龔 閩,朱 彪,李 欣,梅 美,黨瑞杰,陳 曄

近半個(gè)世紀(jì)以來(lái),2型糖尿病患病人數(shù)大幅增長(zhǎng)[1, 2],嚴(yán)重危害人類的生存健康,已成為人類面對(duì)的嚴(yán)峻公共衛(wèi)生問(wèn)題。高血糖微環(huán)境顯著阻礙脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-der ived stem cells,ADSCs)的成骨分化,是導(dǎo)致糖尿病性骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展的重要原因。臨床實(shí)踐中也觀察到2型糖尿病患者口腔種植手術(shù)成功率遠(yuǎn)低于健康人[3]。生長(zhǎng)分化因子11(growth differentiation factor 11,GDF11)是一種具有“返老還童”作用的細(xì)胞因子,能延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老并逆轉(zhuǎn)老齡性骨丟失[4],緩解代謝綜合征小鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[5],提高胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能同時(shí)減少細(xì)胞凋亡緩解2型糖尿病的高血糖狀態(tài)[6],還能通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢成血管改善糖尿病足血運(yùn)循環(huán)狀態(tài)[7]。GDF11對(duì)2型糖尿病及其并發(fā)癥的這些保護(hù)作用與激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)[5-7]。但GDF11能否促進(jìn)糖尿病小鼠ADSCs成骨分化及具體機(jī)制尚不清楚,本研究將對(duì)該課題進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 10只5周齡雄性無(wú)特定病原體級(jí)C57BL/6J小鼠與D12492高脂飼料(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。重組人GDF11(PEPROTECH,美國(guó));培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco,美國(guó));成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液相關(guān)試劑:β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松、L-谷氨酰胺(賽業(yè)生物,中國(guó));胰蛋白酶、二甲基亞砜、鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、青霉素、鏈霉素(Sigma,美國(guó));Trizol(Invitrogen,美國(guó));堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)試劑盒(碧云天生物,上海);兔抗人PI3K抗體,磷酸化PI3K(p-PI3K)抗體、兔抗鼠Akt抗體,磷酸化Akt(p-Akt)抗體、山羊抗兔二抗(CST,美國(guó));碘化丙啶PI(Sigma,美國(guó));BCA測(cè)定試劑盒(翊圣生物,上海);聚偏二氟乙烯膜(PVDF)(Millipore,美國(guó))。MCO-15AC型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(SANYO,日本);BCV-1360型生物凈化工作臺(tái)(哈東聯(lián),北京);血糖儀(強(qiáng)生公司,美國(guó));7500 型熒光定量PCR儀(ABI,美國(guó));VT型酶聯(lián)儀(BioTek Instruments,美國(guó));FACScan型流式細(xì)胞儀(BD Biosciences,美國(guó));BX-53型正置熒光顯微鏡(奧林巴斯,日本)。

1.2 糖尿病小鼠造模 糖尿病小鼠造模方法:高脂飼料喂養(yǎng)8 周小鼠,連續(xù)5 d腹腔注射小劑量(60 mg/kg)鏈脲佐菌素(STZ)。注射完后尾靜脈采血檢測(cè)隨機(jī)血糖,認(rèn)為2次隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病造模成功的標(biāo)準(zhǔn),成功造模6只糖尿病小鼠。糖尿病小鼠造模成功后繼續(xù)采用高脂飼料喂養(yǎng)8周。

1.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 無(wú)菌條件下切取小鼠腹部皮下白色脂肪組織,酶消化后過(guò)濾獲取細(xì)胞混懸液離心(1000 r/min,5 min),接種于培養(yǎng)瓶原代培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底面積的90%時(shí),開始傳代。取第3代ADSCs,加入(GDF11組)或者不加(對(duì)照組)20 g/ml GDF11培養(yǎng)24 h后檢測(cè)GDF11對(duì)ADSCs細(xì)胞周期的影響。

1.4 ALP活性定量 將ADSCs接種于96孔板上[8, 9],待細(xì)胞85%融合后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。在成骨誘導(dǎo)液加入20 g/ml、40 g/ml GDF11或者20 g/ml GDF11+50 μmol/l LY294002(PI3K特異性抑制劑),并設(shè)空白對(duì)照組,在特定時(shí)間點(diǎn)(成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第1、3、5、7 d)收集細(xì)胞,按試劑盒要求檢測(cè)ALP活性。

1.5 qPCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因 各組ADSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d后Trizol抽提總RNA,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA[10],SYBR Premix EX Taq進(jìn)行基因定量,再以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因,2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量并用β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?；蛞镉缮虾Ｓ⒔芎铣?引物序列見(jiàn)表1。

表1 小鼠成骨相關(guān)基因引物序列

1.6 Western blot檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路 對(duì)照組,GDF11組和GDF11+LY294002(50 μmol/l)組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后(每組5個(gè)復(fù)孔)進(jìn)行藥物干預(yù):先加LY294002 預(yù)處理30 min后加藥GDF11,加藥完成后繼續(xù)使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h。冰上收獲各組細(xì)胞的總蛋白。BCA法進(jìn)行定量后,參照Western blot常規(guī)方法[8]以相對(duì)表達(dá)表示PI3K和Akt的磷酸化水平。

2 結(jié) 果

2.1 GDF11對(duì)ADSCs細(xì)胞周期的影響 取P3代ADSCs,加入20 g/ml GDF11培養(yǎng)24 h后檢測(cè)GDF11對(duì)ADSCs細(xì)胞周期的影響,設(shè)計(jì)空白對(duì)照組。結(jié)果顯示,ADSCs處于G0/G1期的比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),說(shuō)明20 g/ml 濃度的GDF11對(duì)ADSCs的增殖潛能無(wú)影響(圖1)。

圖1 GDF11對(duì)小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期的影響A. 對(duì)照組;B.生長(zhǎng)分化因子組11;C.統(tǒng)計(jì)條圖;GDF11,生長(zhǎng)分化因子11。

2.2 GDF11對(duì)ALP活性的影響 在干預(yù)時(shí)間方面,ADSCs成骨分化的前5天,ALP酶活性逐漸增強(qiáng)。第5天后ALP酶活性開始變?nèi)?。在干預(yù)劑量方面,由于在≤40 g/ml GDF11干預(yù)劑量時(shí),ALP酶活性呈劑量依賴性增加且具有飽和性,故將本研究中GDF11的干預(yù)劑量設(shè)置為20 g/ml(表2)。

表2 GDF11對(duì)糖尿病小鼠ALP活性的影響

2.3 GDF11對(duì)成骨基因表達(dá)的影響 PCR結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,GDF11明顯促進(jìn)成骨相關(guān)基因Runx2、Osx和ALP的轉(zhuǎn)錄表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表3)。

表3 各組糖尿病小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

2.4 GDF11對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響 Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,GDF11顯著提高PI3K[(2.84±0.19)vs.(1.00±0.11)]和Akt[(4.58±0.20)vs.(1.00±0.19)]的磷酸化水平(P<0.05);當(dāng)加入LY294002后,GDF11升高p-PI3K[(1.21±0.15)vs.(2.84±0.19)]和p-Akt[(1.03±0.11)vs.(4.58±0.20)]表達(dá)的作用部分消失(P<0.05)。這說(shuō)明在BMSCs成骨分化的過(guò)程中,GDF11能激活PI3K/Akt信號(hào)通路(圖2)。

圖2 GDF11對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響GDF11.生長(zhǎng)分化因子11。

2.5 PI3K/Akt信號(hào)通路在GDF11促進(jìn)ADSCs成骨轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)中的作用 與GDF11組相比,當(dāng)加入PI3K抑制劑LY294002后,成骨相關(guān)基因Runx2、Osx、ALP和OCN的轉(zhuǎn)錄明顯下調(diào)(P<0.05,表4)。PI3K/Akt信號(hào)通路至少部分介導(dǎo)了GDF11促進(jìn)糖尿病小鼠ADSCs成骨轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的作用。

表4 PI3K/Akt信號(hào)通路在GDF11促進(jìn)糖尿病小鼠ADSCs成骨轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)中的作用

2.6 PI3K/Akt信號(hào)通路在GDF11促進(jìn)ALP活性中的作用 在ADSCs成骨分化的過(guò)程中,抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后,GDF11促進(jìn)ALP活性的作用明顯減弱。結(jié)果提示,PI3K/Akt信號(hào)通路至少部分介導(dǎo)了GDF11升高ALP活性的作用(表5)。

3 討 論

GDF11是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種具有“返老還童”作用的細(xì)胞因子,通過(guò)提高血循環(huán)中GDF11的水平能夠降低心[11]、腦[12]和骨骼肌[13]等多種組織發(fā)生老年性功能障礙。GDF11對(duì)干細(xì)胞分化也有影響,比如:促進(jìn)BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化并成血管[14],提高缺氧狀態(tài)下干細(xì)胞線粒體功能[15]。2型糖尿病是一種衰老相關(guān)性疾病,GDF11也能緩解和改善2型糖尿病及其并發(fā)癥[5-7]。本實(shí)驗(yàn)在這些研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)GDF11能促進(jìn)2型糖尿病小鼠ADSCs成骨分化。與Zhang等[16]的研究結(jié)果一致,GDF11通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ的激活促進(jìn)成骨細(xì)胞生成。但是GDF11在干細(xì)胞成骨分化中的作用依然有爭(zhēng)議,例如,在骨質(zhì)疏松發(fā)展過(guò)程中,GDF11抑制間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[17],通過(guò)激活Smad2/3信號(hào)通路抑制ADSCs成骨分化[18],抑制骨生成[19]等。在2型糖尿病住模型中,抑制GDF11表達(dá)才能促進(jìn)拔牙窩骨愈合和BMSCs成骨分化[20]。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相反,差異可能是由于研究對(duì)象、遺傳背景、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃陀^察方法等不同造成的。

PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞中一個(gè)經(jīng)典的與磷脂酰肌醇有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,也是RTK介導(dǎo)衍生的信號(hào)通路。在胰島素刺激及發(fā)揮生理功能時(shí)發(fā)揮主導(dǎo)作用,同時(shí)也參與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。PI3K/Akt信號(hào)通路始于RTK和細(xì)胞因子受體的活化,產(chǎn)生磷酸化的酪氨酸殘基,從而為募集PI3K向膜上轉(zhuǎn)位提供錨定位點(diǎn)。PI3K在被激活后會(huì)產(chǎn)生多種與膜結(jié)合的PI-3-P,Akt可以利用其PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合到這些錨定位點(diǎn)上,進(jìn)而完成下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在ADSCs成骨分化中的過(guò)程中,GDF11能激活PI3K/Akt信號(hào)通路;當(dāng)特異性地阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后,GDF11促進(jìn)糖尿病小鼠ADSCs成骨分化的作用部分消失,但未完全消失。與本研究結(jié)果類似,GDF11通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路正向調(diào)節(jié)人牙髓干細(xì)胞的牙源性分化與礦化[21]。雖然,本研究發(fā)現(xiàn)GDF11通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)2型糖尿病小鼠ADSCs成骨分化,但并不能排除其他的信號(hào)通路也可能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如,Wnt/β-catenin也是間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[22, 23],而GDF11促進(jìn)2型糖尿病小鼠ADSCs成骨分化的過(guò)程中是否也能激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路需要進(jìn)一步探討。

Runx2和Osx是干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中特異性表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子[24],ALP是成骨早期的表達(dá)產(chǎn)物,OCN是成骨進(jìn)入礦化期的標(biāo)志物[25]。本研究發(fā)現(xiàn),在成骨分化過(guò)程中,GDF11促進(jìn)2型糖尿病小鼠ADSCs細(xì)胞Runx2、Osx和ALP轉(zhuǎn)錄表達(dá),而對(duì)Gla轉(zhuǎn)錄表達(dá)無(wú)影響。這可能是由于本實(shí)驗(yàn)抽提RNA的時(shí)段尚處于ADSCs成骨分化的早期階段,而此時(shí)晚期成骨分化標(biāo)志物Gla的轉(zhuǎn)錄表達(dá)卻不明顯。GDF8與GDF11的氨基酸序列90%具有同源性[6],相似的氨基酸序列就決定了GDF8與GDF11可能具有相似的生物學(xué)功能。因此,GDF8能否促進(jìn)2型糖尿病小鼠ADSCs成骨分化需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中深入探討。GDF11及相關(guān)信號(hào)干預(yù)靶點(diǎn)可成為2型糖尿病患者種植區(qū)骨量不足治療的一種潛在手段。