張路路, 謝銳, 廖志敏, 吳剛, 萬(wàn)波, 孫威, 周蓮紅

涼山州第二人民醫(yī)院 1腎內(nèi)科, 2檢驗(yàn)科(四川涼山 615000)

狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的主要并發(fā)癥,也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。從腎臟病理組織的角度來(lái)講,已確診的SLE患者約35%～75%表現(xiàn)為腎臟受累,導(dǎo)致SLE患者發(fā)生腎功能衰竭,對(duì)SLE患者的生命健康威脅極大[1]。LN發(fā)病率約占SLE患者的38%,主要病因是腎系膜細(xì)胞的過(guò)度增殖,從而引起炎癥因子的大量釋放,使得炎癥加重并導(dǎo)致腎小球硬化[2]。目前,LN的發(fā)病率逐年增加,臨床上通常采用藥物治療緩解患者的病情進(jìn)展,并不能徹底將其治愈[3]。因此,探究LN的具體作用機(jī)制對(duì)提高患者治愈率來(lái)說(shuō)非常重要。有研究表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)能夠通過(guò)與微小RNA(microRNA,miRNA)結(jié)合來(lái)調(diào)控下游基因的表達(dá)從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程[4]。核旁叢組裝轉(zhuǎn)錄本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)是新發(fā)現(xiàn)的LncRNA。有研究顯示,NEAT1下調(diào)通過(guò)吞噬miR-128抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的炎癥和氧化應(yīng)激[5];NEAT1過(guò)表達(dá)不僅能夠通過(guò)靶向miR-204和激活核因子-κB(NF-κB)通路加重脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[6],也能通過(guò)HMGB1/RAGE信號(hào)通路誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷和炎癥的發(fā)生[7],還能夠吸附miR-139-5p來(lái)調(diào)控肝纖維化過(guò)程[8]。此外,NEAT1通過(guò)靶向miR-146b促進(jìn)TRAF6的表達(dá),加速LN腎系膜細(xì)胞損傷[9]。最近的研究[10]顯示,在急性肺損傷中,NEAT1與miR-182-5p存在靶向關(guān)系,NEAT1過(guò)表達(dá)可抑制其細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。miR-182-5p被證明與LN的進(jìn)展有關(guān),可調(diào)節(jié)腎臟纖維化[11]。然而,NEAT1與miR-182-5p在LN腎系膜細(xì)胞中的作用關(guān)系還不清楚。此外,叉頭盒蛋白O1(forkhead box O1,FoxO1)在LN患者和LN小鼠中處于激活狀態(tài),說(shuō)明FoxO1對(duì)LN進(jìn)展起促進(jìn)作用,而β-連環(huán)蛋白(β-catenin)位于FoxO1的下游,二者在炎癥環(huán)境下相互作用,FoxO1缺失會(huì)破壞FoxO1-β-catenin軸,進(jìn)而阻礙炎癥的發(fā)生[12-13]。因此,本研究基于FoxO1/β-catenin通路,探討NEAT1對(duì)LN腎系膜細(xì)胞損傷的影響及其與miR-182-5p的調(diào)控關(guān)系,進(jìn)一步揭示其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人腎系膜細(xì)胞株,購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司;NEAT1小干擾RNA或過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒(si-NEAT1/pcDNA-NEAT1)及相應(yīng)對(duì)照(si-NC/pcDNA)、miR-182-5p模擬物(miR-182-5p mimics)和陰性對(duì)照miR-NC、miR-182-5p抑制物(anti-miR-182-5p)及陰性對(duì)照anti-miR-NC,購(gòu)自上海生工生物公司;兔抗鼠FoxO1、β-catenin多克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗、酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;Lipofectamine2000試劑、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II試劑盒,購(gòu)自南京諾唯贊公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit 8,CCK-8)試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,購(gòu)自上海碧云天生物公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;超凈工作臺(tái)、實(shí)時(shí)定量PCR儀,購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.1.2 臨床樣本來(lái)源 收集2019年3月至2021年7月在涼山州第二人民醫(yī)院接受治療的32例經(jīng)過(guò)腎穿確診的LN患者外周血,稱為L(zhǎng)N組。其中,5例為Ⅰ型,8例為Ⅱ型,13例為Ⅲ型,6例為Ⅳ型。LN患者均符合1982年修訂的美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)SLE分類標(biāo)準(zhǔn),并且SLEDAI積分均>10分。按照SLEDAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估疾病活動(dòng)情況,同時(shí)符合排除標(biāo)準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)藥物性狼瘡;(2)孕婦及哺乳期婦女;(3)合并其他自身免疫性疾病;(4)合并嚴(yán)重心、肺、腎臟等重要臟器病變及血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)疾病;(5)慢性感染及近期感染史;(6)惡性腫瘤。

同時(shí),收集同期在本院體檢的32例健康者的外周血,稱為對(duì)照組。分別分離外周血單個(gè)核細(xì)胞和血清,置于-80℃冰箱保存待用。本研究方案經(jīng)涼山州第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行(倫審科2019第(97)號(hào)),所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞模型的制備、轉(zhuǎn)染及分組 取出凍存的腎系膜細(xì)胞復(fù)蘇,于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng),在超凈工作臺(tái)中,向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入10%正常人血清和10%、15%、20% Ⅳ型LN患者血清繼續(xù)培養(yǎng)[14],96 h后,收集細(xì)胞,建立LN腎系膜細(xì)胞。然后用5 μg/mL細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)[9]處理LN腎系膜細(xì)胞8 h。將構(gòu)建好的LN腎系細(xì)胞膜采用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并隨機(jī)分組為:對(duì)照組(正常培養(yǎng),不轉(zhuǎn)染)、模型組(細(xì)胞中加入5 μg/mL 脂多糖繼續(xù)培養(yǎng))、si-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC后加入5 μg/mL 脂多糖繼續(xù)培養(yǎng))、si-NEAT1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NEAT1后加入5 μg/mL 脂多糖繼續(xù)培養(yǎng))、si-NEAT1+anti-miR-NC組(細(xì)胞共轉(zhuǎn)染si-NEAT1和anti-miR-NC后加入5 μg/mL 脂多糖繼續(xù)培養(yǎng))、si-NEAT1+anti-miR-182-5p組(細(xì)胞共轉(zhuǎn)染si-NEAT1和anti-miR-182-5p后加入5 μg/mL 脂多糖繼續(xù)培養(yǎng))。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) 取LN組和對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒把提取的外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后,根據(jù)qRT-PCR儀的使用說(shuō)明利用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒和特異性的定量引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH或U6作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算NEAT1以及miR-182-5p、FoxO1、β-catenin mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 對(duì)臨床患者的血清和轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞利用相關(guān)ELISA試劑盒檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子:腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的濃度。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后的各組腎系膜細(xì)胞,將其置于96孔細(xì)胞板(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)中過(guò)夜培養(yǎng)。然后,分別加入CCK-8(5 mg/mL)試劑10 μL,室溫下,繼續(xù)培養(yǎng)3 h。使用酶標(biāo)儀,在450 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將收集好的各組腎系膜細(xì)胞制備成懸浮液,依次加入Annexin V-FITC和PI溶液,避光反應(yīng)15 min,接著使用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 LDH分析 收集各組細(xì)胞上清液,使用LDH檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)LDH含量。

1.2.7 免疫印跡分析 提取細(xì)胞總蛋白并對(duì)其定量,接著使用SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分離,然后轉(zhuǎn)膜,再加入脫脂奶粉進(jìn)行封閉,1 h后,加入FoxO1、β-catenin、GAPDH一抗,次日加入對(duì)應(yīng)二抗,使用ECL系統(tǒng)分析各組蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組比較采用成組t檢驗(yàn)(含校正t檢驗(yàn)),多組比較采用單因素方差分析+兩兩比較HSD-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LN患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NEAT1、miR-182-5p、FoxO1和β-catenin mRNA的表達(dá)水平 與對(duì)照組比較,LN組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NEAT1、FoxO1和β-catenin mRNA表達(dá)水平均顯著上升,miR-182-5p表達(dá)水平顯著下降(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組NEAT1、miR-182-5p、FoxO1和β-catenin表達(dá)水平

2.2 LN患者血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量 LN組患者血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組TNF-α、IL-6和IL-1β的含量

2.3 LN腎系膜細(xì)胞模型建立 與10%健康者血清組比較,10%、15%、20% LN患者血清組細(xì)胞活力均顯著升高(P<0.05),由于20% LN患者血清組細(xì)胞活力最高,故選擇20% LN患者血清誘導(dǎo)的LN腎系膜細(xì)胞模型,見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞活力比較

2.4 敲低NEAT1對(duì)LN腎系膜細(xì)胞模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與對(duì)照組相比,模型組中NEAT1表達(dá)水平明顯升高,miR-182-5p表達(dá)水平明顯降低,細(xì)胞活力顯著上升(P<0.05);與模型組和si-NC組相比,si-NEAT1組中NEAT1表達(dá)水平和細(xì)胞活力明顯降低,miR-182-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與si-NEAT1組和si-NEAT1+anti-miR-NC組比較,si-NEAT1+anti-miR-182-5p組中NEAT1表達(dá)水平和細(xì)胞活力顯著上升,miR-182-5p表達(dá)水平顯著下降(P<0.05);而各組細(xì)胞之間凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖1、表5。

2.5 敲低NEAT1對(duì)LN腎系膜細(xì)胞模型中炎癥因子的影響 較對(duì)照組而言,模型組中LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量均明顯升高(P<0.05);si-NEAT1組中LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量明顯低于si-NC組和模型組(P<0.05);si-NEAT1+anti-miR-182-5p組中LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量顯著高于si-NEAT1+anti-miR-NC組和si-NEAT1組(P<0.05),見(jiàn)表6。

2.6 各組細(xì)胞中FoxO1和β-catenin蛋白表達(dá)比較 模型組中FoxO1和β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05);si-NEAT1組中FoxO1和β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯低于si-NC組和模型組(P<0.05);si-NEAT1+anti-miR-182-5p組中FoxO1和β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著高于si-NEAT1+anti-miR-NC組和si-NEAT1組(P<0.05),而si-NC組和模型組、si-NEAT1+anti-miR-NC組和si-NEAT1組間比較的FoxO1和β-catenin蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表7。

注:A:對(duì)照組;B:模型組;C:si-NC組;D:si-NEAT1組;E:si-NEAT1+anti-miR-NC組;F:si-NEAT1+anti-miR-182-5p組

表5 敲低NEAT1對(duì)LN腎系膜細(xì)胞模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響

表6 敲低NEAT1對(duì)LN腎系膜細(xì)胞模型中炎癥因子的影響

3 討論

LN是導(dǎo)致SLE發(fā)病和致死的重要原因[15],目前LN患者的治療方式主要是利用免疫抑制劑、B細(xì)胞調(diào)節(jié)療法或鈣調(diào)磷酸酶抑制劑[16]。有研究表明,LncRNA與多種疾病包括LN的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道[17],LncRNA NEAT1在敗血癥肝損傷患者中高表達(dá),且抑制NEAT1表達(dá)可降低體外炎癥細(xì)胞因子的水平。在非酒精性脂肪肝模型中,NEAT1表達(dá)上調(diào),其過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶向調(diào)控miR-146a-5p進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)積累[18];另外,NEAT1和miR-140協(xié)同作用可加劇非酒精性脂肪肝進(jìn)展[19]。Zhang等[20]的研究顯示,NEAT1在SLE患者中高表達(dá),NEAT1表達(dá)的增加可能導(dǎo)致SLE患者產(chǎn)生IL-6等大量細(xì)胞因子和趨化因子。而且,在LN中NEAT1可加速腎系膜細(xì)胞損傷[9]。但是,其在LN中的分子機(jī)制尚不完全清楚。因此,本研究首先以收集的LN患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞和血清為研究對(duì)象來(lái)檢測(cè)NEAT1和炎癥因子的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,LN組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NEAT1表達(dá)水平和血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著上升,說(shuō)明NEAT1促進(jìn)LN發(fā)展。腎系膜細(xì)胞可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng),能夠影響炎癥環(huán)境,是致使LN發(fā)生腎小球纖維化損傷的重要因素。本研究通過(guò)向腎系膜細(xì)胞中加入10%正常人血清和10%、15%、20%的Ⅳ型LN患者血清繼續(xù)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)20% LN患者血清組細(xì)胞活力最高。因此,本研究選擇20% LN患者血清來(lái)構(gòu)建LN腎系膜細(xì)胞模型。接著,本研究采用LPS誘導(dǎo)LN腎系膜細(xì)胞,結(jié)果顯示,模型組細(xì)胞活力顯著升高,炎癥因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)含量明顯增加,揭示LPS可促進(jìn)LN腎系膜細(xì)胞增殖和炎癥因子的釋放,而細(xì)胞損傷標(biāo)志物L(fēng)DH含量的顯著升高,說(shuō)明LPS能夠促進(jìn)LN腎系膜細(xì)胞損傷,提示體外LN腎系膜細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。

注:A:對(duì)照組;B:模型組;C:si-NC組;D:si-NEAT1組;E:si-NEAT1+anti-miR-NC組;F:si-NEAT1+anti-miR-182-5p組

表7 各組細(xì)胞中FoxO1和β-catenin蛋白表達(dá)比較

LncRNA通常與miRNA相互作用進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、損傷等過(guò)程[21]。已有研究[10]表明,NEAT1靶向負(fù)調(diào)控miR-182-5p水平,敲低NEAT1能改善急性肺損傷進(jìn)展。另外,Zhu等[22]研究也表明,在LPS刺激的急性肺損傷小鼠和RAW264.7細(xì)胞中,miR-182-5p表達(dá)降低,且其過(guò)表達(dá)可通過(guò)減少炎癥因子的釋放而抑制炎癥反應(yīng)。而miR-182-5p在LN中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11]。故本研究以NEAT1和miR-182-5p的靶向關(guān)系為基礎(chǔ),進(jìn)而探討二者在LN腎系膜細(xì)胞損傷中的作用和調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示,LN患者外周血單個(gè)核細(xì)胞和LN腎系膜細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)均顯著升高,miR-182-5p的表達(dá)均顯著降低,二者趨勢(shì)正好相反,提示在LN中,NEAT1可能通過(guò)調(diào)控miR-182-5p發(fā)揮作用。敲低NEAT1后,細(xì)胞中NEAT1表達(dá)水平、細(xì)胞活力以及LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量均明顯降低,miR-182-5p表達(dá)水平顯著升高,凋亡率差異不大,說(shuō)明抑制NEAT1表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而在敲低NEAT1的基礎(chǔ)上抑制miR-182-5p表達(dá)后,細(xì)胞活力及LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著上升,但凋亡率無(wú)明顯變化,揭示抑制miR-182-5p表達(dá)可減弱NEAT1敲低對(duì)LN腎系膜細(xì)胞損傷模型細(xì)胞增殖和炎癥因子的影響,進(jìn)一步表明敲低NEAT1通過(guò)靶向調(diào)節(jié)miR-182-5p水平減輕了LN腎系膜細(xì)胞模型細(xì)胞損傷。但是,NEAT1靶向miR-182-5p減輕細(xì)胞損傷的具體機(jī)制還不清楚,還需進(jìn)一步研究。

Wang等[11]研究表明,FoxO1在SLE患者中高表達(dá),既是miR-182-5p的靶基因,也是腎功能的保護(hù)因子;同時(shí),Wang等[23]發(fā)現(xiàn),LINC01018能夠通過(guò)吞噬miR-182-5p上調(diào)FoxO1,抑制肝癌細(xì)胞的增殖和周期進(jìn)展。而FoxO1/β-catenin通路與氧化應(yīng)激過(guò)程關(guān)系密切,抑制FoxO1/β-catenin通路能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡和損傷[24]。FoxO1與β-catenin協(xié)同作用,激活Wnt/β-catenin信號(hào)進(jìn)而促進(jìn)肝癌進(jìn)展[25]。LPS刺激后巨噬細(xì)胞中Foxol和β-catenin蛋白表達(dá)增加,髓系FoxO1缺失消除了FoxO1與β-catenin的相互作用,進(jìn)而抵抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn),FoxO1和β-catenin mRNA表達(dá)水平在LN組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中明顯升高;敲低NEAT1后,FoxO1和β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯降低,而抑制miR-182-5p表達(dá)可減弱NEAT1敲低對(duì)FoxO1和β-catenin蛋白表達(dá)的影響,揭示敲低NEAT1通過(guò)靶向上調(diào)miR-182-5p表達(dá),抑制FoxO1和β-catenin蛋白表達(dá),進(jìn)而減輕LN腎系膜細(xì)胞模型的細(xì)胞損傷。

綜上所述,敲低NEAT1可通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-182-5p表達(dá),抑制LN腎系膜細(xì)胞過(guò)度增殖,降低炎癥反應(yīng),其可能與FoxO1、β-catenin下調(diào)表達(dá)有關(guān),NEAT1有望成為L(zhǎng)N治療的靶標(biāo),為研究LN的發(fā)展機(jī)制提供新思路。但是,本研究還存在一些不足之處,首先,LN患者血清中本身可能存在較高的炎癥因子水平,而本研究以LN患者血清建立的體外LN腎系膜細(xì)胞模型為基礎(chǔ)來(lái)觀察LPS誘導(dǎo)后炎癥因子的表達(dá)情況,并不能完全排除血清本身的影響。其次,本研究只是在體外探討了NEAT1的功能,NEAT1在體內(nèi)是否具有同樣的作用還需進(jìn)一步研究。

利益相關(guān)聲明:所有作者聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明:張路路進(jìn)行了論文選題、試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)采集及論文初稿撰寫(xiě)等工作。謝銳和廖志敏為實(shí)施試驗(yàn)、數(shù)據(jù)提取、數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)分析提供了協(xié)助。吳剛和萬(wàn)波進(jìn)行了文獻(xiàn)檢索和論文編輯等工作。孫威和周蓮紅進(jìn)行了論文審查與修訂等工作。