朱于莉 韓斌 馮智慧

(青島市中心血站輸血研究所，山東 青島 266071 )

ABO 血型系統(tǒng)通?？煞譃锳、B、O、AB 這4 種表型，而ABO 亞型是指在這4 種血型之下進一步細分的ABO 血型，這些亞型必須具有遺傳基礎，并且有明確的血清學特點[1]。其中最突出的血清學特點就是正反定型不符:紅細胞上A或(和)B 抗原表達減弱，多數(shù)伴有血清中含弱抗原的抗體，從而導致血型鑒定困難甚至誤判。 因此準確的鑒定出ABO亞型，對于臨床患者輸血十分重要。 基因分型技術的快速發(fā)展，為亞型的鑒定提供了強有力的支持依據，也不斷擴大著亞型的等位基因庫[2]。 我們發(fā)現(xiàn)了2 例疑難血型，通過分子檢測確定為2 例罕見的Aw43 亞型，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

標本1 為男性，12 歲，泌尿外科患者；標本2 為女性，38歲，婦科患者，均在當?shù)蒯t(yī)院檢測發(fā)現(xiàn)ABO 正反定型不符，隨后送至本實驗室進一步檢測。

1.2 試劑和儀器

抗-A(批號20220102)、 抗-B(批號20220102)及ABO標準紅細胞(批號20235301)和抗-H 試劑(批號20210917)(上海市血液生物)，抗-A1(批號8000452124)(荷蘭Sanquin)、抗-AB(批號842000)(法國DIAGAST)，基因組DNA提取試劑盒(美國Invirtrogen)，Ex-Taq 試劑盒(TaKaRa，批號KA5801CA)，克隆測序使用的LA-Taq 試劑盒(TaKaRa批號KA4601YA)及高效克隆PCR 產物專用載體(pMD18-T vector)(TaKaRa，批號K6801AB)；血清學離心機(KA-2200，日本KUBOTA 公司)、Bio-Rad C1000 PCR 擴增儀(美國Bio-Rad)、3100 型測序儀(美國AB)。

1.3 血清學試驗

采用標準試管法[3]進行ABO 血型正反定型試驗。

1.4 基因檢測

1.4.1 DNA 提取

采集2 例研究標本外周血1 mL(EDTA 抗凝血)，參照試劑盒說明書操作提取血液標本全基因。

1.4.2 DNA 序列直接分析

對ABO基因啟動子、 第1 ～7 外顯子和側翼序列進行PCR 擴增并分析序列，引物序列及PCR 反應條件參見本實驗室之前發(fā)表的文章[4]。 測序結果采用GEBtle 軟件進行序列分析。

1.4.3 克隆測序分析

擴增ABO基因的外顯子1、3、4、5、6、7，將擴增產物純化后克隆入T 載體，并挑取多個陽性菌落進行培養(yǎng)增殖，提取質粒DNA 用于檢測標本的單體型。

1.5 蛋白結構分析

采用SIB Expasy 對DNA 序列進行氨基酸翻譯并預測蛋白讀碼框，采用DeepTMHMM 進行跨膜區(qū)預測和分析。

2 結果

2.1 血清學試驗結果

2 例標本ABO 血型血清學結果十分相似，均表現(xiàn)為正定A 抗原減弱，同時反定存在抗-A，與抗-H 的反應增強，見表1。

表1 2 例標本的ABO 血型血清學結果Table 1 ABO serologic grouping results of 2 cases

2.2 ABO 基因序列分析

將2 個血液標本提取DNA，進行ABO基因增強子序列、1-7 外顯子及側翼序列的直接測序分析，并將結果與A101序列進行比對。 標本1 的增強子為A＋G 型，存在1A/G、297A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、1096G/A 雜合；標本2 的增強子也是A＋G 型，存在 1A/G、 106G/T、 188G/A、 189C/T、 220C/T、 261delG、297A/G、467C/T、646T/A、 681G/A、771C/T、829G/A 雜合。進一步對2 個標本進行克隆測序，每個標本均可檢測到2 種基因型，測序結果見表2。 通過GeneBank 序列比對確認，標本1 基因型為Aw43/B101，標本2 基因型為Aw43/O02。

表2 2 例標本的ABO 基因克隆測序結果Table 2 ABO gene analysis results of 2 cases

2.3 ABO 蛋白結構域分析

Aw43 等位基因第1 位堿基發(fā)生A＞G 突變，破壞了起始密碼子ATG，導致翻譯起始位點后移。 對開放閱讀框(open reading frame，ORF)進行分析顯示后續(xù)可能存在13 個翻譯起始位點(Met，M)，分別位于跨膜區(qū)、莖區(qū)和催化區(qū)(表3)。

表3 潛在的翻譯起始位點及定位Table 3 Potential translation initiator of the ABO gene

若以改變最小的第20 位Met 作為翻譯起始位點，則形成的蛋白由原來的354 個氨基酸縮短為335 個。 采用DeepTMHMM 進一步對跨膜區(qū)進行預測和分析，結果顯示，缺失20 位氨基酸嚴重影響了跨膜區(qū)的結構，形成跨膜區(qū)的概率從100%降低至＜10%，且蛋白拓撲結構也從alpha 跨膜區(qū)(alpha transmembrane，TM)轉變?yōu)榍蛐蔚男盘栯?signal peptide，SP)(圖1)。

圖1 DeepTMHMM 分析編碼蛋白跨膜區(qū)Figure 1 Transmembrane regions of encoding protein:DeepTMHMM analysis

3 討論

我們發(fā)現(xiàn)的2 例標本的血清學試驗結果類似AX亞型，即正定與抗-A 反應減弱，抗-A1陰性，同時血清中存在抗-A。對這2 例標本進行DNA 序列分析，發(fā)現(xiàn)2 例的ABO基因中都存在1A＞G， 467C＞T 突變，經與National Center for Biotechnology Information(NCBI)網站的The Blood Group Antigen Gene Mutation Database 比對確認為Aw43 等位基因型(GeneBank:KU128404)。 同時我們也注意到，在不同數(shù)據庫中Aw43 的命名存在矛盾:根據International Society of Blood Transfusion(ISBT)網站提供的Names for ABO (ISBT 001) blood group alleles v1.1 171023，Aw43 的突變位點是c.467C＞T、 c.721C＞T，與NCBI 的不同。 在此我們選擇按照NCBI 的等位基因定義，本文所指Aw43 即1A＞G， 467C＞T，以避免混淆。

Aw43 亞型是2016 年由浙江省血液中心許先國課題組發(fā)現(xiàn)并報道的[5]，經序列提交GeneBank后命名為Aw43。Aw43 亞型相對較少，經文獻檢索，目前相關報道僅有2 篇文獻，且均為中國人報道，除了首次發(fā)現(xiàn)的上述報道外，江蘇省血液中心在2021 年報道了1 例[6]，這2 例的血清學試驗結果與我們此次報道的相似，均為A 抗原減弱甚至無法檢測，反定有或未檢測到抗-A。 上述數(shù)據提示此Aw43 亞型的發(fā)生概率極低。

Aw43 亞型的分子特征是ABO基因存在1A＞G， 467C＞T 突變，其中1A＞G 破壞了起始密碼子ATG，導致翻譯起始位點后移；而467C＞T 則導致156 位氨基酸由CCG(脯氨酸，Pro)突變?yōu)镃TG(亮氨酸，Leu)。 單獨467C＞T(P156L)突變是等位基因A102(GeneBank:AF134413)的分子特征[7]。 雖然與A101 相比，A102 的基因序列發(fā)生了突變，也導致編碼氨基酸的序列改變，但此突變并未影響到所編碼的α-1，3-N-乙酰半乳糖胺基轉移酶(α-1，3-N-Acetylgalactosaminyltransferase，GTA)的活性，紅細胞膜上A 抗原表達正常，與A101 類似[8]。 并且目前日本和我國的研究發(fā)現(xiàn)，在亞洲黃種人中A102 比A101 更占數(shù)量優(yōu)勢[9]。 因此我們認為導致Aw43 亞型A 抗原減弱的原因應該是1A＞G。

GTA 是Ⅱ型跨膜蛋白，這些跨膜蛋白定位于高爾基體內，包含1 個位于細胞質內的16 個氨基酸的N 段結構域、1 個21 個氨基酸的單跨膜結構域和1 個擴展的莖區(qū)，然后是1 個在高爾基體腔內的C 端催化結構域[10]。 高爾基體的主要功能是將內質網合成的蛋白質進行加工、分揀與運輸，然后分門別類地送到細胞特定的部位或分泌到細胞外。這其中最重要的1 項加工就是糖基化:內質網起始合成N-連接的糖鏈由順面進入高爾基體后，在各膜囊之間的轉運過程中發(fā)生了一系列有序的加工和修飾，被多種糖基轉移酶依次加上了不同類型的糖分子，形成了結構各異的糖鏈，最終這些糖鏈分泌到細胞外或錨定在膜上，發(fā)揮各自的功能[11]。1A＞G 突變導致GTA 翻譯起始位點后移，很可能后移到穿膜區(qū)的M26 或柄狀莖區(qū)的M53 或M69，形成N 端截短的蛋白。 通過我們的預測分析，哪怕是后移到第1 次出現(xiàn)的M20，也會嚴重影響跨膜區(qū)的形成，導致所形成的GTA 蛋白缺失跨膜區(qū)，蛋白結構發(fā)生改變。

除Aw43 外，其他存在翻譯起始位點突變的亞型還有A309(1A＞G)[12]、Aw13(2T＞C)[13]和Aw16(1A＞G， 467C＞T， 1061delC)[14]。 這3 種亞型均表現(xiàn)為正定A 抗原減弱，有的會出現(xiàn)混合凝集。 研究人員針對此類突變設計了體外功能試驗，比如發(fā)現(xiàn)Aw13 亞型的Seltsam 采用流式細胞技術檢測轉染了突變質粒的Hela 細胞，結果與A101 相比，發(fā)現(xiàn)突變后表達A 抗原的細胞數(shù)降低了33%，A 抗原的表達量降低了41%[13]。 Yamamoto 等[10]在對不同轉錄起始位點對A 抗原表達影響的體外研究試驗中得出結論:GTA 的跨膜和莖干結構域對于A 抗原的合成是必須的，細胞質內的尾部是可有可無的。 但GTA 的跨膜區(qū)除了維持蛋白穩(wěn)定性外，是如何影響酶活性的? 由跨膜結構域或莖區(qū)的替代翻譯起始位點觸發(fā)的N 端截斷的GTA 又是如何表達和修飾的? 這些問題目前還沒有相關研究。 因此，Yamamoto 等[10]對此提出猜測:GTA 對A 抗原合成的作用也許同β-1，4-N-乙酰氨基半乳糖轉移酶(β4GalNAcT)和β-1，3-半乳糖轉移酶(β3GalT)的作用類似，在高爾基體中，這2 個酶的N 端結構域(含胞內、跨膜和少量氨基酸莖區(qū))參與相互作用，通過轉移步驟將中間體從產物位置引導到受體位置，從而提高了糖脂合成的效率[10，15]。 但這一切目前均處于理論假說階段，N 端缺失對GTA 功能的影響機制還需要進一步的深入研究。