吳逸如,白 雨,張啟東,劉文虎

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 腎內(nèi)科, 北京 100050)

隨著人口老齡化及糖尿病、高血壓發(fā)病率的增加,慢性腎臟病(CKD)的患病率不斷上升[1]。當(dāng)CKD進(jìn)展至終末期腎臟病(ESRD)階段,患者的生存必須依賴腎臟替代治療[2],給患者的家庭和社會(huì)帶來巨大的負(fù)擔(dān)。如何延緩CKD進(jìn)展至ESRD是目前腎病領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問題。腎臟纖維化是所有CKD進(jìn)展至ESRD的共同病理生理機(jī)制[3],延緩腎臟纖維化對于延緩CKD的進(jìn)展至關(guān)重要,然而,目前臨床上無有效的抗腎臟纖維化藥物[4]。最近的研究表明,許多分子在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,其中糖原合成酶激酶(GSK-3β)是一個(gè)不可忽視的治療靶點(diǎn)。

GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在各種器官組織的纖維化中發(fā)揮重要作用,包括心臟、肺、肝臟和腎臟等[5]。然而目前關(guān)于GSK-3β與纖維化的研究結(jié)果并不完全一致[5]。本課題組前期研究證實(shí)了Renalase可以通過抑制ERK通路和氧化應(yīng)激等機(jī)制來減輕腎臟纖維化[6-7]。目前尚不清楚GSK-3β是否參與了這一過程。本研究擬探討GSK-3β在Renalase抗纖維化過程中的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 建立動(dòng)物模型

1.1.1 小鼠的選擇和喂養(yǎng) 5周齡雄性C57BL/6小鼠,體重16～18 g,購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(22 ± 1)°C, 相對濕度(55 ± 5)%的SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,自由進(jìn)食水。所有動(dòng)物喂養(yǎng)2周后進(jìn)行手術(shù)處理。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂死的執(zhí)行,均取得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的許可,并且完全符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》的要求,所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)均符合SPF及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)要求。

1.1.2 單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型的建立 小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉。單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)組于左側(cè)腎臟近腎門處結(jié)扎輸尿管,再于輸尿管遠(yuǎn)離腎門處做二次結(jié)扎。假手術(shù)(Sham)組只游離左側(cè)輸尿管而不結(jié)扎,然后關(guān)閉腹腔。

1.1.3 模型小鼠的給藥 購買的小鼠飼養(yǎng)2周后,隨機(jī)分為下列8組,每組5只并給予相應(yīng)處理,2周后將小鼠處死用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。具體分組及處理如下：(1)Sham+Ad-β-gal組：小鼠給予假手術(shù)處理,并于手術(shù)時(shí)于左側(cè)腎靜脈注射1.0×1010PFU對照腺病毒;(2)Sham+ Ad-Renalase組：小鼠給予假手術(shù)處理,并于手術(shù)時(shí)于左側(cè)腎靜脈注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒;(3)UUO+ Ad-b-gal組：小鼠給予單側(cè)輸尿管結(jié)扎處理,并于手術(shù)時(shí)于左側(cè)腎靜脈注射1.0×1010PFU對照腺病毒;(4)UUO+Ad-Renalase組：小鼠給予單側(cè)輸尿管結(jié)扎處理,并于手術(shù)時(shí)于左側(cè)腎靜脈注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒;(5)UUO+Ad-Renalase+AAV-GSK-3β組：本組小鼠手術(shù)前10 d通過尾靜脈注射1.0×1012PFU過表達(dá)GSK-3β腺相關(guān)病毒;小鼠給予單側(cè)輸尿管結(jié)扎處理,并于手術(shù)時(shí)于左側(cè)腎靜脈注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒;(6)UUO+Ad-Renalase+Ad-GSK-3β-RNAi組：小鼠給予單側(cè)輸尿管結(jié)扎處理,并于手術(shù)時(shí)于左側(cè)腎靜脈注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒及1.0×1010PFU Ad-GSK-3β-RNAi腺病毒;(7)UUO+Ad-Renalase+TM組：小鼠給予單側(cè)輸尿管結(jié)扎處理,并于手術(shù)時(shí)分別于左側(cè)腎靜脈注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒,于腹腔注射1mg/kg的TM;(8)UUO+Ad-Renalase+4-PBA組：小鼠給予單側(cè)輸尿管結(jié)扎處理,并于手術(shù)時(shí)分別于左側(cè)腎靜脈注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒,于腹腔注射300 mg/kg的4-PBA。以上所用腺病毒及腺相關(guān)病毒均購于上海吉?jiǎng)P基因有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1.2.1 腎臟纖維化的評(píng)估 將小鼠用乙醚麻醉后處死,取出手術(shù)側(cè)腎臟,固定、包埋、切片后用于實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Masson染色和天狼星紅染色評(píng)估腎臟纖維化程度。具體操作過程同標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案。染色切片使用配備數(shù)碼相機(jī)的顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.2 免疫組化染色 切片脫蠟至水,經(jīng)H2O2孵育、抗原修復(fù)、封閉后加入相應(yīng)一抗孵育過夜,沖洗孵育二抗,然后DAB顯色蘇木素復(fù)染,脫水透明,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。免疫組織化學(xué)定量使用Image-Pro Plus軟件。光密度(IOD) =密度(平均)×面積;密度是反應(yīng)陽性蛋白的濃度或強(qiáng)度。平均密度(MOD) = IOD/(SUM×面積)。

1.2.3 Westernblot 檢測 取手術(shù)側(cè)腎臟,液氮內(nèi)研磨,加入冰預(yù)冷的裂解液搖勻冰浴30 min,4 ℃ 12 000 r/min下離心30 min,取上清液,BCA法測定蛋白含量;加上樣緩沖液,95 ℃水浴5 min使蛋白變性,-80 ℃保存,備用做各目的蛋白的測定。具體操作方案同參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將小鼠處死后取手術(shù)側(cè)腎臟,在液氮內(nèi)研磨,參照Invitrogen公司的TRIzol試劑盒說明書,提取總RNA,再行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。具體測定同參考文獻(xiàn)[6]。引物如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 GSK-3β在Renalase抗纖維化過程的作用 首先,構(gòu)建單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)致腎臟纖維化模型并應(yīng)用腺病毒過表達(dá)Renalase觀察GSK-3β的變化以探索GSK-3β的可能作用。結(jié)果顯示,與Sham組相比,UUO組纖維組織增多,而與UUO+Ad-β-gal組相比,UUO+Ad-Renalase組腎臟纖維組織沉積明顯減少(圖1A);纖維化標(biāo)志物膠原纖維Ⅰ(Col-Ⅰ)和纖連蛋白(FN)表達(dá)明顯減少(圖1B、C),以上均證明Renalase可以減輕UUO所致腎臟纖維化,這與之前研究結(jié)果一致[6]。其次,檢測了GSK-3β的表達(dá),結(jié)果提示,Sham+Ad-β-gal及Sham+Ad-Renalase組GSK-3β的表達(dá)無明顯差異,提示上調(diào)Renalase本身并不影響GSK-3β的表達(dá);而同時(shí)與Sham+Ad-β-gal相比,UUO+Ad-β-gal組GSK-3β蛋白及mRNA表達(dá)均明顯增加(圖1D、E);與UUO+Ad-β-gal組相比,UUO+Ad-Renalase組GSK-3β表達(dá)明顯下降(圖1D、E),提示GSK-3β可能參與Renalase抗腎臟纖維化的過程。

A： Masson染色及天狼星紅染色提示Renalase可以改善腎臟纖維化,在Masson三色染色中,藍(lán)色代表纖維組織,在天狼星紅染色中,紅色代表纖維組織,放大倍數(shù)100倍;B、C：免疫組織化學(xué)和WB顯示UUO后纖連蛋白和膠原Ⅰ的表達(dá)增加,放大倍數(shù)100倍,棕色或黃色代表染色陽性;D、E：WB和RT-PCR顯示,UUO小鼠中GSK-3β表達(dá)增加,過表達(dá)Renalase后升高的GSK-3β明顯回落;*：與Sham+Ad-β-gal組比較,P<0.05;#：與UUO+Ad-β-gal組比較,P<0.05。圖1 Renalase在UUO小鼠中的作用及其對GSK-3β表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步闡明GSK-3β在Renalase抗腎臟纖維化過程中的作用,分別上調(diào)和下調(diào)GSK-3β觀察Renalase抗腎臟纖維化作用的變化。結(jié)果顯示,與UUO+Ad-Renalase組相比,UUO+Ad-Renalase+AAV-GSK-3β組GSK-3β表達(dá)明顯增加;UUO+Ad-Renalase+Ad-GSK-3β-RNAi組GSK-3β表達(dá)明顯下降(圖2A、B),提示上調(diào)和下調(diào)GSK-3β成功。與UUO+Ad-Renalase組相比,UUO+Ad-Renalase+AAV-GSK-3β組腎間質(zhì)纖維成分增加(圖2C),Col、FN表達(dá)明顯增多(圖2D、E),提示Renalase抗腎臟纖維化的作用幾乎被逆轉(zhuǎn)。同時(shí)與UUO+Ad-β-gal組相比,UUO+Ad-Renalase+Ad-GSK-3β-RNAi組腎臟纖維化明顯減輕(圖2C),Col-Ⅰ、FN表達(dá)下降(圖2D、E),說明抑制GSK-3β減輕了UUO小鼠的纖維化;但與UUO+Ad-Renalase組相比,UUO+Ad-Renalase+Ad-GSK-3β-RNAi組腎臟纖維化無明顯變化(圖2C),Col-Ⅰ、FN表達(dá)稍下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2D、E),說明與UUO+Ad-Renalase組相比,下調(diào)GSK-3β并不能進(jìn)一步改善腎臟纖維化,進(jìn)一步提示Renalase抗纖維化作用是通過抑制GSK-3β實(shí)現(xiàn)的,即Renalase通過抑制GSK-3β表達(dá)延緩腎臟纖維化進(jìn)展。

2.2 Renalase調(diào)控GSK-3β表達(dá)的可能機(jī)制 進(jìn)一步探索了Renalase調(diào)控GSK-3β表達(dá)的機(jī)制。既往有研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以調(diào)控GSK-3β的表達(dá),那么Renalase是否可以通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而抑制GSK-3β最終延緩腎臟纖維化,目前尚不清楚。首先觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Renalase抗腎臟纖維化中的作用,發(fā)現(xiàn)與Sham+Ad-Renalase組及Sham+Ad-β-gal組相比,UUO+Ad-β-gal組小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被明顯激活,表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物CHOP、PERK、ATF-4蛋白及mRNA水平表達(dá)顯著增加,而與UUO+Ad-β-gal組相比,UUO+Ad-Renalase組纖維化標(biāo)志物Col、FN表達(dá)降低的同時(shí)激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也被明顯抑制,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物蛋白及基因水平明顯下降,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展,而Renalase可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

通過改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與Renalase抗腎臟纖維化過程中對GSK-3β的調(diào)控。衣霉素(tunicamycin,TM)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑,可以通過抑制蛋白質(zhì)N-糖基化來誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;4-苯基丁酸鈉(4-phenylbutyric acid,4-PBA)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑,通過阻斷未折疊蛋白反應(yīng)的激活抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。與UUO+Ad-Renalase組相比,UUO+Ad-Renalase+TM組小鼠腎臟纖維化明顯加重,Col、FN顯著升高,同時(shí)觀察到GSK-3β表達(dá)明顯回升。與UUO+Ad-Renalase組相比,UUO+Ad-Renalase+4-PBA組小鼠纖維化沒有進(jìn)一步改善,同時(shí)GSK-3β表達(dá)也沒有進(jìn)一步被抑制(圖3A～ C),提示Renalase是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善腎臟纖維化,且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與Renalase抗腎臟纖維化及調(diào)控GSK-3β表達(dá)的作用。

A：Masson染色和天狼星紅染色提示,與UUO+Ad-Renalase組相比,當(dāng)應(yīng)用TM激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后UUO+Ad-Renalase+TM組纖維化明顯加重,而應(yīng)用4-PBA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后UUO+Ad-Renalase+4-PBA組纖維化沒有進(jìn)一步減輕;在Masson三色染色中,藍(lán)色代表纖維組織。在天狼星紅染色中,紅色代表纖維組織,放大倍數(shù)400倍;B、C：WB和RT-PCR顯示,與UUO+Ad-Renalase組相比,當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被激活時(shí),UUO+AdRenalase+TM組的Col-Ⅰ、FN、GSK-3β的表達(dá)增加;當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被抑制時(shí),UUO+Ad-Renalase+4-PBA組CoL-Ⅰ、FN、GSK-3β的表達(dá)沒有受到進(jìn)一步抑制;*：與Sham+Ad-β-gal組比較,P<0.05;#：與UUO+Ad-Renalase比較,P<0.05。圖3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Renalase抗腎纖維化中的作用及其對GSK-3β表達(dá)的影響

2.3 GSK-3β與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Renalase抗腎臟纖維化中的調(diào)控關(guān)系 進(jìn)一步探索在Renalase抗腎臟纖維化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及GSK-3β的調(diào)控關(guān)系。如上所述,當(dāng)上調(diào)GSK-3β表達(dá)后,Renalase抗腎臟纖維化的作用幾乎被逆轉(zhuǎn),但無論上調(diào)或下調(diào)GSK-3β,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激較UUO+Ad-Renalase組均無明顯變化(圖4A、B),即在Renalase抗UUO所致腎臟纖維化過程中,GSK-3β表達(dá)的改變不影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。

A、B：WB及RT-PCR顯示,不論過表達(dá)或敲低GSK-3β表達(dá),與UUO+Ad-Renalase相比內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表達(dá)均無明顯改變;*：與Sham+Ad-β-gal組比較,P<0.05;#：與UUO+Ad-Renalase比較,P<0.05。圖4 GSK-3β對Renalase抗纖維化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,即在Renalase抗纖維化過程中,激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使得GSK/3β表達(dá)增加,而上調(diào)或下調(diào)GSK-3β均不影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的狀態(tài),說明Renalase是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控GSK-3β表達(dá)進(jìn)而延緩腎臟纖維化。

3 討論

腎臟纖維化是慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展至終末期腎臟病(ESRD)的共同通路[8]。前期研究證實(shí)Renalase可以延緩腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展[6- 7]。本研究進(jìn)一步探索Renalase抗腎臟纖維化的機(jī)制。鑒于GSK-3β在纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用,探討GSK-3β在Renalase抗腎臟纖維化中的作用及可能的機(jī)制。UUO術(shù)后,隨著腎臟纖維化的進(jìn)展,GSK-3β表達(dá)明顯上調(diào);而當(dāng)過表達(dá)Renalase后,腎臟纖維化減輕的同時(shí)GSK-3β也明顯下調(diào)。當(dāng)上調(diào)GSK-3β后,Renalase拮抗腎纖維化的作用被抵消;提示Renalase通過抑制GSK-3β改善腎臟纖維化。既往研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以調(diào)控GSK-3β的表達(dá)[9],進(jìn)一步探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Renalase調(diào)控GSK-3β的作用。發(fā)現(xiàn)UUO術(shù)后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被激活,而過表達(dá)Renalase后腎臟纖維化減輕的同時(shí)激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被抑制,應(yīng)用TM激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,Renalase抗纖維化作用被減輕的同時(shí)上調(diào)的GSK-3β亦被明顯抑制,而不論上調(diào)或下調(diào)GSK-3β,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均無明顯變化。以上結(jié)果提示Renalase通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下調(diào)GSK-3β從而延緩腎臟纖維化進(jìn)展。

目前GSK-3β在器官纖維化中的研究結(jié)果并不一致。在肝臟、肺及心臟纖維化方面,一方面研究認(rèn)為激活GSK-3β可以改善纖維化[10-17],另一方面有學(xué)者證實(shí)抑制GSK-3β可以改善器官纖維化[11-12, 14-16, 18]。同樣的,目前GSK-3β在腎臟纖維化方面的研究也存在爭議。一部分研究認(rèn)為GSK-3β的激活可以改善腎臟纖維化,比如研究發(fā)現(xiàn)在UUO模型中,fingolimod可以通過激活GSK-3β抑制肌成纖維細(xì)胞生成及細(xì)胞外基質(zhì)合成減輕腎臟纖維化[19];敲除AKT[20]或SGK1[21]可以通過增加GSK-3β活性抑制UUO所致腎纖維化;鋰[22]、血管緊張素Ⅱ[23]及高循環(huán)卵泡刺激素(FSH)[24]可以通過抑制GSK-3β促進(jìn)腎臟纖維化。另一部分研究認(rèn)為抑制GSK-3β可以減輕腎臟纖維化。在小鼠腎臟缺血在灌注模型中,抑制GSK-3β可以減少肌成纖維細(xì)胞數(shù)量減輕腎臟纖維化[25-26],體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以促進(jìn)腎成纖維細(xì)胞中GSK-3β的表達(dá),抑制GSK-3β可以減輕TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化[25]。在糖尿病腎病大鼠模型中,LM49可以通過抑制GSK-3β的活性減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積減輕腎臟纖維化[27]。在葉酸所致AKI小鼠模型中,通過抑制GSK-3β的表達(dá)和活性,可以減少腎臟纖維化發(fā)生,抑制AKI向CKD發(fā)展[28-29]。本研究在動(dòng)物模型中證實(shí),腎臟纖維化時(shí)GSK-3β表達(dá)明顯增加;當(dāng)過表達(dá)Renalase后,纖維化減輕且GSK-3β表達(dá)減少,而上調(diào)GSK-3β表達(dá)后Renalase抗纖維化作用被抵消,提示Renalase通過抑制GSK-3β抑制腎臟纖維化。這與之前的研究結(jié)果也并不完全一致,然而,腎臟纖維的發(fā)生是諸多促纖維化因子與抗纖維化因子相互作用的動(dòng)態(tài)結(jié)果,究竟GSK-3β在腎臟纖維化中發(fā)揮怎樣的作用仍待進(jìn)一步研究探討。

當(dāng)然,本研究也有一定的局限性。首先,本研究發(fā)現(xiàn)Renalase通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下調(diào)GSK-3β進(jìn)而拮抗纖維化,而前期研究發(fā)現(xiàn)Renalase可以調(diào)控ERK的表達(dá)[6],且既往研究證實(shí)GSK-3β可以調(diào)控ERK促進(jìn)纖維化的發(fā)生[5];那么GSK-3β是否參與Renalase對ERK的調(diào)控仍待進(jìn)一步研究探討。其次,TGF-β/Smad信號(hào)通路在纖維化發(fā)生發(fā)展中意義重大[3],已證實(shí)GSK-3β參與TGF-β/Smad的調(diào)控[5],本研究發(fā)現(xiàn)Renalase通過抑制GSK-3β減輕纖維化進(jìn)展,但前期研究發(fā)現(xiàn)Renalase抗纖維化過程中Smad的表達(dá)并無明顯變化,也就是說盡管Renalase抑制了GSK-3β但并沒有出現(xiàn)Smad的改變,為什么會(huì)出現(xiàn)此現(xiàn)象,是否有其他信號(hào)通路參與其中仍待進(jìn)一步研究。最后,如上所述,腎臟纖維化的病因多種多樣[3],單側(cè)輸尿管結(jié)扎所致腎纖維化模型并不能代表所有纖維化發(fā)生的病理生理過程,在其他所致腎纖維化疾病中GSK-3β究竟扮演什么角色仍待進(jìn)一步探討。