何 念,曲 顏,張念杰,萬 磊,楊雪峰

(遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 胃腸外科,貴州 遵義 563006)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見的消化道腫瘤之一。2019年全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌新增發(fā)病率和死亡率均分別位于男女性癌癥病例的第3位[1]。由于CRC發(fā)病隱匿強(qiáng)的原因,CRC確診時(shí)已處于中晚期,對于中晚期結(jié)直腸癌患者而言,治療手段主要采用外科手術(shù)切除,輔以放化療的治療手段。但隨著化療藥物如5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑的廣泛使用,CRC逐漸對臨床化療藥物產(chǎn)生獲得性耐藥性,獲得性耐藥是CRC復(fù)發(fā)及影響預(yù)后的重要因素,嚴(yán)重影響患者的生存率[2-3]。MicroRNAs (miRNAs)已經(jīng)成為多種腫瘤的檢測、診斷、治療選擇、預(yù)后及調(diào)節(jié)機(jī)制中的潛在標(biāo)志物[4]。miR-210在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起到一個(gè)至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-210能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞周期進(jìn)程,上調(diào)細(xì)胞ROS集聚,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。血清中miR-210的表達(dá)可能是結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的潛在非侵入性標(biāo)志物[6]。研究證實(shí)miR-210-3p下調(diào)后,通過促進(jìn)DNA損傷修復(fù)及代謝重編程,進(jìn)而降低結(jié)直腸癌細(xì)胞對5-FU的藥物敏感性[7]。

目前,miR-210對結(jié)直腸癌細(xì)胞順鉑耐藥的影響及機(jī)制還不是特別清楚,因此,本項(xiàng)目研究miR-210在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株及順鉑耐藥細(xì)胞株中的表達(dá),探索miR-210對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控的影響及潛在機(jī)制,為后續(xù)深入研究結(jié)直腸癌細(xì)胞對順鉑類藥物敏感性的研究做堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞順鉑耐藥株HCT-116/DDP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存(耐藥指數(shù)IR：126.211);HCoEpiC人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞購自于賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司;人結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT-116、HT-29、SW620)購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫;miR-210 mimics及inhibitor購自于廣州銳博生物;順鉑購自德國Merck公司;Cell-Counting-Kit-8(CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒)、Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒、RIPA細(xì)胞快速裂解液購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司;McCoy's 5a培養(yǎng)基、LipofectamineTM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、TRIzol購自美國Thermofisher;PVDF膜、化學(xué)發(fā)光試劑購自美國 Millipore 公司;SYBR Green PCR試劑盒購自于美國KAPA Biosystems公司;PrimeScriptTMRT Master Mix購自于日本TAKARA;兔抗Bad、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、GAPDH購自于英國abcam;兔抗ABCG2、MRP2、P-gp、Wnt3a、β-Catenin購自于中國Bio-Swamp;HRP偶聯(lián)抗兔二抗購自武漢Proteintech;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。T100-Thermal Cycler型PCR儀、CFX-96型熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司;MultiskanFC酶標(biāo)儀購自美國Thermofisher公司;超凈工作臺購自于中國蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱購自于美國Thermofisher公司;倒置熒光顯微鏡購自于德國Leica公司;NovoCyteTM流式細(xì)胞儀購自Novo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT-116、HT-29、SW620、HCT-116/DDP細(xì)胞快速復(fù)蘇后,選用添加終濃度為10%FBS的各細(xì)胞對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80%～90%時(shí),按照1∶2～3的比例傳代,備用。

1.2.2 qRT-PCR檢測 收集2.1中培養(yǎng)好的細(xì)胞,Trizol裂解,提取RNA,PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,以U6為內(nèi)參,qRT-PCR檢測各細(xì)胞中miR-210的表達(dá)水平,反應(yīng)程序：95 ℃,3 min;95 ℃,5 s;56 ℃,10 s;72 ℃,25 s;39 cycles;65 ℃,5 s;95 ℃,50 s;擴(kuò)增引物見表1,引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的HCT-116、HCT-116/DDP細(xì)胞,按照2×104cells/mL的細(xì)胞量接種到6孔板,利用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑將miR-120 mimics及inhibitor片段轉(zhuǎn)染到HCT-116/DDP細(xì)胞中24 h后,進(jìn)行相關(guān)干預(yù)或者檢測。HCT-116/DDP在轉(zhuǎn)染后,將細(xì)胞分成Control組、mimics組、inhibitor組、cisplatin(DDP)處理組、cisplatin與mimics或者inhibitor聯(lián)合組;其中cisplatin按照80 μg/mL的終濃度作用24 h。

1.2.4 細(xì)胞活力評價(jià) 細(xì)胞按照1.2.3分組轉(zhuǎn)染并干預(yù)對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后,收集各組細(xì)胞,按照CCK-8試劑盒操作說明,每孔加入10 μL CCK-8工作液,在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h,用酶標(biāo)儀(450 nm)檢測各組細(xì)胞的吸光值(OD值)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞按照1.2.3分組轉(zhuǎn)染并干預(yù)對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后,收集細(xì)胞,按照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明,加入5 μL Annexin V-FITC及10 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色工作液,輕輕搖晃,室溫避光靜置10～20 min后,置于冰盒中,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測,NovoExpressTM細(xì)胞凋亡分析軟件進(jìn)行凋亡數(shù)量分析。

1.2.6 Western blot檢測 細(xì)胞按照1.2.3分組轉(zhuǎn)染并干預(yù)對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后,選用高強(qiáng)度RIPA裂解細(xì)胞,冰盒中靜置20 min后, 4 ℃ 10 000～14 000 g離心3～5 min,取離心后的細(xì)胞上清,BCA定量后,按照每孔20 μg蛋白量上樣,SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)膜,分別以兔抗Bad(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Cleaved-Caspase-3(1∶800)、ABCG2(1∶1 000)、MRP2(1∶800)、P-gp(1∶1 000)、Wnt3a(1∶1 000)、β-Catenin(1∶500)及GAPDH(1∶10 000),4 ℃冰箱避光靜置過夜后,TBST溶液漂洗3次,加入HRP偶聯(lián)的抗兔二抗。加入ECL發(fā)光液后,利用全自動化學(xué)發(fā)光分析儀掃描膜,通過TANON GIS軟件讀取各蛋白相關(guān)條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miRA-210抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡 qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),與HCoEpiC人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞相比,結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT-116、HT-29、SW620)及HCT-116/DDP細(xì)胞中miR-210的表達(dá)顯著降低(F=64.54,P=0.00);與親本細(xì)胞HCT-116比較,順鉑耐藥細(xì)胞株HCT-116/DDP中miR-210的表達(dá)進(jìn)一步降低(t=4.102,P=0.000 8,圖1A)。利用miR-210 mimics、miR-210 inhibitor分別轉(zhuǎn)染HCT-116及HCT-116/DDP細(xì)胞后,CCK-8檢測發(fā)現(xiàn),與Control組比較,miR-210 mimics能夠顯著抑制HCT-116(t=5.379,P=0.0058)、HCT-116/DDP(t=7.685,P=0.0015)細(xì)胞活力,而inhibitor則上調(diào)細(xì)胞活力;進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),miR-210 mimics對HCT-116/DDP的抑制作用顯著高于HCT-116細(xì)胞(t=5.645,P=0.004 9,圖1B)。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),與Control組比較,miR-210 mimics能夠顯著促進(jìn)HCT-116(t=7.846,P=0.0014)、HCT-116/DDP(t=8.299,P=0.0012)細(xì)胞凋亡,而inhibitor則抑制細(xì)胞凋亡(圖1C)。以上結(jié)果提示miR-210抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡,miR-210對HCT-116/DDP的抑制作用更明顯。

A：RT-qPCR檢測不同細(xì)胞中miR-210的表達(dá);B：CCK8檢測miR-210對HCT-116和HCT-116/DDP細(xì)胞增殖的影響;C：流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-210對HCT-116和HCT-116/DDP細(xì)胞凋亡的影響。**：與對照組相比,差異顯著, P< 0.01。圖1 miR-210抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡

2.2 miR-210促進(jìn)HCT-116/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性 CCK-8分析發(fā)現(xiàn),與Control組比較,miR-210 mimics能抑制HCT-116/DDP細(xì)胞的活力(t=5.691,P=0.004 7),DDP與Control組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.416,P=0.073 1);與DDP組比較,DDP+mimics聯(lián)合組能夠顯著抑制細(xì)胞活力(t=7.969,P=0.001 3,圖2A)。細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn),與Control組比較,miR-210 mimics促進(jìn)HCT-116/DDP細(xì)胞凋亡(t=18.970,P=0.000),DDP與Control組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.847,P=0.138 4);與DDP組比較,DDP+mimics聯(lián)合組能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡(t=13.450,P=0.000 2,圖2B～C)。miR-210 inhibitor與mimics的作用相反。以上結(jié)果提示miR-210可能促進(jìn)HCT-116/DDP對順鉑的藥物敏感性。

2.3 miR-210調(diào)節(jié)HCT-116/DDP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與Control組比較,miR-210 mimics及DDP能夠顯著促進(jìn)Bad(t=5.913,P=0.0041;t=3.221,P=0.0323)、Cleaved Caspase-3(t=7.612,P=0.0016;t=3.063,P=0.0376)的表達(dá),抑制Bcl-2的表達(dá)(t=11.790,P=0.0003;t=3.540,P=0.024);與DDP相比,mimics+DDP組能夠進(jìn)一步促進(jìn)Bad(t=6.444,P=0.0030)、Cleaved Caspase-3(t=10.400,P=0.0005)的表達(dá),抑制Bcl-2(t=20.710,P=0.000)的表達(dá);miR-210 inhibitor則得到相反的結(jié)果(圖3)。

*：與對照組比較,P< 0.05;**：與對照組比較,P< 0.01;##：與DDP組比較,P<0.01。圖3 miR-210促進(jìn)HCT-116/DDP細(xì)胞的凋亡

2.4 miR-210調(diào)節(jié)HCT-116/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白表達(dá) Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與Control組比較,miR-210 mimics及DDP能夠顯著抑制p-gp(t=5.345,P=0.0059;t=7.54,P=0.0018)、MRP2(t=4.824,P=0.0085;t=7.504,P=0.0017)、ABCG2(t=4.842,P=0.0084;t=6.040,P=0.0038)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá);與DDP相比,mimics+DDP組能夠進(jìn)一步抑制p-gp(t=4.726,P=0.0091)、MRP2(t=15.66,P=0.000)、ABCG2(t=4.449,P=0.0013)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá);miR-210 inhibitor則得到相反的結(jié)果(圖4)。

2.5 miR-210抑制Wnt/β-Catenin通路的激活 與Control組比較,miR-210 mimics及DDP能夠顯著抑制Wnt3a(t=6.293,P=0.0033;t=7.157,P=0.0020)、β-Catenin(t=7.517,P=0.0017;t=13.240,P=0.0002)的表達(dá);與DDP相比,mimics+DDP組能夠進(jìn)一步抑制夠顯著抑制Wnt3a(t=5.827,P=0.0043)、β-Catenin(t=6.571,P=0.0028)的表達(dá);miR-210 inhibitor則得到相反的結(jié)果(圖5)。

**：與對照組比較,P< 0.01;##：與DDP組比較,P<0.01。圖5 miR-210抑制HCT-116/DDP細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路活化

3 討論

耐藥性是影響CRC預(yù)后以及復(fù)發(fā)的重要原因,嚴(yán)重影響患者的生存率,深入探討耐藥機(jī)制,提高化療藥物的治療效果,促進(jìn)CRC的治愈率均具有重要的意義[3,8]。目前耐藥機(jī)制主要牽涉腫瘤干細(xì)胞、藥物的吸收及外排、DNA損傷修復(fù)等多種渠道,其機(jī)制包括PI3K/AKT、MAPK、Wnt/β-Catenin通路等[9-10]。但是,人結(jié)直腸癌細(xì)胞對順鉑藥物的具體耐藥機(jī)制,目前還不十分明確。本研究主要是通過HCT-116/DDP株觀察miRNA-210與其耐藥性的關(guān)系及機(jī)制。

MicroRNAs (miRNAs)在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用,miRNA可以通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)、信號通路的激活/抑制等多種渠道來影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性[11]。miR-222及miR-519c能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-210在結(jié)直腸癌的細(xì)胞中顯著下調(diào),在順鉑耐藥細(xì)胞中,其表達(dá)量進(jìn)一步下調(diào),顯示miR-210可能參與其藥物敏感性的調(diào)節(jié)。利用miR-210 mimics轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn),miR-210能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,并且miR-210 mimics對HCT-116/DDP的抑制作用顯著高于HCT-116細(xì)胞。

化療藥物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療的重要機(jī)制之一[14]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-210mimics能夠顯著促進(jìn)促凋亡蛋白Bad、Cleaved-Caspase-3的表達(dá),而抑制抗調(diào)蛋白Bcl-2的表達(dá),同時(shí)miR-210 mimics能夠加強(qiáng)順鉑所引起的細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)改變。

腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性與細(xì)胞跨膜蛋白的表達(dá)水平密切相關(guān),此類蛋白質(zhì)可以直接抑制細(xì)胞內(nèi)化療藥物水平[15]。能量依賴型 ATP 結(jié)合盒式(ATP-binding cassette,ABC)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平,與腫瘤細(xì)胞多重耐藥(multidrug resistance,MDR)的發(fā)生關(guān)系密切。p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是最重要的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一,屬于ABCB 家族,由ABCB1(mdr1)基因編碼翻譯而來,并由2個(gè)同源部分組成。P-gp 在包括肝癌細(xì)胞在內(nèi)的各種 MDR細(xì)胞中的表達(dá)均顯著升高[16-17],過表達(dá)P-gp可降低常規(guī)化療藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度,進(jìn)而抑制其療效[18]。ABCG2 也是一種本構(gòu)性表達(dá)的 ATP 結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,被稱為乳腺癌耐藥蛋白(BCRP),是一種多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體[19]。沈曉紅等[20]研究發(fā)現(xiàn) ABCG2 表達(dá)水平與乳腺癌患者的耐藥性呈正相關(guān),與化療療效呈負(fù)相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn),多耐藥相關(guān)蛋白 2(Multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)也是重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本研究發(fā)現(xiàn),miR-210抑制P-gp、ABCG2及MRP2的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)HCT-116/DDP細(xì)胞對順鉑的藥物敏感性。

研究證明,Wnt/β-catenin 通路的異常激活與肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤的進(jìn)展關(guān)系密切[21]。最近研究顯示,β-catenin 在乳腺癌耐藥細(xì)胞株中被異常激活,并可通過調(diào)控 P-gp得表達(dá)促使乳腺癌細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)[22]。本研究發(fā)現(xiàn),在HCT-116/DDP耐藥株細(xì)胞中,Wnt3a和β-catenin的表達(dá)增加,但miR-210能夠抑制HCT-116/DDP耐藥株細(xì)胞中Wnt3a和β-catenin的表達(dá)。這些結(jié)果顯示miR-210調(diào)節(jié)HCT-116/DDP細(xì)胞對順鉑藥物敏感性可能與Wnt/β-catenin通路有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn),miR-210能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能是通過影響Wnt/β-catenin 通路來抑制耐藥相關(guān)蛋白(P-gp、ABCG2、MRP2)的表達(dá),最終促進(jìn)HCT-116/DDP耐藥細(xì)胞對順鉑的藥物敏感性,但具體的調(diào)控作用機(jī)制,還有待深入研究。并且,本研究通過DDP的結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥株觀察miRNA-210與耐藥性的關(guān)系及機(jī)制,為后續(xù)深入研究miR-210與順鉑類藥物敏感性的關(guān)系打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。