陳云喜,藍(lán)雪雯,陳寶如,陸新范,崔學(xué)宇@

(1.南寧師范大學(xué) 北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;廣西地標(biāo)作物大數(shù)據(jù)工程技術(shù)研究中心;廣西地表過(guò)程與智能模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530100;2.廣西華米現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,廣西 南寧 530001)

茉莉花[Jasminumsambac(L.)Aiton]是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的常綠矮灌木[1],在我國(guó)主要種植于廣西、福建、四川等省(區(qū))[2]。如何提高茉莉花的產(chǎn)量和品質(zhì)是茉莉花研究的核心問(wèn)題,合理的施肥是解決這一問(wèn)題的重要手段[3-4]。海藻生物肥料包含大量的植物所需營(yíng)養(yǎng)元素及有效活性成分,在多種植物中的栽培中用于品質(zhì)和產(chǎn)量的改良[5-6]。在草莓和火龍果中的研究中表明,合理的利用海藻生物肥對(duì)果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分的含量和產(chǎn)量有顯著的促進(jìn)作用[7-8]。在甜櫻桃中的研究表明,海藻提取液可以改良甜櫻桃的生長(zhǎng)狀態(tài)以及改善果實(shí)的品質(zhì)[5]。在煙草中的研究表明,海藻肥在提高煙草品質(zhì)的同時(shí)對(duì)煙草青枯病的防御有積極的效果[9]。在番茄中的研究中發(fā)現(xiàn),海藻肥的噴施可以增加番茄的鮮重,促進(jìn)光合,同時(shí)可以提高番茄的營(yíng)養(yǎng)成分[10]。此外,海藻肥料對(duì)植物非生物脅迫的抗性的提高有積極的影響[11-13]。海藻肥的施用效果已在多種植物進(jìn)行了研究,但是否影響茉莉花的產(chǎn)量和品質(zhì)尚未見(jiàn)報(bào)道。這里探討的是海藻肥對(duì)茉莉花生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響,同時(shí)利用GC-MS的方法對(duì)茉莉花揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行了測(cè)定,還進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,用以明確海藻肥對(duì)茉莉花產(chǎn)量、品質(zhì)的影響及其可能的分子機(jī)制,為海藻肥在茉莉花栽培的田間應(yīng)用提供理論及實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用茉莉花品種為橫州市主栽品種雙瓣茉莉花,茉莉花種植年限為3年,長(zhǎng)勢(shì)均勻,栽培土壤是赤紅壤。試驗(yàn)所需海藻肥廣州埃瑞卡生物科技有限公司提供。

在茉莉花剪枝后進(jìn)行第一次施肥處理,15日后進(jìn)行第2次施肥處理(2021年6月3日第一次處理),7月3日進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)采集和田間取樣。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理,分別為對(duì)照、海藻肥、高磷復(fù)合海藻肥,處理小區(qū)行長(zhǎng)11m,行寬1m,每個(gè)處理3次重復(fù)。

葉綠素測(cè)定儀為山東普創(chuàng)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 生理指標(biāo)測(cè)定

葉片厚度測(cè)量(10片):選取10片形態(tài)大小相似的茉莉花成熟葉片,利用游標(biāo)卡尺測(cè)量10片葉片的整體厚度,每個(gè)處理3次重復(fù)。

葉綠素含量測(cè)定:選取形態(tài)大小相似的茉莉花成熟葉片,利用手持葉綠素測(cè)定儀進(jìn)行葉綠素含量測(cè)定,每個(gè)處理3次重復(fù)。

花枝重量測(cè)定(10枝):花芽下剪取5 cm花枝,10枝總重為一組,稱(chēng)取重量,每個(gè)處理3次重復(fù)。

花枝莖粗測(cè)定:花芽下剪取5 cm花枝,利用游標(biāo)卡尺測(cè)定其莖粗,每個(gè)處理3次重復(fù)。

百蕾鮮重測(cè)定:測(cè)定百蕾鮮重(含苞待放、花筒伸長(zhǎng)、外觀飽滿(mǎn)),每個(gè)處理3次重復(fù)。

總產(chǎn)量測(cè)定:每個(gè)處理選擇2 m2的小區(qū),對(duì)花蕾進(jìn)行采摘,連續(xù)采摘2日,計(jì)算總產(chǎn)量,每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序/揮發(fā)性代謝物測(cè)試

表1 實(shí)時(shí)定量 PCR 引物序列

采集將要開(kāi)放的新鮮花蕾和葉片,液氮速凍,干冰郵寄至武漢邁特維爾生物科技有限公司完成測(cè)試。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)試

結(jié)合田間生理數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組表達(dá)結(jié)果,挑選9個(gè)光合相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物,在葉片中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析,分析選取Actin基因作為內(nèi)參,測(cè)試委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻肥處理對(duì)茉莉花生理指標(biāo)的影響

不同處理對(duì)茉莉花的生理指標(biāo)影響見(jiàn)表2。葉片厚、花枝重和產(chǎn)量這3個(gè)性狀,均為高磷海藻肥處理>海藻肥處理>對(duì)照;兩種施肥處理均提高了茉莉花的百蕾重,但兩種施肥處理之間沒(méi)有顯著差異;葉綠素含量和花枝粗則表現(xiàn)為高磷海藻肥處理最高,海藻肥處理和對(duì)照沒(méi)有顯著差異。

表2 海藻肥處理對(duì)茉莉花生理指標(biāo)的影響

2.2 海藻肥處理對(duì)茉莉花揮發(fā)性代謝物的影響

利用GC-MS的方法在茉莉花中分離到14大類(lèi)108種揮發(fā)性代謝物,包括19種萜類(lèi)、17種酯、15種雜環(huán)類(lèi)化合物、13種烴類(lèi)、9種酮、9種醇、7種芳烴、5種鹵代烴、5種醛、3種含硫化合物、2種酸、2種含氮化合物、1種酚和1種胺。代謝物及樣本均聚類(lèi)結(jié)果如圖1所示。由圖1看出,相同處理的組別被聚類(lèi)到同一組中。

利用Fold Change、OPLS-DA模型的VIP值相結(jié)合的方法對(duì)不同處理的茉莉花差異代謝物進(jìn)行篩選,結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知,與對(duì)照相比,施肥處理后均有部分代謝物顯著下調(diào)。其中海藻肥和對(duì)照處理相比,顯著下調(diào)的揮發(fā)性代謝物有6種,包括4種酯、1種酸和1種芳烴,這6種揮發(fā)性代謝物分別為:十八烯酸甲酯(Methyl stearate)、3-甲基-6-苯基-4-(1-苯基乙氧基)-1-己烯(3-methyl-6-phenyl-4-(1-phenylethoxy)-1-Hexene)、(Z)-十六烷基十一烯基乙酸酯(11-Hexadecen-1-ol,acetate,(Z)-)、十六酸甲酯(Hexadecanoic acid,methyl ester)、十七烷酸(Heptadecanoic Acid)和2-糠酸己酯(2-Furancarboxylic acid,hexyl ester);高磷海藻肥和對(duì)照相比,顯著下調(diào)的揮發(fā)性代謝物是十八烯酸甲酯;高磷海藻肥和海藻肥處理相比,顯著上調(diào)的揮發(fā)性代謝物有4種,包括2種酸和2種酯,這6種揮發(fā)性代謝物分別為(Z)-十六烷基十一烯基乙酸酯、十六酸甲酯、十七烷酸和(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二酸(2,6-Octadienoic Acid,3,7-dimethyl-,(E)-)。

表3 差異代謝物數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.3 不同處理茉莉花葉片轉(zhuǎn)錄組的差異分析

測(cè)序過(guò)濾后得到63.32G的clean data,組裝獲得93173條基因,基因的平均長(zhǎng)度為1140 bp,利用主成分分析對(duì)不同處理后茉莉花的變量?jī)?nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,PCA結(jié)果如圖2所示。由圖可知,相同處理的茉莉花相對(duì)聚集。

圖2 PCA 圖

對(duì)不同組間差異基因進(jìn)行篩選,差異基因的篩選條件為 |log2Fold Change|>=1,且符合用Benjamini-Hochberg方法對(duì)假設(shè)檢驗(yàn)概率(P value)進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正后錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05。對(duì)差異基因的統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4,不同組別之間差異基因的重疊情況如圖3所示。

圖3 差異表達(dá)基因的維恩圖

圖4 差異基因 KEGG 富集分析(對(duì)照和海藻肥處理)

圖5 差異基因 KEGG 富集分析(對(duì)照和高磷海藻肥處理) 圖6 差異基因 KEGG 富集分析(高磷海藻肥和海藻肥處理)

圖7 光合相關(guān)基因的表達(dá)分析

表4 差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注釋,合計(jì)128個(gè)代謝通路被注釋,注釋后對(duì)其進(jìn)行顯著性富集分析,富集最顯著的20條pathway如圖所示,對(duì)照和海藻肥處理、高磷海藻肥相比,有10條顯著富集的代謝通路相同,主要包括:色氨酸代謝(Tryptophan metabolism)、植物中的MAPK信號(hào)途徑(MAPK signaling pathway-plant)、丁酸代謝(Butanoate metabolism)、脂肪酸降解(Fatty acid degradation)、α-亞麻酸代謝(alpha-Linolenic acid metabolism)、酮體的合成與降解(Synthesis and degradation of ketone bodies)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、甘油磷脂代謝(Glycerophospholipid metabolism)、單環(huán)菌素生物合成(monobactam biosynthesis)等;高磷海藻肥和對(duì)照、海藻肥處理相比,有7條顯著富集的代謝通路相同,主要包括:磷酸戊糖途徑/糖醛酸途徑(Pentose and glucuronate interconversions)、光合作用(Photosynthesis)、吲哚生物堿生物合成(Indole alkaloid biosynthesis)、半乳糖代謝(Galactose metabolism)、RNA聚合酶(RNA polymerase)。

2.4 海藻肥處理對(duì)光合作用相關(guān)基因的影響

對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),海藻肥和對(duì)照相比,捕光復(fù)合體Ⅱ葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白基因Lhca1、Lhcb1基因表達(dá)下降,Lhca4、Lhca2基因表達(dá)上升,光系統(tǒng)相關(guān)基因Psa L基因表達(dá)上升。高磷海藻肥和對(duì)照相比,提高了捕光復(fù)合體Ⅱ葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白基因Lhca1、Lhca4、Lhcb6基因的表達(dá),同時(shí)提高了光系統(tǒng)相關(guān)基因Psb Q、Psa E、Psa N、Psa L基因的表達(dá);高磷海藻肥和海藻肥處理相比提高了捕光復(fù)合體Ⅱ葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白基因Lhca1、Lhca4、Lhcb1、Lhcb4、Lhcb6的表達(dá),同時(shí)提高了光系統(tǒng)相關(guān)基因Psb Q、Psa E、Psa F、Psa G、Psa L基因的表達(dá),對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果表明和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致,轉(zhuǎn)錄組結(jié)果真實(shí)可靠,證明施肥處理后對(duì)光合相關(guān)基因表達(dá)有促進(jìn)的作用。

3 討 論

隨著技術(shù)的發(fā)展,檢測(cè)代謝物已是驗(yàn)證作物品質(zhì)差異的有效方法[14-15]。前人對(duì)廣西橫縣11個(gè)樣點(diǎn)茉莉花揮發(fā)組分的GC-MS檢測(cè)到242個(gè)已知的香氣組分,本研究在不同海藻肥處理的茉莉花樣本中分離到14大類(lèi)108種揮發(fā)性代謝物,將這些組分和前人的11個(gè)樣點(diǎn)中香氣組分含量前50的化合物相比,有15個(gè)化合物在本研究中檢測(cè)出來(lái),產(chǎn)生結(jié)果差異可能是數(shù)據(jù)庫(kù)之間的差異。香氣是茉莉花品質(zhì)的重要評(píng)判指標(biāo)[16-17],花香在茉莉花生長(zhǎng)的過(guò)程中容易受到外界因素的影響[18-19]。前人利用HS-SPME/GC-MS的方法在32個(gè)茉莉花鮮花樣本中獲得了29種特征性揮發(fā)物,這些揮發(fā)性化合物占茉莉花茶揮發(fā)物含量的95%以上[20]。在本研究中2個(gè)施肥處理組和對(duì)照相比,十八烯酸甲酯的含量均下降,此外有5種揮發(fā)性物質(zhì)在僅施海藻肥組和對(duì)照組之間含量有差異,但是這些差異物質(zhì)沒(méi)有包含在前人研究的茉莉花特征揮發(fā)物質(zhì)之中,說(shuō)明海藻肥處理后,由于產(chǎn)量的提高,茉莉花品質(zhì)可能發(fā)生了有限度的下降,磷肥對(duì)這種品質(zhì)的下降有一定的補(bǔ)償作用。

本研究發(fā)現(xiàn),海藻肥和高磷海藻肥處理后,增加了茉莉花的葉片厚度、花枝重量、花枝莖粗、百蕾鮮重,提高了茉莉花的葉綠素含量和茉莉花的產(chǎn)量。在茉莉花平衡施肥的研究中表明,茉莉花的產(chǎn)量和磷肥施用成正相關(guān),合理施肥是茉莉花高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵因素。本研究中,海藻肥施用可以提高茉莉花的產(chǎn)量,在海藻肥施用的基礎(chǔ)上增加磷肥的施用可以更高的提高茉莉花的產(chǎn)量,磷肥的施用可能是茉莉花高產(chǎn)的關(guān)鍵因子之一。隨著技術(shù)的發(fā)展,高通量測(cè)序技術(shù)可以揭示作物產(chǎn)量、品質(zhì)變化的分子機(jī)制[21-24]。本研究中,不同組別之間合計(jì)128個(gè)代謝通路被富集,對(duì)顯著富集的代謝通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)顯著富集的代謝通路與物質(zhì)代謝相關(guān),高磷海藻肥和對(duì)照、海藻肥處理相比,光合作用這一代謝通路均被顯著富集。前人在茶用菊中的研究表明,光合速率和葉綠素含量和產(chǎn)量極顯著正相關(guān)[25],本研究同樣證明施肥處理后,茉莉花產(chǎn)量的提高可能是施肥處理可以提高茉莉花葉綠素的含量,同時(shí)提高了光合相關(guān)基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

利用田間測(cè)試、GC-MS和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的手段對(duì)海藻肥、高磷海藻肥處理后茉莉花產(chǎn)量品質(zhì)的變化進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,高磷海藻肥處理后,增加了茉莉花的葉片厚度、花枝重量、花枝莖粗、百蕾鮮重,提高了茉莉花的葉綠素含量和產(chǎn)量;施肥處理后,部分揮發(fā)性代謝物表達(dá)下調(diào),磷的施用可以減少下調(diào)代謝物的數(shù)量;施肥處理促進(jìn)了葉片光合相關(guān)基因的表達(dá)可能是茉莉花產(chǎn)量提高的原因。