黎 瑞,陳澤慧,周小仙,余孟飛,楊智芳,李明哲

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 醫(yī)學檢驗科,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院,貴州 遵義 563099)

金黃色葡萄球菌是臨床上一種重要的病原菌,可引起一系列人類疾病,包括輕微的皮膚感染、嚴重的組織感染和敗血癥[1]。目前,主要依靠抗菌藥物治療金黃色葡萄球菌引發(fā)的感染。然而,隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)的出現(xiàn),耐藥問題日漸嚴重[2],該類細菌不但對β-內(nèi)酰胺類,還對糖肽類、大環(huán)內(nèi)酯類等多種抗菌藥物出現(xiàn)了耐藥性[3-4],使得臨床治療變得極為困難。因此,開發(fā)具有抗MRSA感染的新型藥物迫在眉睫。

在探索新藥物的過程中,天然產(chǎn)物一直是重要來源[5]。巴西蘇木素(Brazilin,BN)是一種從中藥材蘇木中分離提取的天然產(chǎn)物,是蘇木主要活性成分之一,分子式為C16H14O5。其具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌的作用,同時還具備降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學活性[6]。研究發(fā)現(xiàn)BN對MRSA具有抗菌作用,可導致MRSA細胞膜通透性增加、DNA與RNA等大分子物質(zhì)外滲增加以及可溶性蛋白表達減少[7]。然而,目前尚無BN通過影響MRSA細胞壁合成來發(fā)揮抑菌作用的報道。細胞壁是細菌及植物細胞所特有的結(jié)構(gòu),可保持細胞的完整性,對細菌的生長和分裂至關(guān)重要。參與細菌細胞壁合成過程中的關(guān)鍵酶一直是研發(fā)抗菌藥物靶標的熱點。其中丙氨酸消旋酶(alanine racemase, Alr)是一種吡哆醛-5'-磷酸依賴性細菌酶,參與細菌細胞壁的合成,為其提供肽聚糖交聯(lián)所必需的前體D-丙氨酸,對細菌的存活至關(guān)重要[8-9]。由于人類細胞沒有細胞壁結(jié)構(gòu),而Alr廣泛存在于細菌中[10-11]。因此,Alr成為抗菌藥物研發(fā)的理想靶標。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BN能夠破壞MRSA細胞壁肽聚糖的合成,在對BN作用MRSA菌株前后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析后,發(fā)現(xiàn)BN可以下調(diào)細胞壁肽聚糖合成過程中D-Ala代謝途徑的關(guān)鍵酶Alr的調(diào)控基因Alr。因此,基于BN對MRSA有較好的抗菌效果,進一步的探明該效果是通過抑制Alr的活性而發(fā)揮的作用,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 巴西蘇木素(成都普思生物科技股份有限公司),純度≥98%;細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)、通用型DNA純化回收試劑盒(TIANGEN公司);限制性內(nèi)切酶HindⅢ、XhoⅠ、T4DNA連接酶(大連TaKaRa公司)、蛋白Marker(Solarbio公司)、磷酸吡哆醛(MACKLIN公司)、L-丙氨酸(Solarbio公司)、D-氨基酸氧化酶(Aladdin公司)、4-氨基安替比林(MACKLIN公司)、辣根過氧化物酶(Solarbio公司)、TOOS(MACKLIN公司)、Britton-Robinson緩沖液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)、Tris-Hcl(Solarbio公司)。

1.2 主要儀器 JY300C型電泳儀(北京君意東方電泳公司)、YJ-SCZ 2+型垂直電泳槽(北京君意東方電泳公司);T100型PCR儀(美國 Bio-Rad公司);K5600型超微量分光光度計(北京凱奧科技發(fā)展有限公司);MultisKan型全波長酶標儀(美國Thermo Scientific 公司)。

1.3 實驗菌株 MRSA ATCC 43300購于上海寶錄生物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 丙氨酸消旋酶的克隆、表達及純化 (1)PCR擴增及切膠回收Alr于NCBI(accession號為NC_002952)檢索獲得金黃色葡萄球菌Alr基因序列,通過SnapGene軟件設計引物。通過聚合酶鏈反(polymerase chain reaction, PCR)克隆MRSA ATCC 43300的Alr基因,并進行切膠回收。 PCR擴增Alr所需引物(下劃線部分分別是HindⅢ和XhoⅠ的酶切位點)及質(zhì)粒(表1)。

表1 PCR擴增Alr所需引物及質(zhì)粒

(2)pET-28a-Alr重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定使用限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI雙酶切Alr基因及pET-28a質(zhì)粒,將其混合后,進行連接。熱激轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中,提取重組質(zhì)粒并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,將正確的命名pET-28a-Alr,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?3)pET-28a-Alr重組質(zhì)粒的誘導、表達及純化通過熱激法獲得BL21 (DE3)感受態(tài)細胞后,將pET-28a-Alr轉(zhuǎn)入其中,用終濃度為0.05 mmol/L的IPTG,于20 ℃,120 r/min下誘導12～16 h,收集菌體進行超聲破菌后,經(jīng)鎳離子金屬親和層析法純化上清液中的Alr蛋白[12]。然后通過SDS-PAGE法檢測Alr的純度,以超濾杯進行脫NaCl、脫咪唑并濃縮蛋白。使用BCA法對濃縮蛋白定量后分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 BN抑制Alr活性實驗 Alr活性測定采用消旋反應及氧化反應兩步法進行測定[13]。(1)消旋反應在總體積為200 μL的反應體系中分別加入終濃度為20 mmol/L的Britton-Robinson緩沖液、125 mmol/L L-丙氨酸、10 μmol/L輔酶PLP、適量純化的Alr及終濃度分別為 8、16、32、64 μg/mL 的BN,同時設立對照組。置于37℃ 培養(yǎng)10 min,然后加入25 μL 2 mol/L HCl終止反應的進行,于冰上靜置2 min后加入相同體積的NaOH溶液,將多余的酸中和,得到消旋反應產(chǎn)物,隨后將其離心并吸取上清轉(zhuǎn)移至新Ep管中。(2)氧化反應在總體積為200 μL的反應體系中分別加入0.1 mg/L 4-氨基安替吡啉、0.1 U D-氨基酸氧化酶、0.1 mg/L TOOS、100 mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、2 U過氧化物酶及適量消旋反應產(chǎn)物。37 ℃培養(yǎng)20 min,用酶標儀測定550 nm處吸光度值。Alr酶活力定義：1 min內(nèi)催化L-Ala生成1 μmol D-丙氨酸所需的酶量為一個酶活性單位(U) 。每組實驗做3個平行,重復3次。

1.4.3 細胞熱穩(wěn)定遷移實驗(CETSA) 將pET28a-Alr重組質(zhì)粒進行誘導表達,超聲破菌后離心,從上清液中獲得總蛋白。取 600 μL 上清液用128 μg/mL BN進行處理,同時設立對照組。 37 ℃ 孵育1 h,12 000×g離心 20 min。將上清液進行分裝,每管60 μL,共6管。分別在30、45.7、50、55.9、59.5、64 ℃ 溫度下孵育10 min,將樣品在12 000×g下離心 20 min,得到上清液。所有樣品進行蛋白免疫印跡檢測,獨立重復3次實驗。

1.4.4 蛋白免疫印跡實驗 將上一步所得上清液進行SDS-PAGE電泳。在轉(zhuǎn)膜后,進行封閉2 h,在4℃條件下與抗-Alr多克隆抗體孵育過夜,然后用TBST進行洗滌,1次10 min,共3次,接著用山羊抗鼠抗體孵育,37℃,2 h后,ECL顯色雜交條帶,以檢測Alr的表達水平。

1.4.5 分子對接 在Alphafold數(shù)據(jù)庫檢索Alr蛋白結(jié)構(gòu)文件。將Alr蛋白指定為受體,小分子BN指定為配體。PyMOL(4.3.0版)軟件(https：//pymol.org/)用于分子結(jié)構(gòu)和對接結(jié)合物的可視化。

AutodockTools(http：//mgltools.scripps.edu/downloads)用于加氫,檢查電荷,將原子類型指定為AD4類型,計算gasteiger,并構(gòu)建受體蛋白的對接網(wǎng)格盒,此外,配體小分子BN應確定Root,在AutodockTools中選擇配體的可扭轉(zhuǎn)鍵。最后,在AutodockTools中,受體分子和配體分子的格式都應該從“.mol2”轉(zhuǎn)換為“.PDBQT”,以便進一步對接。利用Vina對接后,計算小分子BN與該蛋白組合的得分,并使用PyMOL和Discovery Studio軟件進行作用力分析和可視化。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增Alr基因及pET-28a-Alr原核表達載體的構(gòu)建 以MRSA ATCC 43300菌株的DNA為模板進行PCR擴增Alr基因,目的基因片段的大小為1 149 bp,符合預期分子量(圖1A)。將目的基因克隆入pET-28a載體中并轉(zhuǎn)化至DH5α中,進行菌液PCR驗證,結(jié)果顯示所有目的條帶的大小均符合預期(圖1B)。

A：Alr基因PCR擴增電泳結(jié)果(marker：DNA標記DL2000 bp;1：擴增的Alr基因);B：菌液PCR鑒定結(jié)果(M：DNA標記DL2000 bp;1：陽性對照;2～8：陽性克隆菌)。圖1 pET28a-Alr重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 MRSA Alr蛋白的誘導、表達及純化 用IPTG誘導轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞的重組質(zhì)粒,收集超聲后的菌上清,再經(jīng)過鎳親和層析法純化后,純度較高的Alr蛋白在60、80、100、150 mmol/L咪唑洗脫液中獲得。純化得到的Alr蛋白的分子量為48 kDa左右(圖2),與預期的蛋白分子量一致,檢測Alr蛋白濃度約為1.2 mg/mL。

marker：180 kD蛋白標記;1：未誘導;2：誘導全菌;3：誘導離心后上清;4：流穿液;5：10 mmol/L咪唑;6：20 mmol/L咪唑：7：30 mmol/L咪唑;8：40 mmol/L咪唑;9：60 mmol/L咪唑;10： 80 mmol/L咪唑;11：100 mmol/L咪唑;12：150 mmol/L咪唑。 圖2 Alr蛋白純化的SDS-PAGE結(jié)果

2.3 BN對Alr酶活性的抑制 與對照組相比,8～64 μg/mL巴西蘇木素均抑制了Alr活性(P<0.01),且呈一定劑量相關(guān)性,其中64 μg/mL抑制率達到約50%(圖3)。

2.4 BN與Alr蛋白的相互作用 CETSA實驗結(jié)果顯示,在55.9～59.5℃下BN處理后的Alr蛋白熱穩(wěn)定性明顯高于Mock組(P<0.0001),提示BN與Alr蛋白有直接結(jié)合的相互作用關(guān)系(圖4)。

2.5 分子對接 將單體巴西蘇木素(結(jié)構(gòu)見圖5)與Alr蛋白進行對接,利用Vina對接后,計算小分子巴西蘇木素與該蛋白組合的得分,并使用PyMOL和Discovery Studio軟件進行作用力分析和可視化。將Alr蛋白指定為受體,將小分子巴西蘇木素指定為配體。結(jié)果見圖6,配體小分子巴西蘇木素與受體蛋白Alr之間的結(jié)合能為-8.0 kcal/mol,其可通過5條分別為2.9、3.1、3.4、3.3、4.0 ?的氫鍵分別與受體蛋白Alr的221號GLY氨基酸殘基、204號SER氨基酸殘基、219號ARG氨基酸殘基、43號TYR氨基酸殘基和222號ILE氨基酸殘基結(jié)合;此外,配體小分子巴西蘇木素可通過2條分別為3.5 ?的疏水作用力和3.0 ?的氫鍵均與受體分子Alr的203號ASN氨基酸殘基結(jié)合;還可通過1條3.8 ?的疏水作用力和1條4.0 ?的氫鍵分別與受體分子Alr的352號ILE氨基酸殘基和169號PHE氨基酸殘基結(jié)合;還可通過2條分別為4.0 ?的疏水作用力和4.2 ?的面對面π-π堆疊力均與受體分子Alr的354號TYR氨基酸殘基結(jié)合。此外,二維作用力分析也得到了相似的結(jié)果。

圖5 巴西蘇木素結(jié)構(gòu)

3 討論

由于MRSA菌株對大多數(shù)抗菌藥物均出現(xiàn)了耐藥性,導致臨床治療變得非常困難。因此,需要研發(fā)新的抗菌藥物來預防和治療MRSA感染。Alr是細菌細胞壁肽聚糖合成的關(guān)鍵酶,因其廣泛存在于原核生物中,而在哺乳動物中較少,這使得其成為抗菌藥物的靶點。

針對Alr抑制劑的研發(fā)已成為重點,根據(jù)其抑制機制的不同,可分為以下3種。①底物類似物抑制劑,其與酶的底物結(jié)構(gòu)相似,通過與酶的活性位點競爭性結(jié)合,阻止底物的結(jié)合和酶的催化活性,從而抑制酶活性。D-環(huán)絲氨酸是底物類似物抑制劑,其結(jié)構(gòu)與丙氨酸類似,一般作為二線藥物用于治療結(jié)核病。Amorin-Franco等[14]發(fā)現(xiàn)D-環(huán)絲氨酸除了抑制Alr外,還抑制其他不相關(guān)的磷酸吡哆醛(PLP)依賴性酶,引起嚴重的不良反應,如頭痛、抑郁及嗜睡等。因此,開發(fā)具有更高特異性的Alr抑制劑仍然十分必要。②非底物類似物抑制劑,用來克服PLP相關(guān)的脫靶效應的酶抑制劑,其通過與酶活性中心不同的位點結(jié)合,改變酶的構(gòu)象,從而抑制酶的催化活性。Wang等[15]首次證實了高龍膽酸和對苯二酚對嗜水氣單胞菌的抗菌活性,且它們均是非底物類似物抑制劑,通過與Alr活性位點結(jié)合發(fā)揮抑制作用。雖然非底物類似物抑制劑不與其他PLP依賴性酶結(jié)合,但研究發(fā)現(xiàn)此類抑制劑仍會產(chǎn)生一定的細胞毒性。因此,尋找對人類毒副作用更小的Alr抑制劑十分重要。③中草藥抑制劑,中草藥在我國資源豐富,因其成本低,副作用小等優(yōu)點而廣受關(guān)注。Kumari等[16]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和分子對接對85種植物的化學成分進行測定,發(fā)現(xiàn)1,8-桉葉油腦、庚酸和芳樟醇與Alr結(jié)合能比底物丙氨酸的低,具有較高的生物活性評分。盡管BN被發(fā)現(xiàn)可以抑制MRSA菌株[17],但目前尚未有研究證明這種抑菌效果是通過抑制Alr來實現(xiàn)的。因此,本研究通過誘導表達Alr,進行體外活性實驗初步驗證BN作為Alr抑制劑的可能性。結(jié)果表明BN能夠較好抑制Alr活性,且有濃度依賴關(guān)系。為了進一步研究BN抑制Alr活性的機制,首先需要證明BN是否直接與Alr結(jié)合,Prabhu等[18]發(fā)現(xiàn)當藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合時,蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性會發(fā)生變化。因此,本研究通過CETSA實驗進行驗證,該實驗是一種用于評估藥物與蛋白質(zhì)相互作用的方法。實驗結(jié)果顯示BN能夠與Alr蛋白相互結(jié)合并提高其熱穩(wěn)定性。但它們是如何結(jié)合的仍不清楚,為此本研究通過分子對接進行了預測。分子對接是一種計算方法,用于預測藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點、結(jié)合方式及結(jié)合能力。文獻報道,當結(jié)合能為負值時說明配體與受體之間可以自發(fā)結(jié)合[19]。本文對接結(jié)果顯示BN與Alr之間的結(jié)合能為-8.0 kcal/mol,說明二者可以自發(fā)結(jié)合。研究表明,在Alr活性位點入口通道的殘基有助于確保底物的準確進入和定位到活性位點,從而實現(xiàn)催化反應的進行[20];Alr通常以二聚體形式存在,在其活性位點及結(jié)合口袋中存在的殘基可提供穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),維持酶的活性[21]。

對接結(jié)果顯示BN與Alr活性位點的Gly221、Phe169形成氫鍵作用,與Alr結(jié)合口袋中的Asn203形成疏水作用,這些氫鍵及疏水等作用有助于增加BN與Alr之間的穩(wěn)定性;與Alr活性位點中的Arg219、Ser204、Ile222和Tyr43等氨基酸殘基形成氫鍵作用,從而影響Alr與PLP結(jié)合發(fā)揮作用的穩(wěn)定性;與其活性位點通道的Ile352形成疏水作用,同時與Tyr354形成疏水作用及面對面π-π堆積相互作用,通過占據(jù)活性位點通道進而影響Alr活性。

綜上所述,BN可能是通過與MRSA 菌株Alr的活性位點及其通道處的氨基酸形成氫鍵或疏水作用進而抑制Alr的活性,為后續(xù)研究BN作為Alr抑制劑進而抗MRSA感染提供了理論依據(jù)。