孔小嬌 王紅梅 段生寶 劉鐵梅

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130033；2.中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所）

人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）分布在血小板膜糖蛋白上，可以通過妊娠或血小板輸注等途徑免疫而產(chǎn)生抗-HPA，從而導(dǎo)致多種免疫性血小板疾病，包括胎兒新生兒同種免疫性血小板減少癥（fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia,FNAIT）、輸血后紫癜（post-transfusion purpura,PTP）和血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness, PTR）等[1-2]。迄今為止已發(fā)現(xiàn)HPA-1～HPA-35共計(jì)35 個系統(tǒng)，其中HPA-1～HPA-5及HPA-15這6 個HPA 系統(tǒng)為雙等位基因表達(dá)，其余29 個HPA 尚未發(fā)現(xiàn)對偶抗原。除HPA-14bw外，HPA 編碼基因具有單核苷酸多態(tài)性（SNPs）特點(diǎn)，相應(yīng)抗原是由單個堿基突變造成單個氨基酸替換產(chǎn)生[3]。其中，HPA-3和HPA-15是中國漢族人群中等位基因雜合程度最高的2個系統(tǒng)，理論上更易引起機(jī)體產(chǎn)生同種異體免疫反應(yīng)，對其進(jìn)行準(zhǔn)確的基因分型具有較大臨床意義[4]。本研究根據(jù)HPA-3，HPA-15的SNP 特點(diǎn)，設(shè)計(jì)適用于ddPCR 的特異性引物和探針，旨在構(gòu)建HPA-3及HPA-15微滴式數(shù)字PCR檢測體系，其不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線及參考品，實(shí)現(xiàn)對血小板HPA-3，HPA-15準(zhǔn)確定量基因檢測，并初步探討其應(yīng)用于孕婦外周血中胎兒游離核酸的HPA基因相容性檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

HPA-3,HPA-15基因分型參考品（編號：360061，批號：202201），來源于中國食品藥品檢定研究院。2022 年6 月～2023 年6 月，收集67 例臨床隨機(jī)EDTA 抗凝全血標(biāo)本，52 例健康的孕婦（無腫瘤病史）EDTA 抗凝全血標(biāo)本，均來自于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院。1 例健康未孕女性全血標(biāo)本來自志愿者捐贈。

1.2 主要儀器與試劑

數(shù)字PCR 系統(tǒng)（包括：微滴生成器、微滴分析儀、QuantaSoft 分析軟件）（美國Bio-Rad,QX200）、PCR 儀（德國Eppendorf,AG6331）、離心機(jī)（德國Eppendorf,AG5811）、紫外分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技（中國）, NanoDrop 2000]、實(shí)時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems,7500）、血液基因組DNA 提取系統(tǒng)（DP349）（北京天根，批號：Y1309）、血清/血漿游離DNA 提取試劑盒（DP339）（北京天根，批號：Y1725）、DG8 Gaskets for QX200TM/QX100TM Droplet Generator（美國Bio-Rad，批號：1000124111）、ddPCR Droplet Reader Oil（美國Bio-Rad, 批號：A1561645）、Droplet Generator Oil for Probes（美國Bio-Rad,,批號：A1556750）、ddPCR Supermix for Probes（no DUTP）（美國Bio-Rad,批號：64539072）、TaqPath?ProAmp?Master Mix（美國Applied Biosystems，批號2825154）、PowerUp ?SYBR ?Green Master Mix（美國Applied Biosystems，批號2745038）、Bsh1236I（BstUI）［賽默飛世爾科技（中國），批號：91292489］、RNase-free 雙蒸水（上海生工生物工程，批號：JA08KA1161）。

1.3 標(biāo)本的處理、全基因組DNA及游離DNA提取

按照血液基因組提取試劑盒及游離DNA提取試劑盒說明書操作，用NanoDrop2000 檢測提取全血標(biāo)本中基因組DNA 的濃度及純度，A260/A280為1.7～1.9。

1.4 特異性引物及探針的設(shè)計(jì)、合成與驗(yàn)證

基于Human Platelet Antigen（HPA）數(shù)據(jù)庫（http://www.versiti.org/HPA）及NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）所提供的HPA-3、HPA-15基因突變序列信息，結(jié)合文獻(xiàn)及ddPCR 引物探針設(shè)計(jì)原則，利用Primer Express軟件3.0.1設(shè)計(jì)HPA-3和HPA-15等位基因正向和反向引物以及等位基因特異性MGB 探針。β-actin，RASSF1A 基因引物參考文獻(xiàn)[5]，交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成及純化，見表1。通過Primer-BLAST對產(chǎn)物大小符合要求的序列進(jìn)行查找和對比，確定引物是否具有特異性。HPA-3和HPA-15的基因突變類型為點(diǎn)突變，其各自aa、ab、bb基因型的區(qū)別在于單個堿基的突變。選取HPA-3,HPA-15基因型為aa及bb的參考品，加入雙重探針進(jìn)行ddPCR實(shí)驗(yàn)，每組重復(fù)3次，確定探針是否具有特異性。

表1 HPA-3，HPA-15 ddPCR基因分型引物及探針Table 1 Primers and probes for ddPCR genotyping of HPA-3 and HPA-15

1.5 ddPCR方法構(gòu)建及檢測體系優(yōu)化

ddPCR 設(shè)置退火溫度分別為：56.0、57.1、58.7、60.2、61.6、63.1、64.7、65.8℃。進(jìn)行2 組平行實(shí)驗(yàn)，評估陽性液滴及陰性液滴分離程度、熒光信號值及拷貝數(shù)檢測值，確定最佳退火溫度。探針終濃度為250 nM 不變，設(shè)置正反向引物終濃度分別為900、700、500、300 nM。每個梯度進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，確立最佳擴(kuò)增體系。具體操作流程如下：配制20 μL探針法定量反應(yīng)體系，加入10 μL ddPCR Supermix for Probes（no DUTP），引物濃度為300～900 nM，探針濃度為250 nM，加入目的基因，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。振蕩離心15 s后，反復(fù)吹打混勻至少20次，加入DG8TMcartridge中間1排8孔內(nèi)，在DG8TMcartridge 最后1 排孔中加入70 μL Droplet Generator Oil for Probes，蓋上膠墊，平穩(wěn)放置在微滴生成儀中，生成微滴，緩慢吸取40 μL 微滴轉(zhuǎn)移至96 孔PCR板相應(yīng)位置孔內(nèi)，放入PCR儀，開始擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃10 min、94℃30s、56～65.8℃1 min，循環(huán)40 次，98℃10 min，4℃保存小于4 h。反應(yīng)完成后將其放入微滴分析儀中進(jìn)行熒光信號的檢測和讀取。QuantaSoft分析軟件自動進(jìn)行分析，人工核驗(yàn)后保存結(jié)果。

1.6 ddPCR檢測體系性能評估

1.6.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行ddPCR預(yù)實(shí)驗(yàn)確定HPA-3及HPA-15參考品的初始拷貝數(shù)濃度，用雙蒸水進(jìn)行10 倍比梯度稀釋，定量理論濃度（copies/μL）分別為1×104、1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3，每個濃度重復(fù)3 次。進(jìn)行回歸性分析評估其檢測體系靈敏度及范圍。

1.6.2 重復(fù)性及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別配制2種低拷貝數(shù)濃度的目的基因，每個濃度進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，并間隔一定時間，分3次檢驗(yàn)，計(jì)算批內(nèi)及批間標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）及變異系（CV），以評估檢測方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

1.6.3 臨床標(biāo)本檢測

收集吉林長春地區(qū)67 例臨床隨機(jī)EDTA 抗凝全血標(biāo)本，提取其DNA，調(diào)節(jié)濃度為30 ng/μL，采用本方法檢測HPA-3、HPA-15基因型，與基因測序結(jié)果進(jìn)行比較，評估本方法的準(zhǔn)確性。

1.7 ddPCR 檢測體系初步應(yīng)用于檢測胎母HPA-3及HPA-15相容性

1.7.1 胎母HPA-3及HPA-15基因型檢測

應(yīng)用ddPCR 檢測體系檢測52 例孕婦基因型，選取母親基因型為HPA-3或HPA-15純合子標(biāo)本，對其游離DNA進(jìn)行基因檢測。若母親基因型為純合子而游離DNA 檢測為雜合子，則說明胎兒基因型為HPA-3ab 或HPA-15ab，胎母血小板抗原不相容。若基因組DNA與游離DNA檢測結(jié)果相同，考慮胎母血小板相容或未提取到胎兒游離DNA，進(jìn)行RASSF1A和β-actin基因檢測來確定是否提取到胎兒游離DNA。步驟簡述如下：酶切體系:RNasefree 雙蒸水16 μL,10×Buffer R 2 μL,游離DNAug 1 ng, BstUI 5 U。擴(kuò)增RASSF1A和β-actin基因反應(yīng)體系：2×PowerUp?SYBR?Green 10 μL，游離DNA模板8 μL，上下游引物終濃度均為800 nM，探針終濃度為250 nM，用RNase-free 雙蒸水補(bǔ)至20 μL。PCR條件為95℃2 min,95℃15 s,60℃1 min 共40個循環(huán)。每個反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔，以健康未孕女性作為對照，觀察有無熔解曲線。

1.7.2 ddPCR與qPCR檢測靈敏度比較

預(yù)實(shí)驗(yàn)確定胎兒基因型為HPA-3ab 及HPA-15ab拷貝數(shù)濃度，計(jì)算胎兒游離DNA占游離DNA的百分比，倍比稀釋后分別用ddPCR和qPCR檢測胎兒基因型，對比兩者靈敏度。qPCR檢測體系為：2×TaqPath ?ProAmp ?Master Mix 10 μL，游離DNA 2.2 μL，上下游引物終濃度700 nM，探針終濃度200 nM，RNase-free 雙蒸水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為:60 ℃2 min，95 ℃10 min，94 ℃30 s，60 ℃1 min，共40個循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

HPA-3及HPA-15拷貝數(shù)梯度稀釋后實(shí)際檢測值平均值與理論值log 進(jìn)行回歸性分析，判斷其理論值和實(shí)際值之間是否存在線性關(guān)系。并采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻HPA-3、HPA-15對偶基因不配合率（MMP），計(jì)算公式為MMP=2ab（1-ab），其中a、b 為基因頻率，利用SPSS17.0 軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析其基因頻率是否符合Hardy-Weinberg 平衡驗(yàn)證（取值P＞0.05）。

2.結(jié)果

2.1 引物及探針特異性驗(yàn)證

通過Primer-BLAST，HPA-3及HPA-15擴(kuò)增產(chǎn)物序列與人類Refseq representative genomes 數(shù)據(jù)庫基因序列對比，結(jié)果顯示均只有1個相配的擴(kuò)增產(chǎn)物，引物具有特異性。在雙重探針實(shí)驗(yàn)中，HPA-3aa、HPA-3bb、HPA-15aa、HPA-15bb的參考品只在單一熒光通道顯示熒光信號值，符合參考品基因型，說明MGB探針對檢測體系具有特異性（圖1）。

圖1 HPA-3，HPA-15 ddPCR探針特異性檢測結(jié)果Figure 1 Specific detection results of ddPCR probes for HPA-3 and HPA-15

2.2 ddPCR的反應(yīng)條件及檢測體系確立

對于HPA-3，當(dāng)退火溫度處于61.6℃時，其FAM 熒光通道陽性微滴熒光值對比其他溫度較高，相同熒光值下，61.6℃時的微滴分布對比58.7℃及60.2℃時，其“落雪”現(xiàn)象較不明顯，故HPA-3最佳退火溫度為61.6℃。HPA-15在退火溫度為57.1、58.7、60.2℃時，陽性微滴熒光值信號最高，但在3種溫度下，60.2℃時的FAM 通道陰性微滴更為集中，呈現(xiàn)為單一直線，故HPA-15的最佳退火溫度為60.2℃。固定探針終濃度為250 nM，探究不同引物濃度對檢測體系的影響。當(dāng)HPA-3引物濃度為900 nM時，F(xiàn)AM及VIC通道陽性微滴熒光值最高，所能檢測的拷貝數(shù)最多，陽性微滴及陰性微滴的間隙更大，能更好的判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。HPA-15引物濃度為700 nM 時，F(xiàn)AM 通道陽性微滴熒光值最高，與900 nM時的熒光信號值相差較大，在VIC通道盡管900 nM時熒光信號值最高，但各個濃度之間的熒光信號值相差不大，且陽性微滴與陰性微滴分離程度都較為明顯。故本研究HPA-3最佳引物濃度為900 nM，HPA-15最佳引物濃度為700 nM（圖2）。

圖2 HPA-3，HPA-15 ddPCR不同反應(yīng)條件及檢測體系結(jié)果Figure 2 Results of ddPCR under different reaction conditions and detection systems for HPA-3 and HPA-15

2.3 檢測體系靈敏度驗(yàn)證

當(dāng)HPA-3及HPA-15拷貝數(shù)濃度為1×104copies/μL，拷貝數(shù)結(jié)果顯示“no call”，儀器不能檢出預(yù)期拷貝數(shù)，表明濃度過高已超出檢測上限?？截悢?shù)濃度為1×10-1copies/μL 時，能夠檢出預(yù)期拷貝數(shù)，而低于此濃度的標(biāo)本，檢測結(jié)果均顯示為0。因此，HPA-3及HPA-15的檢測下限為1×10-1copies/μL。R2=0.999和R2=0.998，分別表明HPA-3及HPA-15理論值和檢測值呈良好線性關(guān)系（圖3）。

圖3 HPA-3及HPA-15 ddPCR結(jié)果回歸性分析Figure 3 Regression analysis of ddPCR results for HPA-3 and HPA-15

圖4 HPA-3，HPA-15基因測序結(jié)果示例Figure 4 Examples of gene sequencing results for HPA-3,HPA-15

2.4 檢測方法重復(fù)性及穩(wěn)定性驗(yàn)證

配制HPA-3、HPA-15拷貝數(shù)濃度分別為1×102copies/μL、1×100copies/μL 的基因標(biāo)本，做3 組平行，兩個低濃度批次的標(biāo)本批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.9%、4.8%、2.9%、4.8%（見表2）。每間隔7d 對HPA-3、HPA-15的2種低拷貝數(shù)濃度基因標(biāo)本進(jìn)行檢測，共檢測3 次，批間變異系數(shù)分別為2.5%、2.0%、1.7%、4.4%，表明血小板HPA-3，HPA-15ddPCR檢測體系具有較好的重復(fù)性及穩(wěn)定性（表3）。

表3 HPA-3，HPA-15 ddPCR批間重復(fù)性Table 3 HPA-3,HPA-15 ddPCR inter-batch repeatability

2.5 臨床標(biāo)本HPA-3，HPA-15 ddPCR檢測

通過對長春地區(qū)67 例臨床隨機(jī)標(biāo)本檢測，HPA-3a、HPA-3b的基因頻率分別為0.537 3，0.462 7，HPA-15a、HPA-15b的基因頻率分別0.522 4，0.477 6。兩者基因不配合率分別為0.373 6，0.374 5，同時P＞0.05，兩者基因型頻率及基因頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡（表4）。同時，進(jìn)行基因測序比較，結(jié)果表明ddPCR 檢測結(jié)果與基因測序完全一致，符合率100%，基因測序代表性結(jié)果見圖4。

表4 長春地區(qū)67例臨床標(biāo)本HPA-3和HPA-15 ddPCR基因分型Table 4 ddPCR genotyping of HPA-3 and HPA-15 in 67 clinical samples from Changchun area

2.6 胎母HPA-3及HPA-15相容性檢測

共檢測孕婦標(biāo)本52 例，其中HPA-3及HPA-15純合子分別有10 例和12 例，純合子孕婦標(biāo)本中分別檢測到HPA-3雜合子4 例，HPA-15雜合子5 例（圖5）。純合子標(biāo)本未擴(kuò)增出β-actin基因，有1 例HPA-3aa標(biāo)本未能檢測出RASSF1A基因，其余標(biāo)本均檢測到RASSF1A基因熔解曲線，而正常未孕標(biāo)本兩種基因均未擴(kuò)增。說明此例標(biāo)本未提取到胎兒游離DNA，具體檢測結(jié)果見表5。

圖5 胎母HPA-3及HPA-15相容性檢測Figure 5 Fetal-maternal HPA-3 and HPA-15 compatibility test

表5 52例孕婦及胎兒基因分型檢測結(jié)果Table 5 Genotyping results of 52 pregnant women and fetuses

2.7 ddPCR與qPCR靈敏度比較

ddPCR 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定胎兒游離DNA 占總游離DNA 的比值為20.8/400 copies/μL（5.2%），標(biāo)本濃度稀釋為10.4/400 copies/μL（2.6%），5.2/400（1.3%copies/μL，2.6/400 copies/μL（0.65%），1.3/400 copies/μL（0.325%）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在胎兒游離DNA濃度為≤0.65%，qPCR 檢測不到具體基因型，而ddPCR仍可檢測到相應(yīng)熒光信號值，見圖6。

圖6 ddPCR倍比稀釋檢測結(jié)果Figure 6 Results of ddPCR detection for 2-fold serial diluted samples

3 討論

HPA抗原可以通過妊娠、血小板輸注或器官移植引起同種異體抗體產(chǎn)生[6]。國外文獻(xiàn)報道，HPA-1a和HPA-5b是參與白人血小板同種免疫疾病最重要的血小板抗原系統(tǒng)[7]。在中國，HPA-1bb，HPA-2bb，HPA-4bb，HPA-5bb，HPA-6bb的基因型頻率幾乎為零，而HPA-3，HPA-15系統(tǒng)中a的基因頻率和b基因頻率差距較小，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，HPA-3a和HPA-3b的基因頻率分別為0.578 8 和0.421 2，HPA-15a和HPA-15b的基因頻率分別為0.534 3 和0.465 7，二者雜合程度較高，在妊娠及輸血治療時，產(chǎn)生血小板同種異體抗體，導(dǎo)致免疫性血小板疾病的幾率較大[8]。

HPA-3，HPA-15自1990 年和2002 年被鑒定及闡明其等位基因以來，其多態(tài)性及臨床意義就成為血小板輸注的研究熱點(diǎn)[9-10]。研究表明，臨床輸血前對HPA抗原進(jìn)行基因配型能夠有效降低出血風(fēng)險，取得較理想治療效果[11-12]。劉丙現(xiàn)等[13]對比了ABO 血型、HPA 基因型及固相凝集配型都相合的血小板輸注有效率與僅ABO血型及固相凝集合的血小板輸注有效率，后者僅為77.8%，前者可達(dá)到94.4%。因而，對HPA抗原進(jìn)行基因分型能夠提高血小板輸注療效，減少因配型不合產(chǎn)生的一系列血小板綜合征，節(jié)約血小板資源。

HPA抗原檢測由于缺少相應(yīng)的單克隆抗體（除HPA-1a外），不能用傳統(tǒng)血清學(xué)對HPA 進(jìn)行定型。目前，實(shí)驗(yàn)室對HPA基因分型方法主要包括序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP），限制性片段長度多態(tài)性PCR（PCR-RFLP），序列特異性寡核苷酸探針法（PCR-SSOP），TaqMan 實(shí)時PCR 等[14-15]。其中PCR-SSP 通過對凝膠電泳條帶的觀察確定HPA基因型，目前應(yīng)用較多，但其操作繁瑣，難以自動化，依賴主觀判讀，錯誤率較高。PCR-RFLP 方法對個別基因型沒有合適的酶切位點(diǎn)。TaqMan實(shí)時PCR方法靈敏度相對較高，但難以建立合適的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品，并極度依賴Ct 值及標(biāo)準(zhǔn)曲線，無法快速、簡便的對HPA進(jìn)行基因分型。

隨著微流控和MEMS 技術(shù)和工藝的成熟，數(shù)字PCR 檢測于1992 年首次被描述[16]，它將單個PCR 管中的反應(yīng)試劑劃分為數(shù)萬甚至數(shù)百萬個微小的微滴，進(jìn)行“單分子模板PCR擴(kuò)增”，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)陽性反應(yīng)單元數(shù)目及泊松分布原理計(jì)算原始標(biāo)本中的靶基因和拷貝數(shù)，無需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品[17-18]，對比傳統(tǒng)熒光定量PCR判讀更為簡潔，靈敏度和精確性更高。

本研究根據(jù)HPA-3，HPA-15基因組序列SNP突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了適用于ddPCR 檢測體系的雙向引物及MGB 探針，通過Blast 分析及雙重探針實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了引物及探針對檢測體系的特異性，在確保特異性的同時對引物退火溫度（Tm）做了一定的調(diào)整，primer express 顯示F-HPA-3a、F-HPA-3b的Tm分別為58℃、59℃；F-HPA-15a、F-HPA-15b的Tm分別為54℃、58℃。退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)中，可以看到HPA-3隨著溫度變化陰性通道的陰性液滴始終呈現(xiàn)單一直線，而HPA-15陰性通道陰性液滴隨著溫度變化相差較大，提示引物Tm 對于不同HPA ddPCR 檢測體影響不同。通過對陽性微滴及陰陽性液滴的分離程度比較，研究確定了ddPCR 檢測HPA-3最佳反應(yīng)條件為Tm 61.6℃，引物濃度為900 nM；HPA-15最佳反應(yīng)條件為Tm 60.2℃，引物濃度為700 nM。同時實(shí)驗(yàn)對微滴生成油的加樣量、探針終濃度及循環(huán)次數(shù)等因素在前期進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對檢測結(jié)果沒有較大影響。通過對檢測體系性能評估，該方法檢測下限可達(dá)到0.1 copies/μL。對比傳統(tǒng)熒光定量PCR，具有更高的靈敏度。當(dāng)擴(kuò)增模板濃度為1×103copies/μL時，其所容納的拷貝數(shù)已超出常規(guī)檢測所需，故本實(shí)驗(yàn)將拷貝數(shù)檢測上限定為1 000 copies/μL。因此，20 μL 檢測體系能夠檢測拷貝數(shù)范圍為2～20 000 copies。同時，檢測體系理論值與實(shí)際值平均值之間呈現(xiàn)線性關(guān)系，在拷貝數(shù)濃度為個位數(shù)的情況下，HPA-3及HPA-15的批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)均＜5%，表明檢測體系有較好的重復(fù)性及穩(wěn)定性，其結(jié)果可信度較高。對吉林長春地區(qū)67例臨床標(biāo)本進(jìn)行HPA-3及HPA-15基因分型，標(biāo)本中雜合子占比較大，HPA-3a、HPA-3b的基因頻率分別為0.537 3、0.462 7，HPA-15a、HPA-15b的基因頻率分別為0.522 4、0.477 6，與已有的長春地區(qū)及相關(guān)文獻(xiàn)中的報道基本相符[19-21]。該67 例臨床標(biāo)本分型結(jié)果與基因測序結(jié)果完全一致，表明本方法的準(zhǔn)確率較高。

ddPCR 作為第三代PCR 技術(shù)，對反應(yīng)抑制物有更高的耐受力，在產(chǎn)前診斷具有廣泛前景[22-24]。目前胎兒的產(chǎn)前診斷通常使用侵入式采樣方法，產(chǎn)生創(chuàng)傷的風(fēng)險性較大，1997 年Lo 等[25]證實(shí)了孕婦外周血中存在胎兒游離DNA，為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)（non-invasive prenatal testing，NIPT）奠定基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外已有報道通過ddPCR鑒定胎兒血型[24]，但針對胎兒HPA基因分型尚未見報道。

本實(shí)驗(yàn)將數(shù)字PCR 檢測體系與胎母血小板抗原相容性檢測結(jié)合，初步驗(yàn)證了方法的可行性，同時引入了β-actin和RASSF1A基因作為衡量是否有效提取胎兒游離DNA 的判讀，β-actin基因作為甲基化酶BstUI 酶切有效的標(biāo)志。相較于傳統(tǒng)SRY基因，不局限于男性胎兒。同時將已知拷貝數(shù)的游離DNA 標(biāo)本進(jìn)行倍比稀釋，同qPCR 比較對游離DNA檢測更為靈敏，對于孕婦妊娠早期篩查，盡早介入治療有較大意義。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)檢測樣本量有限，對長春地區(qū)的HPA 基因多態(tài)性的研究，以及ddPCR 檢測胎母血小板相容性方法的局限性及臨床適用性后續(xù)將增加檢測抗原類型及樣本量進(jìn)一步評估完善。

綜上所述，本研究結(jié)合微滴式PCR 技術(shù)構(gòu)建了血小板HPA-3，HPA-15基因分型方法，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性及穩(wěn)定性較好，能夠建立實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)及室間的標(biāo)準(zhǔn)化操作，可以推廣應(yīng)用于臨床標(biāo)本檢測，能夠無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎母HPA-3及HPA-15基因型，可為FNAIT等疾病的早期診斷，篩查以及其余HPA 抗原，輸血相關(guān)性微嵌合體等檢測提供參考技術(shù)。