徐超，胡文效*，陳明光，朱明宣，邱磊，趙先炎

（齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）/生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東濟南 250353）

葡萄酒的香氣物質按來源分為品種香、發(fā)酵香和陳釀香。葡萄酒香氣的香韻和香氣強度特征綜合反映著葡萄酒原料的品種特性、產(chǎn)地風土特點和葡萄酒發(fā)酵、陳釀方法及技術水平。其中，葡萄酒發(fā)酵環(huán)節(jié)是彰顯葡萄酒品種香、形成葡萄酒發(fā)酵香、影響葡萄酒陳釀香的關鍵環(huán)節(jié)。葡萄酒發(fā)酵本質是借助微生物將葡萄汁成分轉變?yōu)槠咸丫瞥煞值南盗猩锘瘜W反應，微生物（主要是酵母菌、乳酸菌）在發(fā)酵過程中的作用顯著影響葡萄酒的“表型”，操縱葡萄酒的風味、香氣和風格[1]?；谏鷳B(tài)多樣性、微生物物種多樣性和遺傳多樣性，以及高通量測序技術和氣相色譜-質譜聯(lián)用分析技術（GC-MS）的發(fā)展，葡萄酒發(fā)酵微生物群落組成及演替與葡萄酒香氣相關性[2-4]逐漸被揭示出來；基于酶調(diào)節(jié)作用和轉錄組、蛋白組表達結果，通過調(diào)控葡萄酒發(fā)酵微生物菌群或香氣化合物生物合成途徑關鍵酶合成與酶活性水平，使實現(xiàn)調(diào)控目標代謝物的代謝通量成為可能。

1 葡萄酒發(fā)酵與葡萄酒香氣的關系

葡萄向葡萄酒的轉化涉及真菌（酵母菌）、細菌（乳酸菌、醋酸菌）等多種微生物的協(xié)同作用，這些微生物形成了一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，它們的代謝活動獨立進行又相互作用，共同塑造了葡萄酒的風味風格。微生物代謝產(chǎn)生的高級醇、酸、酯類等構成葡萄酒發(fā)酵香的物質基礎，發(fā)酵過程中酶催化葡萄原料中的香氣前體物釋放出C13降異戊二烯類化合物、游離態(tài)的萜烯、硫醇類等物質，對于增強葡萄酒品種香氣和產(chǎn)區(qū)風味特色具有極其重要的意義。葡萄酒中被檢出的香氣物質有800余種[5]，這些香氣物質通過協(xié)同、加成或掩蓋等作用，形成了葡萄酒豐富而獨特的香韻結構，并決定了葡萄酒的風格特點。

1.1 葡萄酒發(fā)酵作用增強品種香

葡萄品種香氣物質主要包括萜烯類、降異戊二烯類、芳香族類、脂肪族類、甲氧基吡嗪類和揮發(fā)性含硫化合物等，這些化合物多以香氣前體物的形式存在于葡萄果實中，在發(fā)酵過程中香氣前體物在酶促（糖苷酶、酯酶、C-S裂解酶等）和非酶促作用（酸催化水解和化學重排）下，進一步轉化為揮發(fā)性化合物，香氣物質被釋放出來，對葡萄酒風味的感官感知有積極的促進作用[6]。

1.1.1 萜烯類香氣物質

萜烯是分子骨架以異戊二烯（C5單元）為基本結構單元的化合物及其衍生物，其分子式符合(C5H8)n通式，目前在釀酒葡萄果實中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了70多種萜烯類物質[7]，其中單萜是果實中含量最高、種類最為豐富的萜類物質，常見的單萜包括芳樟醇、香葉醇、香茅醇、橙花醇等。

葡萄漿果中萜烯類物質通過2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑合成[8]，主要存在于果皮中，且糖苷結合態(tài)萜烯的含量高于游離態(tài)。例如在葡萄牙不同產(chǎn)區(qū)的兩種白葡萄品種中，糖苷類香氣物質的結合態(tài)萜烯分別占總香氣物質的54%和67%[9]。葡萄果實中萜烯類物質的萜烯苷元主要是單萜醇、單萜二醇和單萜三醇[10]，而糖苷的主要形式是雙糖苷，占總糖苷的80%以上，雙糖苷類香氣前體物質的主要酶解方式如圖1所示[11]。

通常在葡萄酒發(fā)酵環(huán)境條件下，葡萄原料中的糖苷類化合物在糖苷酶作用下部分被水解[12-13]，但一般糖苷酶的最適條件是pH5.0～6.0、溫度40～50 ℃，在葡萄酒發(fā)酵實際環(huán)境（高糖、低pH、低溫、高乙醇）下糖苷酶活性受到抑制，導致其活性僅為最適條件下的10%左右[14]，因此，葡萄原料糖苷結合態(tài)香氣化合物的有效釋放成為葡萄酒發(fā)酵品種香調(diào)控的關注點之一。

1.1.2 降異戊二烯類

降異戊二烯類化合物是一類由類胡蘿卜素（四萜）如β-胡蘿卜素等降解產(chǎn)生的13個、11個、10個、9個碳原子的衍生物。目前有關葡萄與葡萄酒降異戊二烯化合物的研究多集中于C13類，C13降異戊二烯類化合物及其衍生物，如α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、β-大馬士酮、香葉基丙酮等，雖然這類化合物在葡萄果實中含量較低，但因其具有閾值低（如β-紫羅蘭酮閾值0.007 μg·kg-1[15]，β-大馬士酮閾值0.002 μg·kg-1[16]）、香氣活度（OAV）值較高的特點，對葡萄酒品種香氣具有重要貢獻。

類胡蘿卜素雙加氧裂解酶（Carotenoid cleavage dioxygenase，CCDs）是參與類胡蘿卜素裂解產(chǎn)生香氣化合物的主要酶，植物CCD亞基因家族中CCD1、CCD4與香氣物質的形成有關，在葡萄中發(fā)現(xiàn)并鑒定了3個參與類胡蘿卜素裂解并產(chǎn)生香氣化合物的基因VvCCD1、VvCCD4a和VvCCD4b[17]，近來才發(fā)現(xiàn)異戊二烯路徑的首個負調(diào)控因子VvWRKY70[18]。β-胡蘿卜素在CCD1和CCD4作用下能在9,10和9',10'雙鍵裂解產(chǎn)生α-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮等[19]。在葡萄酒釀造過程中，葡萄中類胡蘿卜素可以轉化為游離態(tài)β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮、葡萄螺烷、雷司令縮醛、三甲基二氫萘（TDN）等[12]，成為葡萄酒發(fā)酵品種香調(diào)控的又一關注點。

1.1.3 硫醇類

大部分揮發(fā)性硫化物對葡萄酒香氣產(chǎn)生消極影響，但部分硫醇如4-巰基-4-甲基戊烷-2-酮（4MMP）、3-巰基己醇（3MH）、3-巰基己醇乙酸酯（3MHA）等表現(xiàn)出生動的果香（番石榴、西番蓮），它們是由酵母分泌的C-S裂解酶催化，從半胱氨酸和谷胱甘肽結合的前體中釋放[20-21]，有研究表明，3MH可以通過釀酒酵母轉化為3MHA[22]。這些硫醇及其前體物質廣泛存在于白葡萄品種的葡萄酒中，如‘長相思’‘雷司令’‘灰比諾’‘霞多麗’等，其中4MMP在‘長相思’葡萄酒中含量一般每千升超過40納克，而3MHA和3MH每千升分別可達幾百納克和幾百到幾千納克[23-24]。有報道顯示，在發(fā)酵過程中只有很少部分的芳香硫醇被釋放出來[25-26]，也有研究表明，只有3.2%的胱硫醚類香氣前體物被裂解[27]，這可能與釀酒酵母中胱硫醚β-裂解酶的活性較低有關。

品種香氣還包括甲氧基吡嗪類、芳香族類和脂肪族如C6化合物等，其中甲氧基吡嗪是由氨基酸代謝中產(chǎn)生的含氮雜環(huán)物質，其較低的閾值賦予葡萄酒濃郁的青椒味。歐亞種釀酒葡萄及葡萄酒中其濃度約0.5～50 ng·L-1，強烈的青椒氣味往往被認為對葡萄酒香氣質量有消極影響。脂肪族C6化合物是由前體物質脂肪酸經(jīng)脂氧合酶（LOX）途徑逐步氧化、裂解、脫氫等作用生成，為葡萄酒帶來青草味及生青味[28]。

1.2 發(fā)酵作用合成發(fā)酵香

葡萄酒發(fā)酵香香氣化合物主要包括醇類、酯類和酸類化合物，屬于微生物次生代謝產(chǎn)物，其中，乙酯、乙酸酯、高級醇對發(fā)酵香貢獻較大，其代謝合成示意圖如圖2[29]。葡萄果皮自然攜帶酵母菌群，包括非釀酒酵母（non-Saccharomyces）和釀酒酵母（S.cerevisiae），并且非釀酒酵母占據(jù)種群優(yōu)勢（1×105～1×106cfu·mL-1），隨著發(fā)酵的進行，非釀酒酵母的優(yōu)勢地位很快被釀酒酵母取代。釀酒酵母發(fā)酵力強，可以耐受更高的SO2和酒精度，在酒精發(fā)酵中占據(jù)主導地位（1×106～1×108cfu·mL-1）[30]。釀酒酵母在酒精發(fā)酵階段可將葡萄糖轉化為酒精、CO2及其它副產(chǎn)物，其代謝活動對葡萄酒的風味和質量有著重要的影響[31]。

圖2 釀酒酵母中高級醇和酯的形成[29]Figure 2 Formation of higher alcohols and esters in Saccharomyces cerevisiae

1.2.1 醇類化合物的合成

葡萄酒中對香氣有影響的醇類物質包括脂肪族醇和芳香族醇兩大類，主要有正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇等[32]。文獻報道[33]中高級醇對葡萄酒香氣的貢獻觀點并不完全相同，有的傾向于負面影響，因為高級醇的感官屬性可能依賴于特定的環(huán)境，如在高級醇總濃度低于300 mg·L-1時，能對葡萄酒芳香特征作出積極貢獻，而在總濃度大于400 mg·L-1時，則會出現(xiàn)刺鼻和令人不快的氣味。de-la-Fuente-Blanco等[33]評估了4種常見的高級醇對模擬葡萄酒香氣的貢獻，結果表明，異丁醇和異戊醇對葡萄酒整體香氣強度有顯著的影響，能夠增強葡萄酒的香氣感知，而β-苯乙醇和甲硫基丙醇的添加對模擬酒的香氣特征基本沒有影響，盡管β-苯乙醇被多次報道為葡萄酒花香特征的潛在貢獻者。

高級醇的合成是由相應的中間體α-酮酸經(jīng)脫羧還原生成相應的醛，再經(jīng)進一步脫氫反應生成[34]。根據(jù)α-酮酸的來源，高級醇的形成分為氨基酸脫氨分解生成α-酮酸的分解代謝途徑（Ehrlich代謝途徑）和糖酵解、三羧酸循環(huán)生成α-酮酸的合成代謝途徑（Harris途徑），并且發(fā)酵液中75%的高級醇由Harris途徑產(chǎn)生，25%是由Ehrlich途徑產(chǎn)生[35]。

1.2.2 酯類化合物的合成

在葡萄酒中酯類化合物主要為乙酸酯和乙酯。乙酸酯類化合物主要包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸-2-苯乙酯等；乙酯類化合物主要為己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等。

乙酸酯合成的底物是乙酰輔酶A（Acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）和醇，乙酰輔酶A主要是通過丙酮酸的氧化脫羧形成，醇包括乙醇和來自氨基酸代謝產(chǎn)生的高級醇；乙醇或高級醇和乙酰輔酶A在醇乙酰基轉移酶（Alcohol acetyltransferase，AATase）的催化作用下生成相應的乙酸酯。釀酒酵母細胞中參與乙酸酯合成的醇乙?；D移酶有ATF1和ATF2。有研究證明ATF1對乙酸酯的生成量影響較大，可通過調(diào)控ATF1的表達來改變乙酸酯的生成量[36]。

中鏈脂肪酸乙酯（MCFAEE），如己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，是一組廣泛存在于葡萄酒、白蘭地、威士忌、朗姆酒等飲料酒中的重要香氣化合物，具有優(yōu)質的花果香和低閾值。MCFAEE是乙醇和中鏈脂肪酸（MCFA）在?；D移酶（Acyltransferase）的催化作用下生成。MCFA主要由酵母細胞通過細胞質中脂肪酸合成酶（FASs）復合體的作用釋放而來，?；D移酶主要有乙醇酰基轉移酶（Ethylester biosynthesis I，EEB1P）和乙醇己酰轉移酶（Ethanol hexanoyl transferase I，EHT1P），分別由EEB1和EHT1編碼。

1.3 發(fā)酵作用影響陳釀香

在葡萄酒陳釀過程中，既進行著葡萄酒與環(huán)境間的物質交換，同時還發(fā)生著氧化與還原、酯化與水解和縮聚等化學反應，使酯類、醇類、醛類、酮類和酸類等香氣物質達到新的平衡，通過陳釀可以促使葡萄酒色澤穩(wěn)定，口感更加圓潤[37]。

1.3.1 氧化、聚合反應

在葡萄酒陳釀過程中，葡萄酒中的單寧與其它多酚類物質發(fā)生微氧化和聚合反應[38]。單寧及游離花色素苷與乙醛發(fā)生聚合反應形成花色素苷-乙醛-單寧聚合物等不同芳香物質，有利于顏色穩(wěn)定，從而改善了葡萄酒品質[39]。

1.3.2 橡木香氣物質的溶解與擴散

與橡木相關的芳香化合物如香草醛、丁子香酚、愈創(chuàng)木酚等200余種香氣物質選擇性的在陳釀過程中轉移到葡萄酒中去[40-41]，增加了葡萄酒香氣復雜性。

1.3.3 酯類的水解與合成反應

葡萄酒陳釀階段，酯類物質與酸類物質之間的平衡對葡萄酒的感官品質影響最大，由發(fā)酵產(chǎn)生的酯在低pH環(huán)境下不斷水解，結合態(tài)的萜烯類化合物被水解釋放且發(fā)生分子間重排并互相轉化，合成C13降異戊二烯類化合物的前體物類胡蘿卜素也在不斷地降解，同時，葡萄酒中的酸類和乙醇也會緩慢生成相應的酯。

陳釀過程中，酯類的構成和比例會發(fā)生改變，直鏈脂肪酸乙酯如己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等因揮發(fā)性強，含量會逐漸降低；支鏈脂肪酸乙酯如琥珀酸乙酯、乳酸乙酯等因揮發(fā)性相對較差，以及陳釀期間達到新的酸酯平衡，含量會上升。對瓶儲1～5年的葡萄酒中乙酯含量變化的研究發(fā)現(xiàn)，酸酯平衡對乙酯的形成影響較大，且隨著陳釀時間的延長，酯化率明顯提高，在陳釀過程中，葡萄酒中支鏈脂肪酸乙酯（如異丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和異戊酸乙酯）的含量增加；一部分萜烯類化合物在陳釀過程中也會發(fā)生改變，香葉醇和橙花醇可以緩慢地轉化成芳樟醇和α-萜品醇，橙花叔醇能轉化為法尼醇[42]；C13降異戊二烯類化合物如β-大馬士酮和TDN的含量會隨著陳釀時間的延長而上升[43]，也有研究發(fā)現(xiàn)在陳釀早期β-大馬士酮和3-氧代-α-紫羅蘭酮的含量會上升，隨著陳釀時間的延長而降低[44]。由此可見，葡萄酒在陳釀過程中也發(fā)生著十分復雜的反應，由發(fā)酵作用產(chǎn)生的醇、酯等，以及發(fā)酵過程中新形成的萜烯和C13降異戊二烯類化合物會影響陳釀香的香氣組分和比例。

2 葡萄酒發(fā)酵香氣物質調(diào)控

2.1 葡萄酒品種香香氣物質釋放調(diào)控

2.1.1 葡萄酒酒精發(fā)酵前處理

葡萄酒酒精發(fā)酵前處理如凍融、遲采、晾曬、浸漬等，會導致發(fā)酵基質的濃度發(fā)生變化，或致使葡萄內(nèi)源酶促反應劇烈，或者產(chǎn)生對葡萄細胞活體風味物質代謝的更大刺激，以及增強非釀酒酵母等微生物的作用，從而影響葡萄酒品種香的香氣化合物組分與濃度。

（1）凍融。凍融會加速葡萄漿果細胞膜系統(tǒng)結構的破壞，葡萄內(nèi)源酶與底物結合從而發(fā)生各種復雜反應[45]，并且在冷凍過程中，脫水脅迫會誘導揮發(fā)性化合物合成相關基因（如LOX、ADH、CCD）的轉錄變化[46-47]。在冰酒的釀造過程中，葡萄果實經(jīng)過凍融和脫水，釀造的冰酒中揮發(fā)性酚、內(nèi)酯、β-大馬士酮和苯乙醛的含量比干型葡萄酒更高[48]。

（2）遲采、晾曬。遲采和晾曬會導致漿果脫水，使葡萄總可溶性固形物的濃度和總酸度增大。延遲采收的果實所釀造的葡萄酒中，中鏈脂肪酸和乙酸酯含量變低，而γ-壬內(nèi)酯和β-大馬士酮的含量變得更高[49]；葡萄采后經(jīng)脫水處理，利用質量損失率20%和30%的果實釀造葡萄酒，部分揮發(fā)性化合物種類減少，但大馬士酮、橙花醇和1-己醇等化合物的含量有所提高[50]；在室內(nèi)自然通風脫水7、14、21 d的‘美樂’果實（質量相應損失10%、20%和27%），其萜烯如α-松油醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮和芳樟醇的濃度增加，這可能是由于脫水促進了葡萄中真菌的生長，使得糖苷態(tài)香氣前體充分釋放[51]。

（3）浸漬。葡萄果實中香氣物質主要位于果皮中，發(fā)酵過程中浸漬處理利于果皮中香氣物質的浸出。浸漬方式按溫度不同分為3種：熱浸漬、常溫浸漬和冷浸漬，其中冷浸漬更有利于萜烯類物質的釋放。低溫處理（4、10 ℃）葡萄樣品后進行發(fā)酵，使葡萄酒中倍半萜烯普遍增加，推測低溫誘導了萜類生物合成的關鍵基因（VvHDR、VvDX3、VvTER、VvGT14）的表達[52]；在一定范圍內(nèi)，葡萄酒中萜烯類含量的增加與浸漬時間成正比，在14 ℃下浸漬24 h后萜烯含量最高[53]。近幾年衍生出一些新的浸漬工藝來替代傳統(tǒng)方法以提高香氣，常用的浸漬新技術有CO2浸漬法[54]、脈沖電場[55]、閃蒸法[56]和干縮法[57]，均能顯著提升葡萄酒的品質。

2.1.2 接種微生物調(diào)控

品種香香氣化合物的種類、含量和組成比例受葡萄品種、生態(tài)環(huán)境、栽培模式和果實成熟度等因素的影響。目前在葡萄酒實際生產(chǎn)中，常利用非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵以及乳酸菌（酒酒球菌、植物乳桿菌等）與釀酒酵母混合發(fā)酵來調(diào)控萜烯類香氣物質的含量；而果實中降異戊二烯類化合物的合成在轉錄水平上受前體物質類胡蘿卜素含量和CCD家族基因表達量的調(diào)控，此類物質的調(diào)控研究主要集中在產(chǎn)CCDs相關微生物資源的挖掘方面。

（1）釀酒酵母。根據(jù)最新的分類方法，釀酒酵母屬有23個種，葡萄酒釀造中常見的釀酒酵母有5個種：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、貝酵母（Saccharomyces bayanus）、原葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）、巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus）和奇異釀酒酵母（Saccharomyces paradoxus）。大部分釀酒酵母本身并不具有內(nèi)源糖苷酶，僅有少量釀酒酵母能夠表現(xiàn)出糖苷酶活性，從而增加葡萄酒中萜烯含量[58]。提高釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中對極端脅迫的抵抗力，對于有效調(diào)節(jié)和改善香氣化合物的產(chǎn)生至關重要[59]。

（2）非釀酒酵母。非釀酒酵母（non-Saccharomyces）可以通過代謝產(chǎn)生糖苷酶和C-S裂解酶，能夠增加葡萄酒中萜烯類、降異戊二烯類、揮發(fā)性硫醇等化合物，提高香氣成分種類和含量，增強葡萄酒的品種香氣和發(fā)酵香氣特征，并且在酒精發(fā)酵后期非釀酒酵母可以通過細胞自溶增加氨基酸、脂肪酸、甘露糖蛋白的含量進而影響葡萄酒的口感[60-61]。目前，從葡萄汁中分離出來的非釀酒酵母已超過40種，常見的非釀酒酵母屬主要包括有孢圓酵母屬（Torulaspora）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、假絲酵母屬（Candida）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、美奇酵母屬（Metschnikowia）、類酵母屬（Saccharomycodes）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）等。由于一般非釀酒酵母的酒精耐受能力較差，酒精轉化效率較低，生產(chǎn)上常與釀酒酵母混合（同時接種和順序接種）發(fā)酵來生產(chǎn)干型葡萄酒[61]。

Whitener等[62]使用‘西拉’和‘長相思’葡萄順序接種非釀酒酵母與釀酒酵母，結果發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母假絲酵母菌、哈薩克斯坦酵母、耐熱克魯維酵母、美極梅奇酵母、戴爾有孢圓酵母、克魯維畢赤酵母均能對整體香氣有不同程度的貢獻，美極梅奇酵母、假絲酵母等對葡萄酒發(fā)酵游離萜烯和酯類合成貢獻最為突出。由此可見，不同非釀酒酵母對葡萄酒風味的影響存在明顯差異。周洪江等[63]使用3種非釀酒酵母分別與釀酒酵母混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)美極梅奇酵母（M.pulcherrima Flavia）使芳樟醇釋放量信號強度增加1.33倍，戴爾有孢圓酵母（T.delbrueckii Prelude）使α-松油烯的信號強度增加1.47倍。申靜云等[64]選用非釀酒酵母仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）分別與商業(yè)釀酒酵母DV10混合發(fā)酵，結果發(fā)現(xiàn)，H.opuntiae與DV10同時接種混合發(fā)酵增加了冰葡萄酒中21.40%的萜烯類物質；鐵紅假絲酵母（Candida pulcherrima）與本土釀酒酵母MMf9混合發(fā)酵，增加了α-松油醇、橙花醇、香葉醇的含量[65]；Barbosa等[66]對葡萄牙葡萄酒產(chǎn)區(qū)美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）進行分離，發(fā)現(xiàn)該酵母具有較高的β-葡萄糖苷酶活性。

Hu等[67]通過對菌株的篩選發(fā)現(xiàn)，葡萄汁有孢漢遜酵母菌株的糖苷酶提取物能夠催化糖苷態(tài)C13降異戊二烯類化合物的釋放，增強了花香、甜味、漿果和堅果的香氣特征。尤雅等[68]采用不同接種方式在兩個溫度（13、23 ℃）下進行扁平云假絲酵母（Candida humilis）與釀酒酵母的發(fā)酵，結果發(fā)現(xiàn)，13 ℃時混合發(fā)酵顯著提高了β-大馬士酮含量，其中同時接種發(fā)酵增加了26.19%。類似地，與單純的釀酒酵母發(fā)酵相比，使用仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）與商業(yè)釀酒酵母DV10混合發(fā)酵使冰酒中β-大馬士酮含量提高8.85%[64]。

（3）乳酸菌。乳酸菌除了分泌蘋果酸脫氫酶外，還產(chǎn)生多種胞外酶，如β-葡萄糖苷酶、酯酶、氨基酸脫羧酶、檸檬酸裂解酶、酚酸脫羧酶等[69]，從而增加葡萄酒中萜烯類、硫醇類等物質的含量。葡萄酒啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵有利于形成柔和的酸度，促進花果香氣的釋放，提高葡萄酒香氣的復雜性。與酵母菌相似，不同屬、種的乳酸菌對葡萄酒風味的貢獻也有明顯的差異，其中酒球菌屬（Oenococcus）中的酒酒球菌（O.oeni）和乳植桿菌屬（Lactiplantibacillus）的植物乳桿菌（L.plantarum）廣泛應用于葡萄酒生產(chǎn)過程中[70]。

近些年來，植物乳桿菌憑借其高產(chǎn)酯酶、糖苷酶的潛力，作為酒酒球菌的替代者用于啟動葡萄酒的蘋果酸-乳酸發(fā)酵，在葡萄酒香氣、顏色等特征的改變中起重要作用[71]。Iorizzo等[72]從葡萄酒中分離出11株植物乳桿菌，發(fā)現(xiàn)所有菌株在葡萄酒工業(yè)化生產(chǎn)條件下均表現(xiàn)出較強的蘋果酸-乳酸發(fā)酵性能和β-葡萄糖苷酶活性，能夠釋放出檸檬烯、里哪醇等萜烯苷元。Wang等[73]以植物乳桿菌和酒酒球菌為原料，對‘赤霞珠’葡萄進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，結果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能夠保留更多的香氣成分，表明植物乳桿菌可以作為較好的發(fā)酵劑運用于紅葡萄酒生產(chǎn)中。葡萄酒中的酚類物質對乳酸菌的生長有抑制作用，Devi[74]的研究結果發(fā)現(xiàn)，酒酒球菌對酚脅迫的耐受性優(yōu)于植物乳桿菌，但植物乳桿菌具有更多功能的酚類解毒酶系統(tǒng)，可以使酚類化合物降解為揮發(fā)性酚、芳香醇和苯基丙酸。

（4）其它。魏濤等[75]從紅茶中得到一株高效降解β-胡蘿卜素菌株腸桿菌（HC-3），該菌株對β-胡蘿卜素的降解率達86.82%，主要降解產(chǎn)物為5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和反式-β-紫羅蘭酮等香味物質。龍章德等[76]從煙葉中篩選出能高效降解β-胡蘿卜素的菌株霍氏腸桿菌亞種（Enterobacter hormanii subsp.），用氣相色譜質譜聯(lián)用技術（GCMS）進行檢測發(fā)現(xiàn)，其降解的主要產(chǎn)物為β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-環(huán)檸檬醛等香味物質。楊小雪等[77]從鐵觀音茶葉中篩選到了3株具有β-胡蘿卜素降解能力的菌株Aspergillus niger、Bacillus velezensis、Saccharopolyspora gregorii，它們的降解率分別為94.54%、72.97%、61.26%，能產(chǎn)生β-紫羅蘭酮等香氣物質。

2.2 葡萄酒發(fā)酵香生物合成調(diào)控

葡萄酒發(fā)酵香氣化合物由菌株特性與葡萄汁特性決定，受發(fā)酵環(huán)境因子（溫度、pH、氧濃度、營養(yǎng)素）調(diào)控。葡萄酒發(fā)酵過程中，酵母菌受不斷變化的環(huán)境條件影響，誘導了2000多個基因的表達，涉及數(shù)百個基因編碼蛋白質參與各種細胞過程[78]。

2.2.1 醇類化合物合成調(diào)控

高級醇的生成量受多重因素調(diào)控，酵母發(fā)酵副產(chǎn)物形成的主要因素有酵母菌株、發(fā)酵工藝和果汁類型等[79-80]。

（1）酵母菌株及接種量。不同的釀酒酵母產(chǎn)高級醇的能力不同，有研究發(fā)現(xiàn)，采用12株不同的釀酒酵母發(fā)酵相同葡萄，所產(chǎn)生的高級醇含量顯著不同[81]，其中國產(chǎn)酵母CC17有更高的感官評價，這種差異主要取決于酵母細胞高級醇脫氫酶（ADH）的活力。在葡萄發(fā)酵過程中，酵母的接種量對高級醇的生成有很大的影響，接種量低時，酵母的繁殖倍數(shù)會相應增大，高級醇的含量則會升高。宋含等[82]發(fā)現(xiàn)，酵母的增值倍數(shù)控制在3～4以內(nèi)為宜，可以減少高級醇的生成量。

（2）發(fā)酵溫度。發(fā)酵溫度影響釀酒酵母生長速率和生物量，能夠調(diào)整釀酒酵母次生代謝產(chǎn)物通量。研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵溫度的升高（10、15、20 ℃），異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量逐漸升高[83]。

（3）發(fā)酵醪pH。pH也能影響釀酒酵母生長速率和生物量。在葡萄酒發(fā)酵過程中，高級醇的生成量與發(fā)酵液pH具有相關性，pH越低時高級醇的含量也相應減少。當葡萄酒醪液pH控制在3.6以下時，高級醇的生成量最低[84]。

（4）葡萄醪液可同化氮（YAN）。氮素是影響微生物生長的常見因素，YAN的種類及比例影響釀酒酵母生長代謝及發(fā)酵產(chǎn)物含量。適宜的α-氨基氮含量會使高級醇生成量保持較低的水平，當α-氨基氮含量過低時，酵母為滿足自身生長所需會不斷的通過糖代謝合成氨基酸，進而形成更多的中間體α-酮酸，當α-氨基氮含量過高時，酵母增殖倍數(shù)加大，從而導致代謝副產(chǎn)物增多；Liu等[85]發(fā)現(xiàn)，不同YAN能改變高級醇合成相關基因的表達，當NH4Cl添加量為200 mg·L-1時，總高級醇含量減少了39%，且對高級醇含量的控制更有效，因此在葡萄酒生產(chǎn)中根據(jù)實際情況考慮添加YAN。

（5）葡萄醪液糖濃度。低濃度的糖會使高級醇前體物質α-酮酸產(chǎn)生減少，對高級醇的脫氨基作用也不強烈，因此葡萄酒發(fā)酵可以采取分批補糖的方式來控制高級醇的生成量[80]。

2.2.2 酯類化合物合成調(diào)控

酯的產(chǎn)生受底物和酶活性的影響。對于乙酸酯的形成，乙酰輔酶A和高級醇的濃度是重要限制因素。有研究表明，乙酰輔酶A的通量受溫度、脂肪酸、氮源和氧的影響，這些因素在促進酵母生長的同時也能促進乙酰輔酶A的利用，使較少的乙酰輔酶A用于酯的生產(chǎn)；另外，可利用基因工程、蛋白質工程過表達ATF1或敲除競爭抑制途徑的相關基因，提高乙酸酯的含量[86-87]。

中鏈脂肪酸的存在形式是影響乙酯類化合物含量的主要因素，通過對脂肪酸從頭合成關鍵基因（ACC1、FAS1、硫酯酶編碼基因）的強化可達到提高MCFAEE生成量的目的，這些基因的表達量與酵母細胞數(shù)量相關，同樣受溫度、脂肪酸、氮源和氧的調(diào)控[88-89]。所以通過調(diào)控葡萄發(fā)酵過程中釀酒酵母生物量、比生長率和時序壽命，可以實現(xiàn)調(diào)控脂肪酸合成水平進而提高乙酯含量的目的。

（1）發(fā)酵溫度。發(fā)酵溫度通過影響酵母生長速率和生物量從而顯著影響脂質代謝，在13 ℃和25 ℃發(fā)酵條件下，轉錄組分析發(fā)現(xiàn)釀酒酵母顯著差異表達的535個基因中，在25 ℃時與胞質脂肪酸合成有關的幾個基因下調(diào)；而在13 ℃時與線粒體短鏈脂肪酸合成有關的基因上調(diào)，更有利于乙酯的積累。Schwinn等[90]研究了‘雷司令’發(fā)酵過程中3個不同溫度下對酵母生長、揮發(fā)物等的影響，結果顯示，大多數(shù)酯的形成在較高溫度下的發(fā)酵后半段更為明顯，在19 ℃發(fā)酵時，癸酸乙酯、辛酸乙酯和己酸乙酯的終濃度最大。所以，溫度可以通過影響脂肪酸合成途徑相關基因的表達來影響MCFAEE產(chǎn)量。

（2）脂肪酸。不飽和脂肪酸（UFAs）是釀酒酵母生長繁殖的必需營養(yǎng)物質，在發(fā)酵過程中，釀酒酵母主要從葡萄汁中獲得UFAs[91]。在發(fā)酵培養(yǎng)基脂質組成（葡萄汁與合成葡萄汁）對酒中揮發(fā)性成分影響的研究中發(fā)現(xiàn)，兩者完成發(fā)酵的時間分別為14、25 d，葡萄汁更快完成發(fā)酵且積累的揮發(fā)性化合物濃度更高，其辛酸乙酯的含量是合成葡萄汁發(fā)酵的兩倍[92]。這與合成葡萄汁中缺乏UFAs等生長因子、厭氧條件下限制了酵母菌生長有關。同時，在發(fā)酵過程中添加外源中鏈脂肪酸（如己酸、辛酸）也能顯著提高乙酯類化合物的含量[93]。

（3）氮源。在發(fā)酵過程中，低氮脅迫下酯類的總量降低，在500 mg·L-1以內(nèi)，酯類生成量與葡萄汁可同化氮水平成正比[94]。當向初始YAN為250 mg·L-1的葡萄汁中添加磷酸氫二銨（DAP）時，脂肪酸乙酯的含量升高，乙酸酯含量卻無顯著差異，表明氮的利用也具有菌株特異性[95]。

（4）氧氣。氧氣是葡萄酒發(fā)酵過程中十分重要的因素，葡萄酒發(fā)酵并非絕對厭氧發(fā)酵，酵母菌脂肪酸代謝是在有氧條件下進行的，微量氧氣可以促進酵母菌次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)量。Snoek等[96]分別在需氧和厭氧條件下培養(yǎng)酵母菌，轉錄組分析表明，在500多個差異代謝基因中只有23個是厭氧菌生長所特有的，這23個基因影響著酵母菌在缺氧條件下的存活，其關鍵作用機制還需進一步探索。

酯類物質作為酵母的次生代謝產(chǎn)物，其代謝還受葡萄品種與成熟度[97-99]、發(fā)酵方式、酵母菌種、陳釀方式等[100-102]的調(diào)控，而針對這些調(diào)控，前人已作了詳細的論述[103-104]。近幾年來幾項關于氧化還原電位（ORP）的研究證明，ORP有潛力作為一個新的觀測量實現(xiàn)香氣物質的監(jiān)測與調(diào)控。Xue等[105]揭示了在葡萄酒發(fā)酵過程中ORP與MCFAEE生成量的關系；Nelson等[106]在對小規(guī)模（10 L）、中規(guī)模（1500 L）和大規(guī)模（10 000 L）葡萄酒發(fā)酵過程中ORP的控制進行了演示，將ORP控制在-40 mV，可實現(xiàn)對發(fā)酵過程中香氣化合物的調(diào)控；在葡萄酒發(fā)酵過程中利用ORP作為曝氣定時開關，最終實現(xiàn)了對酯類物質生成量的控制[107]。葡萄汁ORP反應了溶氧量、溫度、pH、基質組分特性與濃度的關系，通過調(diào)控ORP可以影響細胞內(nèi)NAD(P)/NAD(P)H平衡和MCFAEE代謝相關關鍵基因的表達，從而影響釀酒酵母碳通量分布。這為實現(xiàn)在線實時監(jiān)測調(diào)控酯類化合物的合成提供了新的思路。

綜上，葡萄酒發(fā)酵過程中采用適度低溫、適當溶氧和控制葡萄汁脂質、適量可同化氮，提高細胞群體峰高和細胞時序壽命，降低細胞比生長率，可以達到提高酯類物質產(chǎn)量的目的。

2.3 葡萄酒發(fā)酵過程中香氣物質轉移的控制

葡萄酒發(fā)酵過程中，醪液香氣化合物的濃度取決于葡萄原料和微生物代謝通量，還會隨CO2的排出而發(fā)生揮發(fā)損失。發(fā)酵溫度對香氣揮發(fā)損失的影響比對香氣合成產(chǎn)生的影響更為顯著。在30 ℃發(fā)酵時，己酸乙酯的損失高達70%[108]。因此，有釀酒師在低溫條件下（8～12 ℃）進行發(fā)酵以減少香氣損失來改善葡萄酒的香氣特征[29]，但引發(fā)了發(fā)酵周期增長、發(fā)酵不徹底的現(xiàn)象。在發(fā)酵過程中的氣液傳遞方面已有大量研究，也有多種技術用來減少芳香損失，但其中一些可能會對發(fā)酵動力學產(chǎn)生負面影響，如能量消耗過大而增加了生產(chǎn)成本，或增加停滯發(fā)酵的風險[109]。Breniaux等[110]發(fā)現(xiàn)，在葡萄酒發(fā)酵過程中利用膜接觸器進行氣液傳遞，可以溶解CO2并能去除O2，從而提升葡萄酒的質量；Diban等[111]基于膜分離技術提出一種蒸發(fā)滲透萃取技術，可以明顯減少芳香化合物的損失；然而目前來看，降低溫度是最大限度減少香氣損失的有效方法，探尋更為有效地控制葡萄酒發(fā)酵過程中香氣物質轉移的方法將會是一個熱點。

3 總結與展望

葡萄酒香氣物質組成和來源非常復雜，香氣質量受多種因素影響。以葡萄香氣糖苷、類胡蘿卜素等香氣前體物水解、裂解為靶標的生物催化資源（非釀酒酵母、乳酸菌等）的挖掘與催化機制、催化技術研究；以特征發(fā)酵香香氣化合物定向合成為目的的調(diào)控技術研究；以提高葡萄酒產(chǎn)品整體質量和開發(fā)新產(chǎn)品為目的的葡萄酒酒精發(fā)酵前處理原理、方法、技術研究；以降低葡萄酒發(fā)酵過程中香氣損失為目的的方法、技術研究等，是當前葡萄酒香氣發(fā)酵調(diào)控研究的重點。葡萄酒發(fā)酵合成生物研究或成為未來的研究熱點，合成生物有望成為葡萄酒香氣調(diào)控的有效工具。