董燕 金曉燕 胡慧娣

胸腔積液細胞蠟塊技術日漸成熟,國外已將其作為細胞學常規(guī)診斷技術,目前在國內大型醫(yī)院運用的也越來越多[1]。胸腔積液是癌癥晚期患者常見的臨床表現,其中肺癌最常見[2]。對于細胞學涂片細胞量較少者、或難以通過活檢及手術獲取組織標本以及無法明確腫瘤來源的標本,胸腔積液細胞蠟塊技術結合免疫組化及分子檢測明顯提高了診斷的準確性和特異度[3]。本文回顧性分析248例胸腔積液患者,制備細胞蠟塊并行免疫組化及分子檢測,以提高臨床及病理醫(yī)師對細胞蠟塊技術在病理診斷、鑒別腫瘤來源及指導靶向治療中應用的認知。

資料與方法

一、臨床資料

收集南京市胸科醫(yī)院于2018年12月～2022年7月期間通過常規(guī)細胞學或液基細胞學證實的惡性或可疑惡性胸腔積液的248例患者,其中男性119例,女性129例,男女比例約為12 ∶13,年齡30～93歲,平均64歲。248例病例后期均行活檢或手術切除,以組織病理學診斷結果為金標準。本研究獲得我院倫理委員會批準(2023-KL0015-01)。

二、方法

1. 液基細胞學及常規(guī)細胞學涂片

液基細胞學：將臨床胸腔穿刺抽取(n=62)和引流袋(n=186)收集的胸水在4小時內進行如下處理：先將胸水混勻,取50～100mL離心沉淀后,經BD沉降式制片染色儀,按操作步驟進行制片,巴氏染色,封片,閱片。常規(guī)細胞學涂片：將胸腔積液混勻后取10mL離心,棄上清后將沉淀物均勻涂在玻片上,95%乙醇固定10min后,HE染色,封片,閱片。經處理后剩余的胸水置于4 ℃冰箱保存,用于細胞蠟塊的制備。

2. 細胞蠟塊的制作

將細胞學制片后剩余的胸腔積液置入50mL離心管中,離心機2000r/min,離心5min,棄上清,保留沉淀物(如沉淀物量不足可多次離心收集)。若為血性標本,加入3%冰醋酸乙醇液10mL,振蕩均勻,離心機2000r/min,離心5min,去除紅細胞,保留沉淀物。再向沉淀物中加入95%乙醇固定30min后,離心機2000r/min,離心10min后,棄上清,底部沉淀物用竹簽取出,擦鏡紙包好,常規(guī)組織處理儀進行脫水、浸蠟、包埋制成細胞蠟塊。常規(guī)切片、染色、封片、閱片。

3. 免疫組織化學

將細胞蠟塊切成4um的蠟片,用Roche BENCHMARK全自動免疫組化儀進行染色,一抗包括CK,CEA,CK7,CK5/6,CK20,EMA,NapsinA,TTF-1,P40,P63,WT-1,CR,SYN,CGA,CDX2,Villin,LCA,CD20,CD45,CD79α,CD56,CD3,ER,PR,GCDFP15,CA125,D2-40,PSA,Ki-67,所有一抗均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司,二抗及顯色試劑均為Roche 公司免疫組化儀配套試劑。PD-L1(22C3)試劑購自于美國安捷倫科技有限公司(DAKO公司),并由高年資病理醫(yī)師按照PD-L1判讀標準進行腫瘤比例評分(TPS),即部分或完整膜染色(≥1%)的腫瘤細胞占樣本中存在的所有腫瘤細胞的百分比。結果判讀：當TPS<1%時無PD-L1表達;TPS在1%～49%之間時PD-L1低-中等強度表達;TPS≥50%時PD-L1高表達。所有實驗均設陰性及陽性對照,實驗操作嚴格按照說明書進行。

4. 熒光定量微滴式數字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法及二代測序法(Next Generation Sequencing,NGS)

①ddPCR法：47例細胞蠟塊樣本使用人類EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)進行基因檢測,該試劑盒基于擴增阻礙突變系統(tǒng)(Amplification Refractory Mutaion System,ARMS)和熒光PCR技術實現樣本DNA中EGFR基因的突變檢測。取3-8張5μm石蠟切片進行DNA提取,DNA推薦濃度在2-3ng/μL,隨后在基因公司進行檢測。②NGS：33例細胞蠟塊樣本使用高通量測序技術進行全基因組分析。提取細胞蠟塊中的總RNA進行逆轉錄后再加以修飾,構建cDNA文庫。檢測試劑盒均來自于深圳華大基因科技有限公司,并在該公司進行分子檢測。

三、統(tǒng)計學方法

運用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析,所有實驗數據至少進行三次獨立重復試驗,兩種方法比較采用診斷一致性檢驗(Kappa)分析,評價此兩種檢查方法是否有本質的不同。Kappa值>0.6時,表示一致性較可靠,Kappa值≤0.6時,表示一致性較差。P值<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、常規(guī)細胞學組

細胞學組中腫瘤細胞量少,細胞存在嚴重的堆積重疊現象,細胞結構不清,難以辨別細胞核和染色質等,背景可見較多雜質(圖1,5,9,13)。

二、細胞蠟塊組

與常規(guī)細胞學組相比,細胞蠟塊組中腺癌細胞常聚集成團,呈三維立體結構,外緣花瓣狀,光滑,界限多清楚,可出現腺樣、花球狀,乳頭狀結構,細胞核偏位、染色質粗糙,有核仁,胞質內可出現黏液空泡(圖2)。以肺腺癌為最多見。其次多見的是乳腺癌,結直腸腺癌,卵巢癌。乳腺小葉癌及胃癌可見“印戒細胞”;乳腺導管癌可見細胞球團結構,腺腔樣,梅花樣,核圓形或橢圓形(圖6);結直腸腺癌細胞可呈柵欄狀排列,形成細胞條索;漿液性腺癌伴沙礫體可提示為卵巢來源可能。腺癌細胞分化差時可散在分布,核異型性大,核仁明顯。少見腫瘤有肺鱗狀細胞癌,肺小細胞癌等。胸腔積液中的角化型鱗狀細胞癌比較少見,其形態(tài)學表現：細胞單個散在或聚集,多形性明顯,細胞核增大,不規(guī)則,深染,胞質嗜伊紅(圖10)。在胸腔積液中的非角化型鱗狀細胞癌較角化型鱗狀細胞癌常見,其細胞聚集成團,胞界不清,與腺癌細胞難以區(qū)分。胸腔積液中的小細胞癌形態(tài)學特征：細胞單個分散或緊密成群,鑲嵌樣排列;也可聚集成團呈“洋蔥皮”樣、“列兵樣”排列;核染色質深,椒鹽樣,核仁不明顯,胞質少,核質比高。間皮瘤細胞形態(tài)學特征(圖14)：細胞豐富,單個散在或成團,成團者可表現為扇形花邊樣的立體球狀、乳頭狀或假腺泡樣結構,細胞間可見“開窗”現象。瘤細胞較間皮細胞大,較腺癌細胞異型性小,核居中,邊緣淡染。淋巴瘤細胞豐富,平鋪,大小一致,呈圓形或卵圓形,胞質少,核染色質顆粒狀。

三、常規(guī)細胞學組或細胞蠟塊組檢查結果比較

將248例胸腔積液標本經常規(guī)細胞學和細胞蠟塊學檢查,248例胸腔積液經組織學病理診斷為惡性腫瘤者240例,良性腫瘤者8例。常規(guī)細胞學組中惡性胸腔積液者212例,未能明確診斷者36例,細胞蠟塊組中惡性胸腔積液者240例,8例未明確診斷胸腔積液中7例為良性胸水,1例惡性胸腔積液組織學病理診斷為良性腫瘤。常規(guī)細胞學組中惡性胸腔積液者212例,36例未明確診斷胸腔積液中30例為惡性胸腔積液,2例惡性胸腔積液組織學病理診斷為良性腫瘤(見表1)。常規(guī)細胞學檢測和細胞蠟塊學檢測惡性胸腔積液的靈敏度、特異度及準確性分別為87%、75%、87%和99%、87%、99%。常規(guī)細胞學組與細胞蠟塊組兩種診斷方法存在一致性,但一致性較差(Kappa值為0.269)。常規(guī)細胞學和細胞蠟塊診斷之間具有顯著差異(P<0.05)。

表1 常規(guī)細胞學組或細胞蠟塊學組診斷結果

四、細胞蠟塊結合免疫組化后診斷結果

經Roche BENCHMARK全自動免疫組化儀染色證實肺腺癌211例;肺小細胞癌4例;肺鱗狀細胞癌2例;找到惡性腫瘤細胞需排除其它來源23例,其中食管鱗癌1例,乳腺癌2例,胃腸道來源8例,惡性間皮瘤1例,淋巴造血系統(tǒng)腫瘤2例,卵巢來源6例,因細胞蠟塊中腫瘤細胞數量少或標記不理想未能確定來源者3例;間皮增生8例(表2),肺腺癌通常CK7(圖3),TTF-1(圖4),NapsinA均陽性;乳腺癌通常GCDFP15(圖7),CK7均呈陽性,不同程度表達ER(圖8),PR;胃腸道腺癌通常CK20,CDX2,Villin陽性;肺鱗狀細胞癌通常CK5/6,P63(圖11),P40(圖12)陽性;肺小細胞癌通常表達TTF-1,SYN,CGA,CD56陽性;惡性間皮瘤通常CK5/6,WT-1(圖15),CR(圖16),D2-40,EMA陽性;淋巴造血系統(tǒng)腫瘤通常表達LCA,CD3,CD20等。

表2 細胞蠟塊免疫組化診斷結果

五、細胞蠟塊結合分子檢測技術結果

80例患者胸水細胞蠟塊行ddPCR及NGS檢測,其中27例出現EGFR基因突變(圖17)(EGFR 第18號外顯子p.G719A突變1例,EGFR第20號外顯子p.T790M突變3例,EGFR第19號外顯子19del突變4例,EGFR第19號外顯子 p.L747_A750delinsP突變2例,EGFR 第19號外顯子p.E746_A750del突變1例,EGFR 第21號外顯子p.L861Q突變1例,EGFR 第21號外顯子p.L858R突變15例)。KRAS基因突變3例、TP53基因突變4例、NF2基因突變1例及BRAF第15號外顯子 p.V600E基因突變1例。EML4-ALK基因融合1例。26例細胞蠟塊行免疫組化PD-L1檢測,7例檢出陽性(5例PD-L1呈低-中等強度表達,2例PD-L1呈高表達)。

圖1-16 胸腔積液常規(guī)細胞學形態(tài)及細胞蠟塊學形態(tài)和免疫表型 圖1,5,9,13：分別為常規(guī)細胞學中肺腺癌,乳腺癌,鱗癌和間皮瘤細胞學形態(tài),細胞數量少,細胞堆積重疊,細胞排列及染色質結構不清,小圖為HE高倍放大;圖2：胸水細胞蠟塊中肺腺癌細胞呈三維立體結構,外緣花瓣狀,HE中倍放大,小圖為HE高倍放大;圖3,4：癌細胞CK7和TTF-1呈強陽性表達;圖6：胸水細胞蠟塊中乳腺癌細胞可見細胞球團結構,腺腔樣,梅花樣,核圓形或橢圓形,HE中倍放大,小圖為HE高倍放大;圖7,8：癌細胞高表達GCDFP15和ER,HE中倍放大;圖10：胸水細胞蠟塊中癌細胞單個散在或松散聚集,細胞核增大,深染,胞質紅染,HE中倍放大,小圖為HE高倍放大;圖11,12：癌細胞表達P63和P40,HE中倍放大;圖14：胸水細胞蠟塊中間皮瘤細胞豐富,單個散在或成團,成團者表現為扇形花邊樣的立體球狀或假腺泡樣結構,細胞間可見“開窗”現象,HE中倍放大,小圖為HE高倍放大;圖15,16：腫瘤細胞WT-1和CR表達陽性

圖17 ddPCR基因檢測EGFR p.L858R突變陽性(藍色信號)

討 論

胸腔積液是惡性腫瘤的常見臨床體征。胸水的脫落細胞學檢查是判斷良、惡性的主要手段[4]。傳統(tǒng)的細胞學檢查及液基細胞學方法雖快速、簡單、經濟,但有時由于收集的細胞量少,涂片易厚薄不均,細胞形態(tài)不典型,背景雜質多,給診斷帶來困擾[5],鑒別腫瘤細胞來源困難無法給臨床提供更多有效的信息。細胞蠟塊包埋技術在許多國家已成為細胞學常規(guī)診斷技術[1]?；仡櫺苑治鑫以簮盒曰蚩梢蓯盒孕厍环e液標本248 例,對常規(guī)細胞學或液基細胞學與細胞蠟塊HE染色進行對比,結果顯示細胞蠟塊中腫瘤細胞數量多,細胞結構清晰,并能形成一定的組織學結構和排列,有利于細胞學診斷,從而提高細胞學診斷的靈敏度和準確性[6,7]。在胸腔積液中,腺癌約占90%以上,以肺癌最為多見。腺癌細胞形態(tài)多樣,可單個散在也可成團排列。單個散在的腫瘤細胞增大,核漿比倒置,核膜不規(guī)則,染色質增粗,可有核仁及核內假包涵體。成團的腫瘤細胞可呈乳頭狀,花環(huán)狀,彩團狀,腺腔樣等,具有三維立體結構。這些形態(tài)在肺癌,乳腺癌,卵巢癌中具有相似的形態(tài)學特征,僅靠光鏡觀察形態(tài)不易明確診斷。

隨著細胞學技術的迅速發(fā)展,免疫組化技術已逐步應用于細胞學的診斷中[8]。用常規(guī)涂片或液基細胞學做免疫細胞化學染色,常因收集的細胞數量少,不足以明確診斷[9];或因背景較臟容易造成非特異性染色,影響病理醫(yī)師的判斷。而細胞蠟塊的優(yōu)點是可以做連續(xù)切片,切片數量多可以滿足診斷的需要。常規(guī)細胞學組與細胞蠟塊組兩種診斷方法存在一致性,但一致性較低。相較于常規(guī)細胞學,細胞蠟塊具有一定的診斷價值(P<0.05),對細胞學陰性者,或可作為良好的補充。

結合免疫組化染色,可以幫助判斷惡性腫瘤細胞的來源,為臨床的治療提供依據[10]。本組實驗中248例惡性胸腔積液大多能明確判斷腫瘤細胞的類型和來源。與常規(guī)細胞學相比,細胞蠟塊技術提高了診斷的準確性,靈敏度和特異度。其中常規(guī)細胞學診斷為可疑腫瘤細胞22例和核異型細胞7例經細胞蠟塊免疫組化檢測后均能被明確診斷為惡性腫瘤細胞,1例少數異型細胞被明確為間皮細胞增生。29例明確為惡性腫瘤細胞,其中肺鱗癌2例,小細胞癌4例,食管鱗癌1例,乳腺癌2例,胃腸道腺癌8例,惡性間皮瘤1例,淋巴造血系統(tǒng)腫瘤2例,卵巢癌6例,僅有3例細胞蠟塊診斷為惡性腫瘤,但因細胞蠟塊中腫瘤細胞數量少或標記不理想未能明確腫瘤來源。

隨著分子生物學的快速發(fā)展,分子靶向治療和免疫治療已廣泛應用于臨床[11,12]。對于惡性腫瘤晚期患者,如何獲取可靠的檢測樣本至關重要[13]。文獻報道,盡管腫瘤組織標本是分子病理診斷的首選,但對于大多數癌癥晚期患者來說,胸腔積液和細胞液體活檢似乎是其唯一可獲取的樣本[14]。此外,原發(fā)腫瘤組織與胸腔積液樣本之間基因突變具有高度一致性,特別是肺腺癌EGFR的基因突變[15]。近年來,程序性死亡配體1(PD-L1)抑制劑在多種實體腫瘤免疫治療中表現出優(yōu)越的臨床療效,包括非小細胞肺癌(NSCLC)[16]。然而目前關于胸腔積液細胞蠟塊行PD-L1免疫組化的數據量較少[17]。

本組80例患者中47例胸水細胞蠟塊行ddPCR基因檢測,33例胸水細胞蠟塊行二代測序(NGS)檢測。分子基因檢測陽性患者37例,約占46%,以EGFR突變最常見(約為34%),略低于文獻報道[18]。本組EGFR突變以EGFR第21號外顯子p.L858R突變?yōu)橹?。其?例惡性間皮瘤患者發(fā)生NF1突變。1例胸水蠟塊免疫組化ALK陽性的患者經基因檢測證實為EML4-ALK融合。其中26例患者行免疫組化PD-L1檢測,檢出陽性者7例(約為27%),且TPS評分PD-L1高表達的患者為1例肺腺癌和1例肺鱗癌,低于胸腔積液細胞蠟塊免疫組化PD-L1檢出率[19]。我們分析其原因可能是胸水細胞塊檢測PD-L1的檢測樣本數量不足,或由于本組研究中胸腔積液以肺腺癌原發(fā)為主,肺鱗癌少見。由此可見,難以耐受手術或活檢的癌癥晚期患者,胸水細胞蠟塊行分子檢測技術可以滿足臨床診斷、精準化治療和預后評估的需求。

綜上所述,細胞蠟塊結合免疫組織化學及分子檢測技術可提高胸腔積液常規(guī)細胞學診斷的靈敏度和準確性,在明確腫瘤細胞來源的基礎上,進一步為臨床靶向治療及預后評估提供可靠的依據。