段曉紅 解冰輝 駱 菲 羅文學 郭彥軍 張軍輝 馬軍紅 和利民 劉廷玉 王貴江

(河北省畜牧良種工作總站，河北石家莊 050061）

種豬常溫精液的品質直接影響母豬受胎率和產(chǎn)仔數(shù)[1]，精液質量的好壞需要進行檢測評價，評價檢測指標是按照種豬常溫精液國家標準（GB 23238-2021）執(zhí)行[2]。精液劑量、精子活力、精液密度、精子畸形率是種豬常溫精液國家標準規(guī)定的4 項常規(guī)檢測指標。近年來，為了推進生豬種業(yè)振興，加強生豬良種補貼項目的監(jiān)督管理，需不定時抽檢種豬常溫精液，保證種豬精液質量，嚴把種豬精液質量關，提高技術人員業(yè)務素質和技能水平[3]。隨著種豬人工授精技術的普及，種豬常溫精液在生產(chǎn)前、生產(chǎn)后和使用前，都必須進行精液質量檢測，合格的精液才能用于配種，場內種豬常溫精液檢測工作在種豬場尤為重要[4,5]。由于非洲豬瘟等疫情的發(fā)生，很多豬場放棄飼養(yǎng)種公豬，通過從外界購買種豬常溫精液來進行品種改良[6]。因此，種豬常溫精液檢測這項工作成為實驗室人員和豬場負責精液生產(chǎn)人員的一項重點工作。

精液質量檢測過程中保證數(shù)據(jù)的準確性尤為重要，精準數(shù)據(jù)是評估種公豬個體價值的重要依據(jù)，也可為種公豬站指導種豬飼養(yǎng)、豬舍環(huán)境、人工采精、稀釋倍數(shù)等指標提供科學依據(jù)，但是檢測過程中影響種豬常溫精液檢測指標數(shù)據(jù)準確性的因素很多[7,8]。目前，實驗室檢測工作中影響種豬常溫品質檢測結果因素總結性的文章較少，按照國家標準種豬常溫精液檢測指標（精子劑量、精子活力、前向運動精子數(shù)和畸形率）質量要求，筆者從影響種豬精液劑量、精子活力、精子密度和精子畸形率4 個檢測指標進行分析，避免檢測過程出現(xiàn)較大誤差，為便于實驗室檢測人員按照國家標準進行準確操作和保證種公豬站產(chǎn)品的質量，同時幫助養(yǎng)殖戶買到質量可靠、放心的種豬常溫精液提供參考。

1 影響精液劑量檢測結果的因素

精液劑量是種豬常溫精液國家標準規(guī)定的檢測指標之一，是評判檢查結果是否合格的一項指標。檢測質量要求受體為引進或培育豬種，用于常規(guī)輸精劑量≥80 mL/劑；用于深部輸精≥60 mL/劑。受體為地方豬種則輸精劑量≥40 mL/劑。

1.1 天平稱量

目前，種豬常溫精液國家標準（GB 23238-2021）劑量檢測方法是使用稱量法[2]。影響天平稱量準確性的因素有：天平應放在獨立天平桌上、避免外界環(huán)境對其產(chǎn)生影響、每年需對天平進行校準、使用前檢查電子天平運行的狀況、稱量前先清零，再稱重記錄等，記錄數(shù)據(jù)時，要避免人為記錄錯誤。

1.2 精液瓶標簽

完善精液瓶標簽信息是了解精液質量及信息的依據(jù)之一，生產(chǎn)種豬精液的廠家應引起重視。根據(jù)標簽上精液用于深部輸精還是常規(guī)輸精，國家標準質量要求是不一樣的。判斷精液劑量是否合格時，若標簽上尚未標明是用于常規(guī)或者深部輸精，易造成無法正確判斷精液劑量檢測結果，比如：受體為引進或培育豬種，常規(guī)輸精≥80 mL/劑；深部輸精≥60 mL/劑，則為合格。受體為地方豬種輸精劑量≥40 mL/劑，則為合格。不同輸精方式和受體品種的判斷標準不同。

1.3 空包裝的稱量

當送檢廠家提供放置精液的空包裝時，直接進行精液的稱重檢測，一般不會影響檢測結果。當送檢廠家沒有提供空包裝時，需要檢測人員倒出瓶內的精液，在清洗干凈、干燥后再稱量空包裝的重量，否則可能會影響精液劑量檢測結果的準確性。目前市場精液包裝有3 種，分別為袋裝、瓶裝和管裝。瓶裝稱量清洗干燥比較容易，產(chǎn)生的誤差小；袋裝和管裝口較小，不方便清洗干燥，可直接從袋中間剪開進行清洗干燥再稱量，稱量前一定查看瓶蓋等包裝是否齊全。

1.4 結果

計算結果需要保留1 位小數(shù)，正確的數(shù)值修約反映了檢測結果的精確度，應按照GB/T8170 的規(guī)定進行修約。

2 影響精子活力和密度檢測結果的因素

精子活力是指精液中呈前進運動的精子所占的百分率。當精液溫度在37℃左右時，以精液中向前運動精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比表示。精液密度是每劑精液中呈前進運動精子的總數(shù)。密度指標在檢測報告中不體現(xiàn)，但這是保證做前進運動精子數(shù)的重要指標。常溫精液精子活力和密度是種豬配種效果的關鍵指標。

2.1 影響精子活力的因素

2.1.1 精液運輸

剛接收到的樣品立即檢測精液活力，活力往往不好，原因可能是運輸過程中應激疲勞導致，等一段時間后再進行檢測，可使精子恢復一定活力。周琳[9]研究發(fā)現(xiàn)，精液運輸期間，精液需要應對各種應激，溫度變化、運輸振動都會引起精液活力異常，劇烈振動會提高精液pH 值和氧化應激水平，還會影響線粒體活性，從而影響精子運動能力。運輸時應使用車載冰箱，冰箱需通過質檢并合格，冰箱中放置溫度計以檢測溫度是否正常，保證樣品在16～18℃下避光密封運輸，運輸過程中避免強烈振動和碰撞。

2.2.2 精液保存的溫度

溫度是精液質量控制的關鍵環(huán)節(jié)，精液應保存在17℃恒定溫度下，在檢測過程中為避免出現(xiàn)溫度不穩(wěn)定等問題，可將精液保存在恒溫箱中，避免精液活力降低。曾瓊[10]等研究表明豬精液對高溫比較敏感，溫度越高，精子運動越快，消耗的營養(yǎng)與能量越多，保存時間越短。所以，種豬常溫精液最佳溫度控制在16～18℃。李軍偉[11]等研究表明，與17℃相比，22℃和37℃保存精子活率和活力在24 h 后顯著下降，37℃下保存促進了精子由早期凋亡向晚期凋亡的轉化，破壞了精子的調節(jié)機制，不利于精子的存活。

2.2 影響精子活力和精液密度檢測的因素

2.2.1 計算機輔助精子分析

計算機輔助精子分析（Computer-aided sperm analysis,CASA）系統(tǒng)是使用電腦技術進行精液質量分析的儀器[12]，可以有效降低人為目測讀數(shù)誤差大等問題。目前市場上計算機輔助精子分析軟件很多，但是分析軟件要符合豬常溫精液國家標準規(guī)定的技術參數(shù)，否則會影響精子活力數(shù)值。

2.2.2 顯微鏡調節(jié)

亮度、焦距等調節(jié)不到位會引起精子檢測系統(tǒng)無法被識別，影響精子活力檢測結果，可通過調節(jié)聚光器，直至視野光線最佳。

2.2.3 腔室玻片

在使用CASA 系統(tǒng)分析精子活力及密度時，腔室玻片與載玻片和蓋玻片在使用方面有著很大差異，所以檢測過程中一定注意使用配套的腔室玻片。腔室玻片檢測圖像清晰，容易抓拍精子，不分層，CASA 系統(tǒng)能夠更準確地進行分析。普通的玻片點樣時會出現(xiàn)分層，導致軟件不能夠準確分析，甚至超出系統(tǒng)估計數(shù)值，無法分析數(shù)據(jù)。標準規(guī)定腔室玻片高度為（20±2）μm 最佳。陳亞靜[13]等研究發(fā)現(xiàn)，不同品牌的專用玻片在（20±2）μm 高度下使用CASA 系統(tǒng)進行檢測，差異不顯著。

將萊卡腔室玻片和某廠家腔室玻片進行比較，發(fā)現(xiàn)使用某廠家玻片的精子瞬間死亡，可能是腔室玻片內的分隔線使用的膠水導致，誤判檢測結果為不合格。萊卡腔室玻片對精子活力無影響，但是價格偏高，為了保障檢測結果的準確性，應選擇質量好的腔室玻片。

2.2.4 取樣方式

精液在靜置時，精子易下沉至底部，影響取樣的均勻度。應將精液樣品搖勻后，傾斜約45°，將移液器的吸頭伸入液面下15～20 mm 處，最佳取樣的精液液面高度為1.5 cm。

2.2.5 搖勻方式和時間

搖勻是精液品質檢測前中重要的步驟，正確的搖勻方式是上下輕輕旋轉儲精管，時間為2～3 min 左右。檢測結果表明，檢測活力指標搖勻時間1～5 min 均可，搖勻時間在5 min 以上易出現(xiàn)較大誤差，2～3 min 則較為理想。陳亞靜[14]等研究表明，種豬常溫精液在不同密度下對母豬受胎率與產(chǎn)仔數(shù)有影響。

2.2.6 翻轉

精液樣品儲存時，應定時定點進行樣品的翻轉。長時間不翻轉樣品，精子之間易聚集、纏繞和粘連[15]，從而影響精子密度和活力。

2.2.7 溫度

37℃恒溫臺預熱是豬精液活力質量控制的關鍵環(huán)節(jié)。通過試驗比較發(fā)現(xiàn)，預熱載物臺控制溫度精準程度是關鍵，當溫度低于37℃時，精子活力不佳，精子尾巴彎曲，不進行直線運動，可能會抑制精子的活動能力和代謝速度；當溫度高于37℃時，可以提高精子的活動能力和代謝速度，但會縮短精子的生存時間，精子很快活躍完畢并死亡。載物臺溫度應該保持37±1℃，載物臺溫度需經(jīng)過檢測，保證溫度在要求的范圍內使用，以提高檢測結果的準確性。

2.2.8 預熱時間

由于檢測使用的腔室玻片空間有限，精液量有限，如果預熱時間過長，精液液體易干燥或減少，從而抑制精子活力，所以取樣之前最好搖勻并吸取精液到1.5 mL小試管中，在水浴鍋內先預熱，等到精液預熱后再點樣進行檢測，檢測結果活力更佳，但是需要注意水浴鍋的溫度，防止水浴鍋溫度不穩(wěn)定，降低或提高精子活力，造成結果不準確，精液預熱的時間為1～3 min。李平[7]等研究發(fā)現(xiàn)，精液在37℃下預熱3～5 min 活力最好，專用玻片取樣是5 μL，普通載玻片取樣20 μL，由于使用的玻片不同，預熱時間也不同。

2.2.9 檢測精液時間

腔室精液液體比較少，觀看時間長，易導致后續(xù)觀察視野的精子死亡，影響最后結果的平均值，最終影響精子活力檢測結果。

2.2.10 移液器

移液器的正確使用與精液密度分析有著密切的關系[4]，移液器分兩個檔，如果用2 檔點樣會導致制備的樣品測出的密度不準確，需要重點學習移液器正確使用方法。移液器需要定期進行校正，每年至少送質檢部門檢測1 次。朱丹[4]等研究發(fā)現(xiàn)，移液器氣密性、漏氣需要及時檢查處理，提高精液取樣準確性。

2.2.11 檢測結果

檢測精子活力需要做2 個平行樣，每個平行樣測定3 個結果并取平均值，檢測過程中2 個樣品點計算結果相對偏差應小于5%，大于5%則應重檢。如果檢測結果不合格，需多次重復進行檢測，防止出現(xiàn)誤判。精子活力計算結果需要保留1 位小數(shù)；精液密度讀取結果，保留至小數(shù)點后3 位。

2.2.12 儀器檢測校正

儀器在使用一段時間后需要進行校正。校正方法有血球計數(shù)板法、儀器法。

血球計數(shù)法檢測：將每份樣品檢測2 次，2 次檢測結果之間的相對偏差應小于5%，否則重檢，用2 次檢測結果的平均值表示該樣品的檢測結果。同一份樣品至少由2 人進行精子密度檢測，2 人檢測結果之間的相對偏差應小于5%，否則重檢。儀器法檢測：對血球計數(shù)法中的同一樣品，按儀器法的步驟檢測精子密度，至少2 次。儀器檢測結果之間的相對偏差應小于5%，否則重檢。當檢測結果滿足要求時，取其平均值作為儀器法的最終檢測結果。將血球計數(shù)法和儀器法的最終檢測結果進行比對，若兩者之間的相對偏差小于5%，則精子質量分析儀完成校正。否則應按照精子質量分析儀的參數(shù)設置程序，調整精子密度檢測的相關參數(shù)，并重復血球計數(shù)板法的步驟，直至血球計數(shù)法和儀器法檢測結果之間的相對偏差小于5%。

3 影響精子畸形率檢測結果因素

精子畸形率是指精子的形態(tài)發(fā)生異常的數(shù)量占總精子數(shù)量的比率，精子正常分為頭、體、尾3 部分，如果形態(tài)發(fā)生異常就稱為畸形。最常見的為頭部畸形，如大頭、雙頭、無頭，頭部變得粗大、折裂甚至不完整；尾部發(fā)生卷曲，雙尾、缺尾、斷裂等。精子形態(tài)發(fā)生異常以后，會影響精子的受精能力。影響精子畸形率檢測結果因素是抹片，抹片操作不當很容易造成精子畸形，原因就是推動樣品到另一側時沒有與載玻片呈約35°夾角，直接緊挨載玻片推動，很容易造成斷頭斷尾，使精子畸形率上升[16]。正確方法是用移液槍吸取10 μL 樣品滴于載玻片一端（吸取劑量根據(jù)精液密度調節(jié)），將推片的邊緣與載玻片呈約35°夾角向另一側緩慢推動，將樣品均勻地涂抹在載玻片上。

4 小結

綜上所述，種豬常溫精液品質檢測結果準確性尤為重要，筆者對在實驗室檢測過程中發(fā)現(xiàn)的問題進行了系統(tǒng)的整理分析，把影響精液檢測結果因素進行了詳細闡述，一方面為從事精液檢測的工作人員提供參照依據(jù)，另一方面為減少精液檢測時出現(xiàn)較大誤差，精準的檢測結果可以用于指導分析種豬場現(xiàn)有的問題，從根本上改善種公豬質量，從而提高生豬精液品質，為養(yǎng)殖戶能夠放心購買精液，為生豬良種補貼項目起到真正的作用，對生豬生產(chǎn)具有重要意義。