關(guān)鍵詞： 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）；M 基因；ORF3基因；遺傳進(jìn)化分析

中圖分類號(hào)： S852.651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1004–390X （2024） 06?0059?07

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrheavirus，PEDV） 引起的，以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和生長(zhǎng)緩慢為主要特征的急性、高度接觸性傳染病[1]。PEDV 是有囊膜的單條正鏈RNA 病毒，基因組全長(zhǎng)約28 kb，包括1 個(gè)5'非編碼區(qū)（untranslatedregion，UTR）、1個(gè)3'UTR 以及7個(gè)開放閱讀框（ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M、N）[2]。其中，ORF3 蛋白基因長(zhǎng)度為675 bp，是PEDV粒子中的非結(jié)構(gòu)蛋白，分子質(zhì)量為25.3ku；它是PEDV 基因組中唯一的輔助蛋白，也是病毒的通道蛋白，與病毒的毒力有關(guān)，能夠影響病毒復(fù)制[3]。ORF3 蛋白還可通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞周期的S 期、抑制早期細(xì)胞凋亡和促進(jìn)自噬來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，從而為病毒繁殖提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境[4-5]。近年來(lái)，隨著毒株的遺傳變異，ORF3 基因出現(xiàn)突變、天然截短和翻譯中斷等現(xiàn)象，且不同毒株之間存在差異[6-7]。膜糖蛋白（membrane glycoproteins，M） 基因長(zhǎng)度為681 bp，可翻譯226 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為27～32 ku，其保守性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性很高，常被用于設(shè)計(jì)引物以檢測(cè)PEDV[8]。PEDVM 蛋白是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒復(fù)制、感染和組裝有關(guān)[9-10]。

為進(jìn)一步了解PEDV 在云南的流行及演變情況，本研究于2022—2023年，從云南多個(gè)疑似暴發(fā)PED 的豬場(chǎng)采集病料樣品125 份，采用RTPCR法檢測(cè)樣品中是否存在PEDV；對(duì)PEDV 陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序分析，構(gòu)建M 和ORF3基因的遺傳進(jìn)化樹，旨在了解病毒的流行和遺傳進(jìn)化情況，為該病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料收集與貯存

2022年8月—2023年7月，從云南省祿勸彝族苗族自治縣（以下簡(jiǎn)稱“祿勸縣”）、永平縣、鳳慶縣、大理市和曲靖市9 個(gè)暴發(fā)仔豬腹瀉病的豬場(chǎng)采集發(fā)病仔豬小腸組織樣品、糞便或肛拭子共125份。取適量樣品于5mL 無(wú)菌離心管中，將樣品與無(wú)菌PBS溶液按1∶5（V∶V） 充分混勻后置于?80 ℃ 反復(fù)凍融3次，12000r/min 離心10min，取上清分裝于新的離心管中，加入1% 雙抗，一部分用于提取RNA；另一部分凍存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 主要試劑

TransZol UP RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Super HiFi PCR Mix （KT212）、DL2000 DNA Marker、DL3000 DNA Marker、核酸染料、cDNA 第1 鏈合成預(yù)混試劑盒等購(gòu)自北京天根生化有限公司。

1.3 引物合成及PCR 擴(kuò)增

根據(jù)表1 合成引物，將樣品提取RNA 后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用針對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒（porcineinfectious gastroenteritis virus，TGEV）、豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）、豬德爾塔冠狀病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV） 和PEDVM 基因的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，取PCR 產(chǎn)物7 μL，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，符合預(yù)期大小的樣品送至上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序。確定為PEDV M 陽(yáng)性的樣品，用針對(duì)PEDV ORF3 基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。

1.4 序列比對(duì)及分析

將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中的相關(guān)序列（表2）進(jìn)行比對(duì)，并將比對(duì)正確的毒株按照采集地、樣品類型、日期進(jìn)行命名。采用DNAstar 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接；采用生物學(xué)軟件Megalign 分析序列同源性，并對(duì)核苷酸和氨基酸序列突變點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用MEGA 11 構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV檢測(cè)及M基因擴(kuò)增

由圖1和表3 可知：在檢測(cè)的125 份樣品中，檢出49 份PEDV 陽(yáng)性樣品（663 bp），陽(yáng)性率為39.2%；PoRV 陽(yáng)性樣品14份（333 bp），陽(yáng)性率為11.2%；PoRV 與PEDV 混合感染率為10.4%（13/125），未檢測(cè)出TGEV 和PDCoV。對(duì)符合目的基因大小的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與Genebank上的參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)正確的毒株分別為：YNLPF2-1、YNLPF2-8 和YNLPF2-15（羅平縣肛拭子）；YNQJF4-1、YNQJF4-3、YNQJF4-6、YNQJF4-7 和YNQJF4-9 （曲靖市糞樣）；YNDLF6-1 （大理市糞樣）； YNDLC7-6和YNDLC7-8 （大理市腸樣）。

2.2 PEDV ORF3基因片段的擴(kuò)增

PEDV M陽(yáng)性樣品的ORF3基因引物擴(kuò)增和電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：得到長(zhǎng)833 bp的片段，符合預(yù)期目的（圖2）。

2.3 PEDV M基因和ORF3基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 PEDV M基因的遺傳進(jìn)化分析

PEDV M 基因序列的進(jìn)化樹（圖3） 顯示：10株云南流行毒株同屬GⅡ型。其中，YNQJF4-6和YNQJF4-7 與中國(guó)的AJ1102、GD-A、LC 株親緣關(guān)系較近；其余8 株與GD S07 親緣關(guān)系較近，與GⅠ型CV777、DR13、SM98 等疫苗株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。同源性分析結(jié)果顯示：云南流行株M基因的核苷酸同源性為96.9%～100.0%，與國(guó)內(nèi)外參考流行株的核苷酸同源性為96.2%～99.8%，與經(jīng)典疫苗株CV777 和DR13 的同源性分別為97.1%～98.1% 和96.9%～97.9%，與美國(guó)代表毒株OH851 的同源性為98.1%～99.5%，與GⅡ型的越南株VNUFP013-1 和中國(guó)株AJ1102 的同源性分別為97.6%～99.7% 和97.4%～99.5%。10 株M 基因氨基酸序列與參考毒株CV777、DR13、83P-5、SM98、VNJFP1013-1 的比對(duì)結(jié)果顯示：云南流行株有6 個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，分別是第24 位（C→R）、第53 位（F→S）、第56 位（T→I）、第76 位（I→T）、第162 位（T→M） 和第183 位（Q→P），未出現(xiàn)氨基酸插入及缺失現(xiàn)象。

2.3.2 PEDV ORF3基因遺傳進(jìn)化分析

PEDV ORF3基因序列進(jìn)化樹（圖4） 顯示：10株云南流行毒株同屬GⅡ型。其中，YNQJF 4-3和YNQJF 4-7與中國(guó)的AJ1102、GD-A、LC 株以及越南株VN-JFP1013親緣關(guān)系較近；其余8 株與GD S07親緣關(guān)系較近，與經(jīng)典疫苗株CV777、DR13等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。同源性分析結(jié)果顯示：云南流行株ORF3 基因的核苷酸同源性為95.6%～100.0%，與國(guó)內(nèi)外參考流行株的核苷酸同源性為89.3%～99.6%，與經(jīng)典疫苗株CV777 和JS2008 的同源性分別為96.3%～96.7% 和89.3%～90.2%，與GⅡ型的越南株VNUFP013-1 和中國(guó)株AJ1102 的同源性分別為95.9%～98.8% 和95.9%～99.1%。

2.3.3 PEDV ORF3蛋白氨基酸序列分析

將PEDV ORF3基因片段序列翻譯為蛋白氨基酸序列，與經(jīng)典疫苗株CV777、DR13 和JS2008的ORF3 蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示：與CV777 相比，10 株毒株在第21 位點(diǎn)（A→V）、第54 位點(diǎn)（V→I）、第79 位點(diǎn)（V→I）、第101 位點(diǎn)（A→T） 和第166 位點(diǎn)（N→S） 發(fā)生氨基酸突變；YNQJF4-3 和YNQJF4-7在第168 位點(diǎn)（D→N）、第25 位點(diǎn)（D→L）、第70 位點(diǎn)（I→V） 和第107 位點(diǎn)（C→F） 發(fā)生氨基酸突變；YNDLC7-6、YNDLC7-8、YNDLF6-1、YNLPF2-1、YNLPF2-8、YNLPF2-15和YNQJF4-9在第182 位點(diǎn)（H→Q） 發(fā)生氨基酸突變；無(wú)氨基酸插入或缺失現(xiàn)象。與DR13和JS2008 的ORF3蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示：10 株毒株均未出現(xiàn)氨基酸連續(xù)大片段缺失的現(xiàn)象。

3討論

豬流行性腹瀉于1971年在英國(guó)首次被報(bào)道，之后迅速在歐洲甚至亞洲蔓延，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14-15]。由于PEDV 毒株易發(fā)生變異，導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗免疫效果不佳，因此，有必要通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查監(jiān)測(cè)新出現(xiàn)的流行株，從而及時(shí)研發(fā)針對(duì)性的疫苗用于有效防控[16-17]。本研究采集云南省部分地區(qū)9 個(gè)豬場(chǎng)共125 份小腸、糞便和肛拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：有49份PEDV 陽(yáng)性樣品，14份PoRV 陽(yáng)性樣品，PEDV與PoRV 混合感染率為10.4%，未檢測(cè)出TGEV和PDCoV?？梢?，PEDV 仍是云南省新生仔豬腸道疾病的主要病原，迫切需要研制新型有效的疫苗來(lái)防治PEDV 的變異情況[14]。

對(duì)PEDV M 基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析及同源性分析，結(jié)果表明：10 株云南流行毒株均屬于GⅡ型，其中，YNQJF4-6 和YNQJF4-7與中國(guó)的AJ-1102、GD-A、LC 株親緣關(guān)系較近，其余8 株與GD S07 親緣關(guān)系較近，與GⅠ型CV777、DR13、SM98 等疫苗株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，現(xiàn)有疫苗可能無(wú)法完全覆蓋云南省流行的PEDV 毒株，從而影響疫苗的免疫效果。10 株云南流行株M 序列的核苷酸同源性為96.9%～100.0%，表明這些毒株在遺傳上具有較高的相似性；與國(guó)內(nèi)外參考流行株的核苷酸同源性為96.2%～99.8%，與經(jīng)典疫苗株CV777 和DR13 的同源性分別為97.1%～98.1%和96.9%～97.9%，與GⅡ型的越南株VNUFP013-1和中國(guó)株AJ1102的同源性分別為97.6%～99.7% 和97.4%～99.5%，提示PEDV 可能存在跨國(guó)流傳的現(xiàn)象。10條云南流行株與參考毒株CV777、DR13、83P-5、SM98、VNJFP1013-1的M 基因氨基酸序列有6個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，但未出現(xiàn)氨基酸插入及缺失現(xiàn)象，整體上M 基因序列較保守，與已有研究結(jié)果[18-19]一致。盡管M 基因序列整體上比較保守，但這些突變位點(diǎn)可能影響病毒的生物學(xué)特性或免疫逃避能力，仍然需要引起關(guān)注，可能在未來(lái)成為疫苗研發(fā)或抗病毒藥物設(shè)計(jì)的潛在靶點(diǎn)。

10株云南流行株ORF3序列的核苷酸同源性為95.6%～100.0%，與國(guó)內(nèi)外參考毒株的核苷酸同源性為89.3%～99.6%；氨基酸序列主要有5 個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，無(wú)氨基酸插入或缺失現(xiàn)象。研究表明：ORF3基因是否發(fā)生17 個(gè)氨基酸缺失是區(qū)別野生型和弱毒株的關(guān)鍵分子特征，且與病毒的毒力和致病性密切相關(guān)[20]。本研究中，PEDV毒株的ORF3序列氨基酸未觀察到疫苗株大片段缺失的特征，提示其為強(qiáng)毒株。

本研究揭示了云南省部分地區(qū)流行的PEDV遺傳特征和流行狀況，為了解PEDV 的流行病學(xué)和致病機(jī)制提供了新視角。研究樣本采自云南省部分地區(qū)的9 個(gè)豬場(chǎng)，樣本量相對(duì)有限且地域覆蓋范圍不夠廣泛，可能無(wú)法完全代表云南地區(qū)乃至全國(guó)的PEDV 流行狀況，未來(lái)的研究仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。此外，本研究主要關(guān)注了M 基因和ORF3 基因的遺傳進(jìn)化特征，而PEDV 的其他基因片段也可能對(duì)病毒的生物學(xué)特性和致病機(jī)制有重要影響。因此，未來(lái)的研究需要綜合考慮PEDV 的全基因組特征，以更全面地理解其遺傳多樣性和致病機(jī)制。

4 結(jié)論

云南流行的PEDV 是以GⅡ型為主的強(qiáng)毒株，與中國(guó)其他地方流行的毒株親緣關(guān)系密切，急需研制針對(duì)變異株的疫苗，降低其帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。

責(zé)任編輯：何謦成