陳 帥,嚴(yán)婷婷,董夢瑤,周煜琛,佘望軍,李 月,蔡珉敏,黃 鳳,張吉斌,喻子牛,鄭龍玉

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué),湖北 武漢 430070)

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)會(huì)導(dǎo)致肉雞心包積水綜合征(hydropericardium syndrome,HPS)的發(fā)生,是目前對養(yǎng)雞業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病之一。自1987年首次爆發(fā)于巴基斯坦后,FAdV-4已經(jīng)蔓延到了亞洲、中美洲、南美洲、歐洲的許多國家和地區(qū)[1-4]。FAdV-4主要感染3～8周的肉雞,發(fā)病率和死亡率高達(dá)20%～80%[5-7]。垂直傳播是FAdV-4 傳播的重要途經(jīng),該病毒主要發(fā)生在未接種疫苗的種雞中,隨后通過受感染的雞蛋垂直傳播給肉雞[8-9]。FAdV-4也易發(fā)生水平傳播,因?yàn)樵摬《敬嬖谟谒信判刮镏?并且在糞便中的滴度很高。通常FAdV-4可以通過糞口途徑和氣溶膠在雞群中有效傳播[10-12]。污染物、人員和交通工具也可能是該病毒傳播的重要因素[13]。

隨著市場對雞蛋和肉制品需求的增加,家禽業(yè)已發(fā)展為全球增長最快的農(nóng)產(chǎn)業(yè)之一[14]。近年來,集約商業(yè)化禽類養(yǎng)殖迅速發(fā)展,雞糞大量積累引發(fā)的環(huán)境污染問題日益凸顯,其中病原體也給家禽甚至人類健康帶來潛在威脅。目前,常采用堆肥、厭氧消化以及生物轉(zhuǎn)化等方法處理家禽糞便,能很大程度上減少污染和疾病傳播,并且能夠產(chǎn)生能源和其它高附加值產(chǎn)品[15-17]。

亮斑扁角水虻(HermetiaillucensL.,black soldier fly,簡稱水虻),是一種新興的資源化昆蟲。在自然界中水虻幼蟲(black soldier fly larvae,BSFL)營腐生生活,基于這一特性,其被用于轉(zhuǎn)化畜禽糞便、餐廚垃圾等有機(jī)廢棄物[18-19]。與家蠅不同的是,水虻很少與人類共享生活區(qū)域,從而降低了傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)[20-21]。 BSFL轉(zhuǎn)化能夠減少糞便中的病原體沙門氏菌和病毒[22],不僅能解決環(huán)境污染的問題,還可以提高資源利用率。鑒于此,作者將BSFL接入含F(xiàn)AdV-4的雞糞中(0～18 d),采用TaqMan qPCR和16S rDNA高通量測序分析BSFL轉(zhuǎn)化過程中 FAdV-4含量的動(dòng)態(tài)變化和微生物區(qū)系演化,以期為后續(xù)利用BSFL轉(zhuǎn)化消減雞糞中FAdV-4含量、抑制病原體傳播風(fēng)險(xiǎn)提供理論支撐。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

水虻為武漢品系,飼養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物農(nóng)藥國家工程研究中心5樓溫室中。采用小麥麩皮與次粉按質(zhì)量比1∶3配制成人工飼料,濕度保持在 70%～80%,飼養(yǎng)溫度在(28±2) ℃左右,光周期設(shè)置為 14 L∶10 D。

FAdV-4,由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)系提供。

1.2 FAdV-4的培養(yǎng)

FAdV-4分離自病雞的雞肝組織,剪碎雞肝后加液氮研磨,用生理鹽水稀釋,8 000 r·min-1離心 5 min,取上清分裝后凍存于-80 ℃冰箱中。使用雞肝癌細(xì)胞LMH對FAdV-4進(jìn)行傳代培養(yǎng);待癌細(xì)胞LMH生長至培養(yǎng)瓶面積80%左右時(shí),開始接毒。于超凈臺(tái)內(nèi),棄去T75培養(yǎng)瓶中原培養(yǎng)液,用PBS洗滌2次,瀝干。向T75培養(yǎng)瓶中加入5 mL 1640培養(yǎng)基(含2%FBS,下同),再加入200 μL病毒液,孵育1～2 h;補(bǔ)充5 mL 1640培養(yǎng)基,搖晃幾次后將T75培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中。每12 h觀察細(xì)胞病變,待細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí),開始收毒。將T75培養(yǎng)瓶置于-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融2次,吸取病毒液于50 mL離心管中,4 ℃、6 000 r·min-1離心1 h,取上清;使用0.22 μm過濾器過濾病毒液,分裝后凍存于-80 ℃冰箱中。接毒和收毒過程中所用相關(guān)器材及細(xì)胞廢液均進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。

1.3 添加FAdV-4物料轉(zhuǎn)化體系

1.3.1 添加FAdV-4雞糞轉(zhuǎn)化體系

稱取新鮮雞糞400 g分裝至9個(gè)2 L的小桶中,將FAdV-4添加至處理組和對照組(CK)雞糞中,空白組雞糞中不加FAdV-4,充分?jǐn)嚢杈鶆?用5點(diǎn)采樣法取約5 g雞糞作為第0 d樣品。向處理組和空白組雞糞中加入400頭7日齡BSFL,用4層醫(yī)用紗布覆蓋;每6 d在Ⅱ級生物安全柜中取樣檢測雞糞中FAdV-4含量,探究BSFL在轉(zhuǎn)化雞糞過程中對FAdV-4含量的影響。取樣完成后,取樣工具及產(chǎn)生的廢棄物均進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。

1.3.2 添加FAdV-4人工飼料轉(zhuǎn)化體系

將FAdV-4(含量9.75 log10copies·g-1)添加至200 g人工飼料中,處理組加入200頭6日齡BSFL,對照組(CK)不加BSFL,每組做3個(gè)重復(fù)。每天取樣檢測人工飼料中的FAdV-4含量,探究BSFL在轉(zhuǎn)化人工飼料過程中對FAdV-4含量的影響。

將FAdV-4(含量9.75 log10copies·g-1)添加至200 g人工飼料中,處理組分別加入400頭和800頭8日齡BSFL,對照組不加BSFL,每組做3個(gè)重復(fù)。每天取樣檢測人工飼料中的FAdV-4含量,進(jìn)一步探究BSFL轉(zhuǎn)化能力加強(qiáng)后對體系中FAdV-4消減效果的影響。

1.4 FAdV-4的含量檢測

1.4.1 引物設(shè)計(jì)

參考相關(guān)文獻(xiàn)中的引物并進(jìn)行電泳和測序驗(yàn)證以優(yōu)化堿基設(shè)計(jì),得到實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRCR)所用引物[23],引物和探針均由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下：F4F1：5′-TTACGCTTACGGTGCCTACGT-3′;F4R1：5′-CCGCGTTATTCATGATCCAGTA-3′ (89 bp);探針序列如下：FAM-CGACGGTTCCCAGTCCCTCACG-BHQ1。

1.4.2 病毒核酸提取方法的優(yōu)化

為了解決雞糞中核酸提取效果較差、核酸容易降解的問題,準(zhǔn)確定量雞糞中病毒核酸的含量,對雞糞樣品的處理和核酸提取方法進(jìn)行優(yōu)化。首先稱取各組雞糞1 g左右,加入3 mL生理鹽水,旋渦振蕩使其混勻,立即8 000 r·min-1離心20 min;吸取300 μL上清,使用天根生化科技(北京)有限公司的病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(DP315)提取核酸,洗脫操作有所調(diào)整,具體如下：向吸附膜滴加20 μL RNase-free ddH2O,蓋上蓋子,室溫放置5 min后13 000 r·min-1離心1 min,再滴加20 μL RNase-free ddH2O,重復(fù)操作1次,以提高核酸的洗脫率。將提取的核酸保存于-80 ℃冰箱中或置于冰上立即使用。使用糞便基因組DNA提取試劑盒(DP328)提取BSFL轉(zhuǎn)化后雞糞中的病毒DNA。

1.4.3 病毒cDNA合成

病毒RNA反轉(zhuǎn)錄使用南京諾唯贊生物科技有限公司的HiScript?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)試劑盒,具體操作如下：在1.5 mL RNase-free離心管中加入3 μL病毒RNA,再加入5 μL RNase-free ddH2O;65 ℃加熱5 min,迅速置于冰上驟冷,并在冰上靜置2 min。

1.4.4 TaqMan qPCR程序

FAdV-4質(zhì)粒檢測 qPCR 體系如下：10 μL 2×AceQ U+ Probe Master Mix;6.5 μL RNase-free ddH2O;0.5 μL/0.5 μL Primer F/R;0.5 μL TaqMan Probe;2 μL Plasmid Template。qPCR 反應(yīng)程序?yàn)椋何廴鞠?7 ℃ 2 min;預(yù)變性95 ℃ 10 min;變性95 ℃ 15 s,退火延伸60 ℃ 45 s,共40個(gè)循環(huán)。延伸階段結(jié)束時(shí)記錄熒光信號,使用Origin 2017繪圖軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 FAdV-4在BSFL消化道的分布檢測

將3組30頭7日齡BSFL放入20 g含F(xiàn)AdV-4的人工飼料中飼養(yǎng);轉(zhuǎn)化2 d后,對BSFL的消化系統(tǒng)進(jìn)行取樣,包括前胃段(從頭部到前腸)、中腸段和馬氏管至后腸段。將各分段組織進(jìn)行液氮反復(fù)凍融后提取核酸,特異性PCR后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測,評估BSFL轉(zhuǎn)化物料過程中FAdV-4在BSFL腸道中的分布情況。

1.6 雞糞菌群16S rDNA測序分析

對BSFL轉(zhuǎn)化未添加FAdV-4的雞糞空白組第0 d、第18 d的樣品(B0、B18)、BSFL轉(zhuǎn)化添加FAdV-4的雞糞處理組第6 d、第12 d、第18 d樣品(F06、F12、F18)以及只添加FAdV-4的雞糞對照組第6 d、第12 d、第18 d樣品(FC06、FC12、FC18)進(jìn)行 16S rDNA測序和多樣性分析(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。使用美吉生信云平臺(tái)(http：//cloud.majorbio.com)對測序結(jié)果進(jìn)行分析和制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSFL轉(zhuǎn)化添加FAdV-4雞糞

將雞糞樣品每6 d取樣提核酸后,采用TaqMan qPCR檢測BSFL轉(zhuǎn)化過程中雞糞中FAdV-4含量,結(jié)果如圖1所示。

圖1 BSFL轉(zhuǎn)化過程中雞糞中FAdV-4的含量變化Fig.1 Change of FAdV-4 content in chicken manure during BSFL transformation

由圖1可知,轉(zhuǎn)化18 d,BSFL處理組的雞糞中 FAdV-4 減少率(99.63%)明顯高于對照組(64.74%),表明BSFL轉(zhuǎn)化可以顯著降低雞糞中FAdV-4含量。

2.2 BSFL轉(zhuǎn)化添加FAdV-4人工飼料

利用200頭6日齡BSFL轉(zhuǎn)化添加FAdV-4的人工飼料8 d,并分別利用400頭8日齡和800頭8日齡BSFL轉(zhuǎn)化添加FAdV-4的人工飼料5 d,采用TaqMan qPCR檢測BSFL轉(zhuǎn)化過程中人工飼料中FAdV-4含量,結(jié)果如圖2所示。

圖2 BSFL轉(zhuǎn)化過程中人工飼料中FAdV-4的含量變化Fig.2 Change of FAdV-4 content in artificial materials during BSFL transformation

由圖2可知,與BSFL-200-6處理組的FAdV-4減少率(99.61%)相比,BSFL-400-8處理組(99.95%)和BSFL-800-8處理組(99.99%)的FAdV-4減少率更高,BSFL-800-8處理組第3 d就達(dá)到了BSFL-200-6處理組第8 d的病毒消減效果。表明,BSFL在轉(zhuǎn)化人工飼料中能顯著減少FAdV-4含量,且BSFL的轉(zhuǎn)化能力得到加強(qiáng)后對人工飼料中FAdV-4的消減效果更顯著。

2.3 水虻蟲糞對FAdV-4的消減效果

為了評估轉(zhuǎn)化后的物料是否影響FAdV-4的生存,分別稱取50 g未滅菌的BSFL轉(zhuǎn)化后的人工飼料(WMJ)及滅菌的BSFL轉(zhuǎn)化后的人工飼料(MJ),分裝至6個(gè)小白桶中,分別加入一定量的 FAdV-4 病毒液,每2 d取樣提核酸后,采用TaqMan qPCR檢測FAdV-4含量,結(jié)果如圖3所示。

圖3 轉(zhuǎn)化后人工飼料中FAdV-4的含量變化Fig.3 Change of FAdV-4 content in artificial materials after BSFL transformation

由圖3可知,在第6 d,未滅菌的轉(zhuǎn)化后人工飼料(WMJ)中FAdV-4減少率為94.09%,而滅菌的轉(zhuǎn)化后人工飼料(MJ)中FAdV-4減少率僅23.49%。表明,BSFL轉(zhuǎn)化后物料能顯著促進(jìn)FAdV-4的消減,并且轉(zhuǎn)化后物料中的微生物可能對BSFL的消減發(fā)揮了重要作用。

2.4 FAdV-4在BSFL消化道中的分布

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,結(jié)果如圖4所示。

M.50 bp marker 1～3.前胃段 4～6.中腸段 7～9.馬氏管至后腸段

由圖4可知,BSFL中腸段中明顯檢測到FAdV-4的存在,前胃段和馬氏管至后腸段中FAdV-4檢測無明顯條帶。表明,當(dāng)BSFL攝入FAdV-4時(shí),BSFL中腸的消化功能和微環(huán)境可能會(huì)破壞病毒結(jié)構(gòu),促進(jìn)對FAdV-4的消減作用。

2.5 BSFL轉(zhuǎn)化雞糞中細(xì)菌多樣性分析

2.5.1 雞糞中細(xì)菌OTU水平聚類結(jié)果分析

各組雞糞樣品細(xì)菌群落在OTU水平上的Alpha多樣性分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 細(xì)菌群落在OTU水平上的Alpha多樣性Fig.5 Alpha diversity of bacterial community at OTU level

由圖5可知,各組樣品微生物多樣性隨轉(zhuǎn)化時(shí)間延長呈遞減趨勢。第18 d,ACE指數(shù)大小順序?yàn)椋篎18

各組雞糞樣品基于OTU水平的Venn圖如圖6所示。

圖6 細(xì)菌群落基于OTU水平的Venn圖Fig.6 Venn diagram of bacterial community at OTU level

由圖6可知,樣品B0的OTU數(shù)量(692)最高,樣品F18的OTU數(shù)量(568)最低。OTU組成差異最大的2組樣品為B0和F18,共有OTU數(shù)量為404個(gè),各自獨(dú)有OTU數(shù)量為452個(gè);OTU組成差異最小的2組樣品為B18和F18,共有OTU數(shù)量為447個(gè),各自獨(dú)有 OTU數(shù)量為 322個(gè)。表明,與非處理對照組相比,BSFL轉(zhuǎn)化雞糞后能顯著降低雞糞中細(xì)菌多樣性。

2.5.2 雞糞中細(xì)菌在門水平上的組成及差異

各組雞糞樣品中細(xì)菌在門水平上的豐度如圖7所示。

圖7 細(xì)菌在門水平上的豐度Fig.7 Abundance of bacteria at phylum level

由圖7可知,各組樣品的細(xì)菌在門水平的主要分類為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、變形菌門(Proteobacteria)、異常球菌-棲熱菌門(Dei-nococcus-Thermus)、放線菌門(Actinobacteria)等,其中厚壁菌門和擬桿菌門的微生物占絕對優(yōu)勢。轉(zhuǎn)化過程中,各組樣品的厚壁菌門微生物豐度均下降,第18 d,F18(18.52%)

2.5.3 雞糞中細(xì)菌在屬水平上的組成及差異

各組雞糞樣品中細(xì)菌在屬水平上的熱圖如圖8所示,各組雞糞樣品中細(xì)菌在屬水平上前10的豐度如表1所示。

表1 各組雞糞樣品中細(xì)菌在屬水平前10的豐度/%

圖8 細(xì)菌在屬水平上的熱圖Fig.8 Heat map of bacteria at genus level

由圖8可知,大多數(shù)組樣品其擬桿菌門分類下的各屬豐度隨轉(zhuǎn)化時(shí)間延長而明顯升高,同時(shí)厚壁菌門分類下的大多數(shù)屬豐度隨轉(zhuǎn)化時(shí)間延長明顯降低。由表1可知,不同樣品部分屬物種豐度變化趨勢在不同時(shí)期差異較明顯。蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)的細(xì)菌在處理組樣品F12、F18中豐度均降低,而在對照組中其豐度無明顯變化。居綠藻菌屬(Ulvibacter)微生物豐度在處理組樣品F12、F18中均升高,轉(zhuǎn)化后期樣品F18中其豐度為21.86%,樣品B18中其豐度達(dá)到了15.74%,表明該菌可能在轉(zhuǎn)化雞糞過程中與BSFL有協(xié)同作用,共同促進(jìn)了有機(jī)廢棄物的降解。嗜蛋白菌屬(Proteiniphilum)微生物豐度在轉(zhuǎn)化過程中先升高后降低,在轉(zhuǎn)化中期的樣品F12中,其豐度達(dá)到最高,為12.35%。推測嗜蛋白菌屬可能以轉(zhuǎn)化過程中死亡的微生物為食,在轉(zhuǎn)化中期含量達(dá)到最高,該菌屬的大量繁殖使得雞糞中蛋白酶含量升高,從而促進(jìn)FAdV-4蛋白質(zhì)外殼降解,使FAdV-4含量降低。異常球菌-棲熱菌門的特呂珀菌屬(Truepera) 在BSFL轉(zhuǎn)化含F(xiàn)AdV-4的雞糞中豐度逐漸升高,在樣品F18中其豐度最高,達(dá)到21.12%,表明該時(shí)期生存環(huán)境可能較為惡劣,多數(shù)菌類生長受到抑制,而該菌由于出色的耐受性而豐度升高。隨轉(zhuǎn)化時(shí)間延長,BSFL處理組中假單胞菌屬(Pseudomonas)維持在較低豐度,而對照組中其豐度逐漸升高,在后期對照組樣品FC18中其豐度達(dá)到 10.28%。表明,BSFL轉(zhuǎn)化會(huì)抑制體系中假單胞菌生長。

2.5.4 雞糞中細(xì)菌在屬水平冗余分析

各組雞糞樣品中細(xì)菌(屬水平豐度前10物種)在屬水平冗余分析如圖9所示,其中主坐標(biāo)RDA1和RDA2差異貢獻(xiàn)值分別為19.06%和8.88%。

圖9 各組雞糞樣品中細(xì)菌在屬水平冗余分析Fig.9 Redundancy analysis of bacteria in each chicken manure groups at genus level

由圖9可知,FAdV-4消減量與各組樣品pH值變化無顯著相關(guān),處理組樣品F12、F18與FAdV-4消減量呈正相關(guān)。其中居綠藻菌屬(Ulvibacter)、特呂珀菌屬(Truepera) 細(xì)菌豐度變化與FAdV-4消減量呈正相關(guān)且相關(guān)性較大,蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、泰氏菌屬 (Tissierella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)細(xì)菌豐度變化與FAdV-4消減量呈負(fù)相關(guān)。表明,居綠藻菌屬、特呂珀菌屬在BSFL轉(zhuǎn)化體系中與FAdV-4消減密切相關(guān),BSFL轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在消減FAdV-4的同時(shí)能夠降低蘇黎世桿菌屬、泰氏菌屬、假單胞菌屬的豐度。

3 結(jié)論

研究了BSFL轉(zhuǎn)化對雞糞中禽類典型病毒FAdV-4的消減作用。結(jié)果表明,BSFL轉(zhuǎn)化能夠顯著消減雞糞中的FAdV-4群體載量,并且增加BSFL接種量和日齡能夠增強(qiáng)其對FAdV-4的消減作用。BSFL轉(zhuǎn)化使物料中的細(xì)菌多樣性顯著降低,其中居綠藻菌屬、特呂珀菌屬與FAdV-4消減量呈正相關(guān)且相關(guān)性較大,推測這2類細(xì)菌與BSFL協(xié)同參與了對FAdV-4的影響過程。由此表明BSFL生物轉(zhuǎn)化技術(shù)能夠在資源化利用雞糞等有機(jī)廢棄物的同時(shí),在一定程度上實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物的無害化,減少病原體的傳播風(fēng)險(xiǎn)。