劉 洋, 趙巧棉, 李海燕, 張思宇, 楊 穎, 宮 月

(河北省承德市婦幼保健院生殖中心, 河北 承德 067000)

妊娠期高血壓疾病(Hypertensive Disorders in Pregnancy,HDP)作為產(chǎn)科常見(jiàn)并發(fā)癥之一,亦是孕產(chǎn)婦死亡重要原因[1]。HDP病因及發(fā)病機(jī)制目前尚未十分明確,臨床表現(xiàn)主要為蛋白尿及高血壓,癥狀嚴(yán)重者可出現(xiàn)多系統(tǒng)臟器損傷,嚴(yán)重威脅母嬰健康。因此,探尋HDP發(fā)病機(jī)制對(duì)其診療意義重大。微小RNA(microRNA,miR)屬于基因調(diào)控分子,可影響眾多蛋白編碼基因輸出,參加大多數(shù)細(xì)胞因子免疫應(yīng)答及轉(zhuǎn)錄調(diào)控[2]。有研究指出,miR表達(dá)和胎盤(pán)病理生理發(fā)育存在一定關(guān)聯(lián),成熟miR可參與滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程[3]。miR-181b、miR-210、miR-126均為臨床常見(jiàn)的miR分子,部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在HDP發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[4]。國(guó)內(nèi)外研究指出,炎癥反應(yīng)貫穿HDP發(fā)生發(fā)展過(guò)程,其中炎癥因子與HDP病情變化密切相關(guān)[5-6]。目前雖有一些研究探索miR與HDP患者炎癥因子的關(guān)系,但關(guān)于miR-181b、miR-210、miR-126在HDP中的表達(dá)及與7種炎癥因子水平關(guān)系的研究報(bào)道較少。為此,本研究探究miR-181b、miR-210、miR-126在HDP中的表達(dá)及與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2018年1月至2019年12月承德市婦幼保健院收治的213例HDP單胎孕婦作為觀察組,以病情嚴(yán)重程度為依據(jù)將其設(shè)為妊娠期高血壓(GH組,62例)、輕度子癇前期(MP組,90例)及重度子癇前期(SP組,61例)3個(gè)亞組。納選標(biāo)準(zhǔn)：①與HDP相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)相符[7];②妊娠期產(chǎn)檢規(guī)律,資料齊全;③單胎妊娠;④知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胎兒先天畸形的孕婦;②孕婦或胎兒有病毒感染;③妊娠前存在自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、糖尿病或高血壓;④存在重要臟器嚴(yán)重病變。另選取同期同醫(yī)院收治的78名健康孕婦作為對(duì)照組。四組一般資料均衡可比(P>0.05),見(jiàn)表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 四組一般資料比較

1.2方 法

1.2.1標(biāo)本采集：所有受檢者清晨抽5mL空腹靜脈血,在常溫下放置30min后,經(jīng)10min離心(3500r/min轉(zhuǎn)速,13.5cm離心半徑)后取上清液,置于-80℃冰箱待檢。

1.2.2miR-181b、miR-210、miR-126相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)：實(shí)施實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè),所用儀器為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的7500型熒光定量PCR儀,所用試劑盒及緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs購(gòu)自美國(guó)Ambio公司。取1份待測(cè)上清液,在其中加入Trizol RNA 1mL進(jìn)行總RNA提取,利用紫外分光光度計(jì)初步判斷總RNA純度,若在1.8～2.0間則提示純度較好。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA,其中 miR-181b上游引物5'-AACATTCATTGCTGTCGGTGGG-3',下游引物5'-GCGAAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3';miR-210上游引物5'-CAATAACTGTGCGTGTGACAGC-3',下游引物5'-TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3';miR-126上游引物5'-TCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3',下游引物5'-CGCATI’ATI1ACTCACGGI1AC-3';內(nèi)參基因U6上游引物5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',下游引物5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5μL模板RNA,3μL miRNA特異性莖環(huán)引物及內(nèi)參基因U6,0.15μL 100mmoL/LdNTPs,1μL 50U/μL反轉(zhuǎn)錄酶,1.5μL 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液,0.19μL 20U/μL RNase抑制劑,4.16μL無(wú)菌不含酶蒸餾水。將提取的cDNA保存于4℃冰箱中。qRT-PCR檢測(cè)：模板為cDNA,建立qRT-PCR反應(yīng)體系20μL(10μL 2×TaqMan通用混合物溶液,1μL 20×引物及探針Mix,1.33μL cDNA模板,7.67μL無(wú)核酸酶蒸餾水)。反應(yīng)條件為16℃ 30min;42℃ 30min;85℃ 5min。擴(kuò)增條件為95℃ 10min 1個(gè)循環(huán),95℃ 15s、60℃ 60s 45個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后取平均值,miR-181b、miR-210、miR-126相對(duì)表達(dá)量運(yùn)用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(U6)。

1.2.3炎癥因子檢測(cè)：取1份待測(cè)上清液,血清白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)、白介素-17(Interleukin-17,IL-17) 、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1,MCP-1)及血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular-cellular adhesion molecule-1,VCAM-1)水平實(shí)施酶聯(lián)免疫法測(cè)定,操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求開(kāi)展。IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司,MCP-1、VCAM-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3統(tǒng)計(jì)分析：將數(shù)據(jù)錄入軟件SPSS25.0分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用描述,行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較行單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析;檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-181b、miR-210、miR-126 相對(duì)表達(dá)量及炎癥因子水平比較：觀察組miR-181b、miR-210 相對(duì)表達(dá)量及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均比對(duì)照組高(P<0.05);觀察組miR-126相對(duì)表達(dá)量及IL-10均比對(duì)照組低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組miR-181b miR-210 miR-126 相對(duì)表達(dá)量及炎癥因子水平對(duì)比

2.2不同HDP亞組miR-181b、miR-210、miR-126 相對(duì)表達(dá)量及炎癥因子水平比較：GH組miR-181b、miR-210 相對(duì)表達(dá)量及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均比MP組及SP組低,且MP組比SP組低(P<0.05);GH組miR-126相對(duì)表達(dá)量及IL-10均比MP組及SP組高,且MP組比SP組高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同HDP亞組miR-181b miR-210 miR-126 相對(duì)表達(dá)量及炎癥因子水平對(duì)比

2.3HDP患者miR-181b、miR-210、miR-126 相對(duì)表達(dá)量與炎癥因子的相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)性分析顯示,HDP患者miR-181b、miR-210相對(duì)表達(dá)量與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均呈正相關(guān),與IL-10呈負(fù)相關(guān)(P<0.05); HDP患者miR-126 相對(duì)表達(dá)量與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均呈負(fù)相關(guān),與IL-10呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖1。

圖1 HDP患者miR-181b、miR-210、miR-126 相對(duì)表達(dá)量與炎癥因子的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

表4 HDP患者miR-181b、miR-210、miR-126 相對(duì)表達(dá)量與炎癥因子的相關(guān)性分析

3 討 論

HDP主要發(fā)生于妊娠期女性,大部分患者病情多輕微,早期癥狀不顯著,少數(shù)患者可發(fā)生昏迷、抽搐等,危及母嬰生命安全[8]。HDP發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為和血管內(nèi)皮受損、免疫失衡等因素有關(guān)[9-10]。因此,探尋HDP發(fā)病機(jī)制,尋找有效監(jiān)測(cè)指標(biāo)對(duì)其預(yù)防、診斷及治療意義重大。

miR屬于內(nèi)源性非編碼RNA,于真核生物中存在廣泛,可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)對(duì)生物體生理活動(dòng)進(jìn)行干預(yù)。Hromadnikova等[11]指出,HDP發(fā)病可能和miR異常表達(dá)有關(guān),miR對(duì)胎盤(pán)發(fā)育具有維持正常作用,可能成為HDP重要評(píng)估指標(biāo)。miR-181b屬于miR,當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷或炎癥反應(yīng)時(shí)其表達(dá)異常,可參與心血管疾病等發(fā)病過(guò)程。楊娜等[12]指出,miR-181b在HDP中呈高表達(dá),可介導(dǎo)HDP發(fā)病過(guò)程。miR-210作為一種存在于人體11號(hào)染色體上的缺氧激活因子,當(dāng)機(jī)體缺血缺氧時(shí)其呈高表達(dá),可促使血管新生。Frazier等[13]報(bào)道,miR-210參與子癇前期發(fā)病過(guò)程,可通過(guò)介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)促進(jìn)病情進(jìn)展。miR-126屬于與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)miR,對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖分化具有促進(jìn)作用,可使內(nèi)皮細(xì)胞保持穩(wěn)定,確保血管完整性。何曉焱等[14]指出,miR-126在HDP中表達(dá)下調(diào),通過(guò)介導(dǎo)血管生成影響HDP發(fā)生發(fā)展。本研究中,觀察組miR-181b、miR-210 相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組高,miR-126相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組低,表明miR-181b、miR-210、miR-126參與HDP發(fā)病過(guò)程。

炎癥反應(yīng)作為血管生成及損傷的重要調(diào)控因素,其與HDP發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。IL-1β、IL-6、IL-17屬于促炎因子,其中IL-1β不僅對(duì)IL-6具有誘導(dǎo)作用,還能對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及胎盤(pán)進(jìn)行直接或間接作用,致使細(xì)胞損害;IL-6對(duì)Th1/Th2免疫平衡具有重要維持作用;IL-17由T細(xì)胞釋放而成,可利用對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞等誘導(dǎo)作用促使IL-6等細(xì)胞因子產(chǎn)生,進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)。IL-10屬于抑炎因子,對(duì)IL-6等促炎因子具有抑制作用,可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。TNF-α屬于免疫調(diào)節(jié)因子,可參與機(jī)體炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)促炎因子釋放。MCP-1屬于趨化因子CC家族,不僅可結(jié)合血中單核細(xì)胞,并促使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞,還可使血管內(nèi)皮受損,降低一氧化氮功能,導(dǎo)致血管痙攣等。VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族,在細(xì)胞因子活化內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)。當(dāng)人體正常妊娠時(shí),VCAM-1參與血管內(nèi)皮與滋養(yǎng)細(xì)胞間黏附過(guò)程,有利于胎盤(pán)發(fā)育。本研究中,觀察組IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1比對(duì)照組高,IL-10比對(duì)照組低,表明炎癥反應(yīng)參與HDP發(fā)病過(guò)程。

本研究中,GH組miR-181b、miR-210 相對(duì)表達(dá)量及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均比MP組及SP組低,且MP組比SP組低;GH組miR-126相對(duì)表達(dá)量及IL-10均比MP組及SP組高,且MP組比SP組高,說(shuō)明HDP患者病情愈重,miR-181b、miR-210表達(dá)及促炎因子水平愈高,miR-126表達(dá)及抑炎因子水平愈低。本研究進(jìn)一步行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)HDP患者miR-181b、miR-210相對(duì)表達(dá)量與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均呈正相關(guān),與IL-10呈負(fù)相關(guān); HDP患者miR-126 相對(duì)表達(dá)量與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均呈負(fù)相關(guān),與IL-10呈正相關(guān),表明miR-181b、miR-210、miR-126可能通過(guò)與機(jī)體炎癥反應(yīng)相互作用而參與HDP發(fā)病過(guò)程。分析原因,HDP發(fā)病導(dǎo)致機(jī)體促炎因子大量釋放,炎癥反應(yīng)被激活,血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,增加血管通透性,導(dǎo)致臟器缺血缺氧,加劇病情。miR-181b通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)通路誘導(dǎo)促炎因子釋放,使機(jī)體炎癥反應(yīng)加重,導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損,從而參與HDP發(fā)生過(guò)程。miR-210通過(guò)相應(yīng)靶位將相應(yīng)信號(hào)通路激活,引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激,致使機(jī)體免疫失衡,大量促炎因子釋放,而抑炎因子釋放受抑制,從而加劇機(jī)體炎癥反應(yīng),參與HDP發(fā)生過(guò)程。miR-126通過(guò)靶基因PI3KR2、SPRED抑制PI3K、MAPK信號(hào)通路,阻止血管生成,致使母胎界面血供不足,胎盤(pán)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常,一些細(xì)胞碎片被釋放而引起機(jī)體炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致HDP發(fā)病。

綜上所述,miR-181b、miR-210在HDP中呈高表達(dá),miR-126在HDP中呈低表達(dá),且三者與HDP炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。