劉 倩,李 格,張 靜,蘭銀銀,韓福國(guó),范雪梅,郝艷麗,劉清飛,3*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽(yáng) 712046；2.清華大學(xué)藥學(xué)院，北京 100084；3.清華大學(xué)北京市中醫(yī)藥交叉研究所，北京100084

黃芪是常用的傳統(tǒng)中藥之一，為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. 的干燥根；性微溫，味甘，歸脾、肺經(jīng)，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水退腫之功效［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪主要含有皂苷、黃酮、氨基酸以及多糖等多種活性成分，具有抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、降血壓等藥理作用［2］。黃芪在我國(guó)分布較廣，如甘肅、山西、陜西、內(nèi)蒙古、東北等地，各地區(qū)海拔、土壤、光照等環(huán)境條件不同，導(dǎo)致各產(chǎn)地黃芪藥材及飲片的質(zhì)量與等級(jí)也有顯著差異［3］。目前，有研究用高效液相色譜、超高效液相色譜等技術(shù)比較不同產(chǎn)地黃芪水提取液、醇提取液等化學(xué)成分，證實(shí)在各地黃芪中部分成分存在含量差異，為研究不同產(chǎn)地黃芪質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供了一定科學(xué)依據(jù)，但大多數(shù)研究?jī)H對(duì)含量較高的化合物進(jìn)行分析，并不全面［4-7］。因此，本研究以黃芪的3 個(gè)重要產(chǎn)地（山西渾源與朔州、甘肅渭源與岷縣、陜西子洲）所產(chǎn)的黃芪飲片為研究對(duì)象，用超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)（UHPLC-Q-Orbitrap-MS）液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)全面檢測(cè)黃芪的化學(xué)成分，并用偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全面分析3 個(gè)產(chǎn)地黃芪飲片的化學(xué)成分差異，為不同產(chǎn)地黃芪飲片的基原鑒定與質(zhì)量研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UHPLC-Q-Orbitrap-MS 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：Ultimate 3000 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Dionex 公司）串聯(lián)Thermo Q Exactive Plus 型高分辨質(zhì)譜（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RT-12SF粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；MS104S 分析天平（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LD5-2B 離心機(jī)（北京市京立離心機(jī)有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

15 批黃芪飲片分別由北京市萬(wàn)泰利克藥業(yè)有限公司、陜西子洲縣永盛黃芪種植農(nóng)民專業(yè)合作社提供，分別來(lái)源于甘肅、山西、陜西3 個(gè)省的主產(chǎn)地，為豆科植物蒙古黃芪的干燥根，見(jiàn)表1。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備

取黃芪飲片適量，粉碎過(guò)60 目篩，再取過(guò)篩粉末約1 g，精密稱定，加甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，浸泡30 min，超聲提取1 h，稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，以4 000 r·min-1離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫為30 ℃；流速為0.2 mL·min-1；流動(dòng)相為0.1 mL·L-1甲酸-乙腈（A）-0.1 mL·L-1甲酸水（B），梯度洗脫：0～10 min，100%B；10～20 min，100%～70% B；10～25 min，70%～60%B；25～30 min，60%～50%B；30～40 min，50%～30%B；40～45 min，30%～0%B；45～60 min，0% B。二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）的掃描波長(zhǎng)設(shè)為190～400 nm。

表 1 黃芪飲片的來(lái)源Tab.1 Source of Astragali radix decoction pieces

2.3 質(zhì)譜條件

離子源：加熱電噴霧離子化源（heated elektrospray ionization source，HESI）；鞘氣流量為40 arb，輔助氣體流量為15 arb，毛細(xì)管溫度為320 ℃，輔助氣體加熱器溫度為350 ℃，正噴霧電壓為3.2 kV，負(fù)噴霧電壓為3.0 kV。MS 的分辨率為70 000，MS/MS 的分辨率為17 500，掃描方式為全掃描模式，正、負(fù)離子模式同時(shí)檢測(cè)，掃描范圍m/z100～1 500。

2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

化合物用Compound Discover 3.1，m/zCloud 和m/zVault 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定，并與TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)中黃芪化學(xué)成分進(jìn)行比對(duì)。用SIMCA 軟件對(duì)所得化合物進(jìn)行PLS-DA 分析，以VIP 值反映化合物對(duì)分組的貢獻(xiàn)大小，并進(jìn)一步用t檢驗(yàn)對(duì)差異成分進(jìn)行顯著性分析，最終以VIP＞1、P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選不同產(chǎn)地黃芪的差異成分。對(duì)不同產(chǎn)地黃芪的差異成分用SIMCA 再次進(jìn)行PLS-DA 分析，繪制得分圖、聚類樹狀圖、Bipolt 圖，分析得不同產(chǎn)地的代表性差異成分。用Origin 軟件繪制差異成分熱圖，以更直觀地分析不同產(chǎn)地黃芪的差異成分的含量差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 化學(xué)成分的鑒定

甘肅、山西、陜西3 個(gè)產(chǎn)地黃芪飲片的總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 正負(fù)離子模式下3 個(gè)產(chǎn)地黃芪UHPLC-MS 總離子流圖Fig.1 UHPLC-MS TIC of Astragali radix decoction pieces from 3 origins in positive and negative ion modes

從正、負(fù)離子流圖可知，不同產(chǎn)地黃芪圖譜整體輪廓大致相似，但部分化合物峰高有差異。原始圖譜信息與Compound Discover 3.1、m/zCloud、m/zVault、TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)中黃芪化合物信息進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出107 個(gè)化合物，并以相對(duì)分子質(zhì)量由小到大對(duì)化合物進(jìn)行編號(hào)。

3.2 差異化合物的篩選及鑒定

用有監(jiān)督的PLS-DA 方法分析數(shù)據(jù)，所得模型參數(shù)為R2Y（cum）=0.935，Q2（cum）=0.202。PLSDA 得分圖見(jiàn)圖2。由圖2 可知，甘肅、山西產(chǎn)地5 個(gè)批次的黃芪較為分散，陜西子洲產(chǎn)地5 個(gè)批次的黃芪較為聚集且與其他2 個(gè)產(chǎn)地距離較遠(yuǎn)。進(jìn)一步計(jì)算各個(gè)化合物的VIP 值、組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)同時(shí)符合VIP＞1 且P＜0.05 的成分共有21 個(gè)，主要涉及氨基酸、糖、酚酸、黃酮、維生素、木脂素、三萜等化合物，其中1 個(gè)成分在甘肅、山西2 個(gè)產(chǎn)地差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；11 個(gè)成分在山西、陜西2 個(gè)產(chǎn)地差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；18 個(gè)成分在甘肅、陜西2 個(gè)產(chǎn)地差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。其中葉酸僅在陜西子洲產(chǎn)地檢測(cè)到，其余20 個(gè)成分在3 個(gè)產(chǎn)地的黃芪中均存在，但含量有差異，見(jiàn)圖3。

圖2 PLS-DA 得分散點(diǎn)圖Fig.2 PLS-DA score scatter plot

圖3 不同產(chǎn)地差異化合物的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of differential compounds of different origins

表2 21 個(gè)差異化合物的信息Tab.2 Information of 21 differential compounds

3.3 差異成分的研究

基于21 個(gè)差異化合物對(duì)15 批樣本進(jìn)行聚類，區(qū)分不同產(chǎn)地黃芪飲片的潛在指標(biāo)成分。PLS-DA 法所得模型參數(shù)為R2Y（cum）=0.837，Q2（cum）=0.482，得分圖見(jiàn)圖4。聚類分析樹狀圖見(jiàn)圖5。由圖5 可知，21 個(gè)差異化合物可將3 個(gè)不同產(chǎn)地的黃芪區(qū)分開。若分為2 類，僅有陜西子洲與甘肅明顯區(qū)分開；若分為4 類，陜西5 批可聚為一類，甘肅5 批聚為一類，山西S-3、S-5 聚為一類，但與陜西相近，山西S-1、S-2、S-4 聚為一類，但與甘肅相近。

圖4 差異成分得分散點(diǎn)圖Fig.4 Score scatter plot of differential compounds

圖5 差異成分的聚類樹狀圖Fig.5 Hierarchical cluster analysis for differential compounds

Biplot 圖見(jiàn)圖6。由圖6 可知，各差異化合物與產(chǎn)地越接近表明成分與該產(chǎn)地相關(guān)性越強(qiáng)，含量也越高。熱圖中顏色越紅，表明含量越高。差異成分熱圖見(jiàn)圖7，結(jié)合Biplot 圖及熱圖可知，有12 個(gè)差異化合物在陜西子洲黃芪中含量高于其他產(chǎn)地。其中阿拉伯糖（15）、維生素B2（64）、葉酸（74）、黃芪異黃烷苷（85）、柚皮苷（90）、沙苑子苷（94）在陜西子洲與其他2個(gè)產(chǎn)地的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可作為陜西子洲黃芪潛在指標(biāo)性成分；羽扇豆醇（70）、4-羥基肉桂酸（17）、精氨酸（20）、胱氨酸（26）、γ-氨基丁酸（1）、絲氨酸（3）、鷹嘴豆芽素A（43）、芒果苷（69）、L-乙酸冰片酯（25）9 種差異化合物在甘肅黃芪中含量較高，但其中羽扇豆醇與其他2 個(gè)產(chǎn)地含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無(wú)法區(qū)別于其他2 個(gè)產(chǎn)地。刺芒柄花素（35）、刀豆氨酸（21）等化合物在山西黃芪中含量較高。

圖6 差異成分的Biplot 圖Fig.6 Biplot plot of differential compounds

圖7 差異成分熱圖Fig.7 Heat map of differential compounds

將差異性成分的峰面積用Origin 軟件進(jìn)行歸一化處理，再對(duì)甘肅、山西、陜西3 個(gè)產(chǎn)地含量較高的顯著差異成分的相對(duì)含量進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖8、圖9。結(jié)果顯示，甘肅產(chǎn)地黃芪中4-羥基肉桂酸含量顯著高于山西產(chǎn)地；精氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸、絲氨酸、鷹嘴豆芽素A、芒果苷、L-乙酸冰片酯含量顯著高于陜西子洲產(chǎn)地。相對(duì)甘肅、山西2 個(gè)產(chǎn)地的黃芪，陜西子洲黃芪中阿拉伯糖、維生素B2、葉酸、黃芪異黃烷苷、柚皮苷、沙苑子苷的含量相對(duì)較高，可作為陜西子洲黃芪潛在質(zhì)量指標(biāo)成分。

圖9 陜西子洲產(chǎn)黃芪飲片含量較高的成分歸-化峰面積柱狀圖Fig.9 Histogram of normalized peak areas of components with higher content of Astragali radix decoction pieces from Zizhou in Shannxi

4 討論

黃芪為臨床常用中藥材，產(chǎn)地多，分布廣，其品種、品質(zhì)、規(guī)格等亦多有不同。陜西、山西、甘肅作為黃芪的重要產(chǎn)區(qū)，地理位置（如經(jīng)度與緯度、坡向與坡度等），氣候特征（如干旱與潮濕等），以及生長(zhǎng)采收年限不同等，導(dǎo)致各地黃芪藥材及飲片質(zhì)量存在顯著差異。陜西子洲黃芪為蒙古黃芪，生長(zhǎng)于干旱的坡地，為半野生黃芪，生長(zhǎng)年限大多超過(guò)5年，于2008年被批準(zhǔn)為國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品；山西恒山黃芪為蒙古黃芪，生長(zhǎng)于干旱的坡地，為半野生黃芪，生長(zhǎng)年限大多超過(guò)5年，于2014年被批準(zhǔn)為國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，亦有部分家種黃芪，通常栽培2～3年；甘肅隴西黃芪主要為蒙古黃芪，生長(zhǎng)于相對(duì)潮濕的平地，為栽培黃芪，生長(zhǎng)年限為2年［8-9］。此外，從歷代本草有關(guān)黃芪產(chǎn)地的記述可以看出，黃芪的道地產(chǎn)地隨朝代的變更而變遷［10-11］，加之人工栽培所用種子來(lái)源多元化，為當(dāng)?shù)仫嬈馁|(zhì)量控制帶來(lái)一定困難。例如隨機(jī)采集甘肅主栽地區(qū)的黃芪資源，樣品中蒙古黃芪、膜莢黃芪所占比例最高，分別為59.65%、36.84%，剩余紅芪及東俄洛黃芪占3.51%［12］。為此，加強(qiáng)對(duì)黃芪基原與質(zhì)量的研究，從而為黃芪藥材飲片的質(zhì)量控制提供參考尤為必要。近年來(lái)多數(shù)研究基于UPLC-MS、核磁指紋圖譜、SSR 分子標(biāo)記技術(shù)等方法從多指標(biāo)含量測(cè)定、炮制前后化學(xué)組分對(duì)比等方面對(duì)黃芪飲片基源及質(zhì)量進(jìn)行研究［4-5，13-15］。本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap-MS 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析比較甘肅、山西、陜西3 個(gè)不同產(chǎn)地黃芪飲片的成分差異，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)對(duì)比鑒定出108 個(gè)化學(xué)成分，并經(jīng)組間比較及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析篩選出21 個(gè)顯著差異化合物，可作為特征成分對(duì)3個(gè)產(chǎn)地的黃芪飲片進(jìn)行區(qū)分，為黃芪飲片的來(lái)源鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。從差異化合物聚類分析圖可發(fā)現(xiàn)，21 個(gè)差異化合物可將甘肅、山西、陜西3 個(gè)不同產(chǎn)地黃芪飲片區(qū)分，但同一省不同地區(qū)黃芪并未有所區(qū)分，如山西渾源S-5 與山西朔州S-3 聚為一類，甘肅渭源G-2 與岷縣G-3 聚為一類，表明同省內(nèi)黃芪飲片質(zhì)量無(wú)明顯差異。因此本文重點(diǎn)分析3 個(gè)不同省份所產(chǎn)黃芪飲片的成分差異。

21 個(gè)差異化合物中有6 個(gè)成分在陜西子洲黃芪中的含量均顯著高于甘肅、山西2 個(gè)產(chǎn)地的黃芪，分別為沙苑子苷、葉酸、黃芪異黃烷苷、柚皮苷、阿拉伯糖、維生素B2，推測(cè)這幾種成分既可區(qū)別陜西子洲與其他產(chǎn)地所產(chǎn)黃芪，也可用于黃芪種源鑒定。上述黃芪異黃烷苷、沙苑子苷和柚皮苷屬于黃酮苷類，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)黃芪異黃烷苷具有治療兒童肥胖癥、糖尿病周圍血管疾病等藥理作用［16-17］，有研究報(bào)道，沙苑子苷能很好地與促進(jìn)腫瘤血管形成的相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合，可調(diào)控原癌基因酪氨酸蛋白激酶（ABL1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）［18］。柚皮苷可對(duì)某些毒物產(chǎn)生拮抗作用，還具有降血脂、降膽固醇、抗骨質(zhì)疏松、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用［19］。維生素B2是體內(nèi)多種氧化酶系統(tǒng)不可缺少的輔酶，其對(duì)維持人體正常物質(zhì)代謝和某些特殊生理功能是不可缺少的［20］。黃芪異黃烷苷、柚皮苷、沙苑子苷等6 種差異成分在陜西子洲產(chǎn)的黃芪中含量較高，且具有多種藥理活性，也表明陜西子洲的黃芪飲片在抗癌、免疫調(diào)節(jié)、降血脂等作用方面較有優(yōu)勢(shì)。

其次，21 個(gè)差異化合物中可區(qū)別于甘肅、山西產(chǎn)地蒙古黃芪的成分僅有4-羥基肉桂酸，但甘肅黃芪與陜西子洲黃芪無(wú)顯著差異，推測(cè)此成分可能受甘肅地理環(huán)境影響，種源間差異較小，可作為甘肅蒙古黃芪飲片的質(zhì)量標(biāo)志物之一。4-羥基肉桂酸又稱對(duì)羥基肉桂酸，可通過(guò)抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成，達(dá)到預(yù)防和治療色素沉著、黑色素瘤等目的［21］。劉利娜［22］研究發(fā)現(xiàn)，滇桂艾納香中的酚酸（對(duì)羥基肉桂酸）具有顯著的抗血小板活性。甘肅產(chǎn)黃芪中精氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸、絲氨酸、鷹嘴豆芽素A、芒果苷、L-乙酸冰片酯含量顯著高于陜西子洲產(chǎn)黃芪，可分為氨基酸類、黃酮類等，但含量與山西產(chǎn)黃芪無(wú)顯著差異，推測(cè)這幾種成分也可作為黃芪種源鑒定的特征性成分。氨基酸結(jié)構(gòu)具有既含羧基又含氨基的特點(diǎn)，在調(diào)節(jié)激素分泌及合成、調(diào)節(jié)能量代謝、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血壓、提高記憶力等方面有重要藥理作用［23-24］。據(jù)報(bào)道，鷹嘴豆芽素A 可通過(guò)限制糖酵解和線粒體氧化磷酸化等抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)［25］。芒果苷又稱莞知母寧，是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，具有良好的降糖活性，可通過(guò)增加小鼠成肌細(xì)胞葡萄糖吸收以及改善細(xì)胞胰島素抵抗活性等發(fā)揮降糖作用［26］。由此可推測(cè)，甘肅黃芪可能在抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌以及降血糖等方面具有較強(qiáng)的藥理活性。山西產(chǎn)地黃芪中刺芒柄花素含量顯著高于陜西子洲產(chǎn)地，但與甘肅產(chǎn)地?zé)o明顯差異，刺芒柄花素為異黃酮類化合物，也是黃芪的主要成分之一，研究表明，其在抗炎、抗氧化應(yīng)激、神經(jīng)組織修復(fù)、抗癌等方面有重要作用。LI Z 等［27］研究發(fā)現(xiàn)刺芒柄花素可通過(guò)抑制白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。其還可通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1（E2-related factor 2/hemo oxygenase-1，Nrf2/HO-1）信號(hào)通路改善腎功能、降低血糖血脂、抑制腎組織氧化［28］。其在結(jié)腸癌、胃癌、外陰鱗癌等疾病中可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡活性［29-31］，推測(cè)山西產(chǎn)黃芪可能在此類藥理作用方面有更強(qiáng)的活性。

綜上所述，基于PLS-DA 等分析方法得到21 個(gè)差異性化合物，可對(duì)不同產(chǎn)地黃芪道地性指標(biāo)奠定理論基礎(chǔ)，并且差異化合物分類廣泛，涉及維生素、黃酮及其苷類、糖等，表明不同產(chǎn)地代表性差異成分可能在對(duì)應(yīng)藥理作用方面具有臨床治療意義，也為深入研究其藥理作用提供思路。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定黃芪甲苷與毛蕊異黃酮葡萄糖苷為黃芪含量測(cè)定指標(biāo)，而本研究中3 個(gè)產(chǎn)地的15批樣本中，黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均未見(jiàn)顯著性差異，表明僅以該2 種成分并不能有效區(qū)分不同產(chǎn)地的黃芪飲片，與文獻(xiàn)報(bào)道的甘肅與內(nèi)蒙古產(chǎn)黃芪上述2 個(gè)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義相一致［32］。本研究為黃芪飲片的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)納入更多活性強(qiáng)、含量高的有效成分提供理論依據(jù)。但研究每個(gè)產(chǎn)地僅購(gòu)入5 批黃芪，樣本量小，今后應(yīng)購(gòu)入不同產(chǎn)地更多批次的黃芪來(lái)驗(yàn)證本文分析所得的潛在質(zhì)量標(biāo)志物的準(zhǔn)確性。 本文僅基于UHPLC-Q-Orbitrap-MS 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行差異化合物檢測(cè)及分析，今后可進(jìn)一步運(yùn)用紅外、液質(zhì)聯(lián)用、核磁共振等多種方法，并且結(jié)合多糖、蛋白、微量元素等物質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)黃芪飲片的道地性及種源方面進(jìn)行更系統(tǒng)、全面地研究。