分別顯著和極顯著降低，48h禁食組小鼠的胸腺指數(shù)極顯著增加，其余器官均無顯著變化；與24h禁食組相比，48h禁食組小鼠的胸腺指數(shù)極顯著增加，其余器官無顯著差異。說明禁食導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量快速下降，肝臟指數(shù)隨饑餓時間的延長而降低。

2.2 饑餓對小鼠血糖和糖代謝的影響

與0 h 對照組相比，饑餓組小鼠的血糖水平在各時間段均大幅降低（圖2a）。PAS 染色結(jié)果（圖2b） 顯示：0 h 對照組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)有大量的糖原顆粒沉積，而24 和48 h 饑餓組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)糖原顆粒減少，表明饑餓后肝糖原大量消耗。通過q-PCR 檢測小鼠肝組織中的糖代謝相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)情況，結(jié)果（圖2c） 顯示：與0h對照組相比，48 h 饑餓組小鼠肝組織內(nèi)糖原分解及糖異生途徑關(guān)鍵基因G6pase 和PEPCK 的mRNA相對表達(dá)量顯著升高，而抑制糖原分解和糖異生的APN 和AdipoR2 基因mRNA 相對表達(dá)量分別呈降低和顯著降低的趨勢。

2.3 禁食引起小鼠肝臟自噬

Western-blot 檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B 和P62 蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果（圖3a～b） 顯示：與0 h 相比，小鼠禁食24 和48 h 后，肝組織內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量隨饑餓時間的延長而極顯著升高，但P62 蛋白水平顯著下降；熒光染色結(jié)果（圖3d） 顯示：隨著饑餓時間的延長，小鼠肝臟細(xì)胞中的點狀LC3B 紅色熒光增強(qiáng)。以上結(jié)果表明：禁食導(dǎo)致小鼠肝臟發(fā)生自噬，且自噬程度隨饑餓時間的延長而增加，這可能與饑餓引起的能量代謝變化有關(guān)。

2.4 饑餓處理導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞發(fā)生脂噬

透射電鏡結(jié)果（圖4a） 顯示：0 h 對照組小鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴主要分布于脈管附近，向外逐漸減少，同時胞漿內(nèi)伴有大量糖原顆粒沉積；與0 h 對照組相比，24 和48 h 禁食組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)糖原數(shù)量減少，而脂滴數(shù)量和體積增加；與24 h禁食組相比，48 h 禁食組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量及體積均增加，但幾乎沒有糖原顆粒。q-PCR 結(jié)果（圖4b） 顯示：與0 h 對照組小鼠相比，48 h 禁食組小鼠的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因FAT/CD36、HSL 和PLIN2 的mRNA 相對表達(dá)量顯著升高，但ACACA 和GPAM 的mRNA 相對表達(dá)量極顯著降低。肝組織自噬相關(guān)基因（ATG） mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果（圖4c） 顯示：與0 h 對照組相比，48 h 禁食組小鼠肝細(xì)胞中ATG5、ATG16L2、ATG4D 和ATG2A 的mRNA 相對表達(dá)量顯著升高。以上結(jié)果表明：在饑餓0～24 h 過程中，小鼠主要以分解糖原作為主要的能量來源；饑餓24～48 h，小鼠肝臟內(nèi)儲存的糖原量已不能滿足小鼠代謝所需，儲存于脂肪組織中的脂滴大量轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，部分通過肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪酶分解，部分通過自噬過程被降解，生成大量游離脂肪酸供肝細(xì)胞氧化產(chǎn)生能量。

2.5 饑餓處理激活A(yù)MPK 信號通路

通過透射電鏡觀察小鼠肝細(xì)胞線粒體狀態(tài)，對照組（0 h） 小鼠線粒體結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，嵴排列規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)中有大量糖原儲存；而48 h禁食組小鼠肝細(xì)胞中能明顯觀察到線粒體體積普遍增大，發(fā)生腫脹，結(jié)構(gòu)異常，嵴變短、紊亂且部分出現(xiàn)斷裂，部分受損線粒體被雙層膜的自噬體包圍，細(xì)胞質(zhì)中糖原顆粒顯著減少，并出現(xiàn)脂滴與線粒體貼合分布的現(xiàn)象（圖5a），說明饑餓造成小鼠肝細(xì)胞線粒體大量受損，ATP 產(chǎn)出率下降。與0 h 對照組相比，24 和48 h 禁食組小鼠線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶（TOM20） 蛋白的表達(dá)水平極顯著升高（圖5b）；熒光結(jié)果（圖5c） 也顯示：隨著饑餓時間的延長，線粒體表面TOM20 蛋白表達(dá)逐漸增加，證實了線粒體自噬的發(fā)生。Western-blot檢測結(jié)果（圖6a～b） 顯示：與0h對照組小鼠相比，24和48h禁食組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的P-AMPK/AMPK顯著增加，說明饑餓導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)發(fā)生改變，ATP 產(chǎn)出減少，從而激活能量感受器AMPK。此外，編碼溶酶體蛋白的DRAM1 和DRAM2基因mRNA相對表達(dá)水平呈上升趨勢（圖6c）。Western-blot 檢測結(jié)果（圖7a～c） 顯示：小鼠肝細(xì)胞中P-FOXO1/FOXO1相對表達(dá)量極顯著增加，F(xiàn)OXO1 mRNA 相對表達(dá)水平也極顯著增加，F(xiàn)OXO1被磷酸化激活，證明脂滴通過自噬途徑降解生成游離脂肪酸，以供肝細(xì)胞氧化產(chǎn)能。

3討論

自噬通過響應(yīng)營養(yǎng)感應(yīng)的信號通路維持饑餓條件下生物機(jī)體內(nèi)的能量穩(wěn)態(tài)，脂質(zhì)以脂滴的形式在機(jī)體內(nèi)儲存多余能量，以應(yīng)對機(jī)體營養(yǎng)的缺乏。本研究將小鼠禁食24～48 h，檢測饑餓過程中小鼠肝臟糖脂代謝的變化情況以及因饑餓誘導(dǎo)的自噬應(yīng)答和相關(guān)分子機(jī)制，結(jié)果顯示：饑餓超過24 h 后，小鼠機(jī)體的主要能量來源由糖和糖原轉(zhuǎn)換為脂肪，啟動了脂噬過程。

肝臟能夠合成脂質(zhì)，但不能長期儲存，肝細(xì)胞內(nèi)合成的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至脂肪組織中儲存，轉(zhuǎn)運(yùn)至脂肪組織中的脂肪酸隨即酯化形成甘油三酯和膽固醇酯，即脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雙層膜之間的一個透鏡狀結(jié)構(gòu)內(nèi)不斷沉積中性脂質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外葉擴(kuò)張，形成球形細(xì)胞器脂滴（LDs），當(dāng)中性脂質(zhì)的體積增加超過了溶解度極限時，LDs 便從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雙分子層中被油化釋放[12]。當(dāng)饑餓導(dǎo)致機(jī)體營養(yǎng)缺乏時，細(xì)胞內(nèi)儲存的LDs 被用于水解出游離脂肪酸，以供機(jī)體氧化供能[13]。本研究中，禁食48 h后小鼠肝細(xì)胞內(nèi)存在大量脂滴，脂質(zhì)分解相關(guān)基因的mRNA 水平上升，脂肪酸和甘油三酯合成相關(guān)基因mRNA 水平下降，說明此時機(jī)體儲存的LDs 被大量重新運(yùn)送至肝細(xì)胞中進(jìn)行分解。但此時糖異生關(guān)鍵基因G6pase 和PEPCK 的mRNA表達(dá)水平仍顯著增加，說明脂代謝產(chǎn)生的部分能量仍需依賴于蛋白質(zhì)的糖異生途徑，因此，小鼠肌肉被大量消耗，從而造成隨饑餓時間增加，體質(zhì)量快速持續(xù)降低的現(xiàn)象。

既往認(rèn)為，LDs 的分解主要依賴于中性脂肪酶介導(dǎo)的脂解作用，逐步將LDs 內(nèi)的甘油三酯降解為甘油和脂肪酸。2009 年，LDs 首次被發(fā)現(xiàn)能通過自噬降解[14]，抑制自噬能顯著增加肝細(xì)胞中LDs 的數(shù)量和體積，肝組織中甘油三酯水平顯著升高。之后，這種依賴自噬—溶酶體的LDs 降解途徑在多種細(xì)胞中被證實[15]。LC3B 和P62是自噬的標(biāo)志物。本研究也證實了在饑餓導(dǎo)致小鼠機(jī)體營養(yǎng)缺乏時，肝細(xì)胞內(nèi)的自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B極顯著升高，P62 顯著降低，自噬ATG12-ATG5-ATG16L復(fù)合物中ATG16L2 和ATG5 的mRNA 表達(dá)水平顯著上調(diào)，ATG4D 和ATG2A 的mRNA 表達(dá)水平也顯著上調(diào)，表明禁食后小鼠的肝細(xì)胞發(fā)生自噬。同時，饑餓處理后，肝細(xì)胞內(nèi)大量LDs 聚集，并且脂肪代謝相關(guān)基因FAT/CD36、HSL 和PLIN2 的mRNA 水平顯著升高，脂肪合成相關(guān)基因ACACA 和GAMP 的mRNA 水平極顯著降低，表明機(jī)體在饑餓狀態(tài)下開始通過脂肪酸氧化供能，肝臟內(nèi)大量LDs 通過自噬過程降解釋放游離脂肪酸供機(jī)體使用。相關(guān)研究也報道了：脂噬發(fā)生時， 細(xì)胞質(zhì)中的LC3 經(jīng)具有內(nèi)切酶活性的ATG4 剪切后暴露甘氨酸殘基，生成定位于胞漿的LC3-Ⅰ[16]，通過ATG7 （E1 樣酶） 和ATG3 （E2樣酶） 泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，生成脂質(zhì)化的LC3-Ⅱ附著于自噬囊泡膜上；同時，負(fù)責(zé)連接LC3 和聚泛素化蛋白的自噬受體P62 被包裹進(jìn)自噬體[17]。ATG2 是細(xì)胞自噬過程中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，LDs 可在ATG2 介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中被運(yùn)送至自噬囊泡內(nèi)[18]。PLIN2屬于LDs 包被家族，在LDs 形成和脂肪細(xì)胞分化過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[19]。脂噬發(fā)生時，P62蛋白可在PLIN2 的引導(dǎo)下與LDs 結(jié)合，將LDs 封存于自噬體內(nèi)，隨后生成完整的自噬體與溶酶體融合，降解釋放出游離脂肪酸[20]。在本研究中，饑餓48 h 后小鼠肝細(xì)胞中的ATG2A 和PLIN2 mRNA 水平顯著升高，進(jìn)一步證明了饑餓處理后小鼠肝細(xì)胞發(fā)生脂噬。

AMPK 是調(diào)節(jié)生物能量代謝的關(guān)鍵分子，已有大量研究證實：饑餓狀態(tài)下自噬的發(fā)生與能量感受器AMPK 有關(guān)[21]。本研究表明：經(jīng)過饑餓誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞內(nèi)P-AMPK/AMPK 比值顯著增加，說明AMPK 信號通路被激活，由此啟動了自噬。對于AMPK 的激活，本研究發(fā)現(xiàn)：禁食后，小鼠肝細(xì)胞內(nèi)大量線粒體結(jié)構(gòu)改變，且受損線粒體被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹，說明自噬體被大量降解；而肝臟是生物體進(jìn)行糖脂代謝的主要器官，且主要的產(chǎn)能過程（三羧酸循環(huán)、脂肪酸β-氧化和氧化磷酸化） 主要在肝細(xì)胞線粒體中進(jìn)行，線粒體的大量受損和自噬降解，導(dǎo)致三羧酸循環(huán)和脂質(zhì)氧化等途徑受阻，ATP 產(chǎn)出減少，進(jìn)而激活A(yù)MPK，啟動自噬[22]。研究表明：FOXO1可以通過誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞中PNPLA2 的表達(dá)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程，還通過上調(diào)LIPA 在機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)耗竭時誘導(dǎo)脂噬發(fā)生[23]。已有研究表明：AMPK/FOXO1 信號通路的激活可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生自噬[24]。在本研究中，饑餓小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的FOXO1 mRNA 水平和P-FOXO1/FOXO1 蛋白相對表達(dá)量均極顯著增加，說明饑餓處理可能是通過激活A(yù)MPK 和FOXO1 從而導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪發(fā)生自噬。

4 結(jié)論

本研究將小鼠禁食24～48h，檢測饑餓過程中小鼠肝臟糖脂代謝的變化情況及因饑餓誘導(dǎo)的自噬應(yīng)答和相關(guān)分子機(jī)制，結(jié)果顯示：饑餓超過24h后，小鼠機(jī)體的葡萄糖和糖原被耗盡，主要能量來源轉(zhuǎn)換為脂肪，饑餓處理通過激活A(yù)MPK和FOXO1促進(jìn)儲存于小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)發(fā)生脂噬降解，釋放游離脂肪酸氧化供能，以維持饑餓條件下細(xì)胞內(nèi)的能量供應(yīng)和基礎(chǔ)代謝。本研究可為揭示饑餓情況下肝臟脂噬對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用及其關(guān)鍵信號通路奠定基礎(chǔ)。

責(zé)任編輯：何謦成