張 藝,王 豐,蔡劉體,汪漢成,熊 晶,陳興江

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州省煙草科學(xué)研究院,貴州 貴陽(yáng) 550081; 3.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司,貴州 畢節(jié) 551700)

煙草赤星病(tobacco brown spot)是由子囊菌亞門(mén)鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌引起的煙草葉斑病,主要發(fā)生在煙葉成熟期,典型癥狀為褐色同心輪紋病斑,溫濕度適宜時(shí)可大面積流行成災(zāi)[1-3]。目前,煙草赤星病的防治主要以化學(xué)防治為主。腈菌唑是一種高效、低毒、廣譜、兼具保護(hù)和治療作用的三唑類(lèi)殺菌劑,對(duì)由子囊菌、擔(dān)子菌引起的病害具有較好防效[4-5],主要通過(guò)抑制真菌麥角甾醇的生物合成、破壞細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性,以及細(xì)胞的抗逆性達(dá)到殺菌目的[6]。目前,該藥劑在我國(guó)主要登記用于子囊菌引起的黑斑病、葉斑病、白粉病等病害的防治。在煙葉生產(chǎn)上,該藥劑主要用于煙草白粉病、赤星病的防治[7]。

植物葉際作為微生物的主要棲息地,為微生物的定殖提供了良好的生存環(huán)境。葉際微生物的菌群結(jié)構(gòu)與病害的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]。已有的研究發(fā)現(xiàn),健康與感病煙葉組織葉際微生物在菌群結(jié)構(gòu)與多樣性上均存在差異。目前,煙草赤星病危害期其葉際真菌和細(xì)菌的菌群組成已多有報(bào)道[10]。赤星病發(fā)生初期時(shí),不同成熟度健康與感病煙葉的優(yōu)勢(shì)真菌和細(xì)菌具有相似性,真菌優(yōu)勢(shì)菌屬均包括鏈格孢屬、亞隔孢殼屬、枝孢霉屬,細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬均包括假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌[11]。赤星病發(fā)生中后期時(shí),感赤星病煙葉葉際細(xì)菌群落中還存在大量泛菌屬細(xì)菌[12]。病害的發(fā)生會(huì)改變?nèi)~際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性,同時(shí),葉際微生物的菌群組成也會(huì)受寄主葉片成熟度、環(huán)境及藥劑的使用而發(fā)生變化[13]。已有的研究發(fā)現(xiàn),菌核凈可顯著抑制煙葉葉際鞘脂單胞菌屬、黃色桿菌屬和沙雷氏菌屬菌群的豐度[14],甲氧基丙烯酸酯類(lèi)的醚菌酯在防治煙草赤星病的過(guò)程中可顯著抑制鏈格孢屬、假單胞菌屬、泛菌屬等菌屬的豐度[15]。當(dāng)前,腈菌唑在我國(guó)用于煙草葉斑類(lèi)病害的防控已有多年,其對(duì)白粉病的防控效果優(yōu)于赤星病。作為煙草葉斑類(lèi)病害防控的常用藥劑,其在赤星病發(fā)生期應(yīng)用時(shí)的葉際微生態(tài)機(jī)制卻缺乏認(rèn)識(shí),特別是其應(yīng)用后,健康與感病煙葉葉際微生物的菌群結(jié)構(gòu)與代謝功能的調(diào)控規(guī)律仍不清楚。了解殺菌劑應(yīng)用后葉際微生物的響應(yīng)規(guī)律對(duì)指導(dǎo)藥劑的科學(xué)使用具有重要意義。

為此,本文采用高通量測(cè)序技術(shù)和Biolog代謝表型技術(shù),分析腈菌唑施藥后健康煙葉與感赤星病煙葉葉際真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及代謝功能,旨在了解腈菌唑施用不同時(shí)期內(nèi)煙葉葉際微生物的變化規(guī)律,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種云煙105,購(gòu)自云南省煙草公司玉溪市公司;12.50%腈菌唑微乳劑(ME),購(gòu)自北京東旺公司;GeneJET膠回收試劑盒和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒,均購(gòu)自Thermo Scientific公司。多功能?chē)婌F器,購(gòu)自貴州黔豐源農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司;自動(dòng)氣象站,配有溫度計(jì)(MC-KWS)、雨量計(jì)(MC-YL)和濕度計(jì)(MC-KWS)等,購(gòu)自北京新紅科技有限公司;Biolog ECO代謝板,購(gòu)自美國(guó)Biolog公司(USA, CA, Hayward)。

1.2 田間施藥處理

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年8月底在貴州省威寧縣黑石頭鎮(zhèn)進(jìn)行,選取煙株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙田劃分小區(qū),各試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)排列,每小區(qū)60株煙株,小區(qū)設(shè)3次重復(fù),各小區(qū)之間設(shè)保護(hù)行。12.50%腈菌唑微乳劑(ME)的每667 m2用量為60 mL,每667 m2用水量為60 L,試驗(yàn)時(shí)采用多功能?chē)婌F器將藥液均勻噴霧至煙葉表面,直至液滴流失。使用自動(dòng)氣象站檢測(cè)并記錄試驗(yàn)過(guò)程中的降雨量、溫度和空氣相對(duì)濕度,并分別于施藥前0 d、施藥后5、10、15 d,各小區(qū)隨機(jī)選取10株煙株調(diào)查煙葉發(fā)病情況,計(jì)算各時(shí)期的病情指數(shù)[16]。

1.2.2 樣品采集

于施藥前0 d,施藥后5、10、15 d分別取樣,采用消毒剪刀分別剪取煙株中下部相同部位的感病與健康組織煙葉樣品,分別裝入50 mL無(wú)菌離心管中,每處理3次重復(fù)。樣品采集后放入低溫保存箱,并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)研究,樣品編號(hào)如表1所示。

表1 樣品采集信息

1.3 煙葉葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)與代謝功能差異分析

1.3.1 葉際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性

采用CTAB[17]法提取煙葉葉際微生物的基因組DNA,使用NanoDrop 2000測(cè)定DNA濃度和純度,檢測(cè)合格后用于構(gòu)建文庫(kù)。以上述樣品的總DNA為模板,以真菌引物ITS1-5F-F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS1-1F-R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對(duì)葉際微生物基因組DNA ITS1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以細(xì)菌引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)樣品葉際微生物基因組DNA 16S-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序和擴(kuò)增體系參照文獻(xiàn)[18-19]的方法進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后,使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建,采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序分析,以上分析均在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3.2 葉際微生物代謝功能

分別取施藥前后不同部位煙葉混合樣品各1 g,將其置于盛有50 mL 0.8%的無(wú)菌生理鹽水的100 mL三角瓶中,28 ℃下以180 r·min-1振蕩搖培2 h,取出后靜置30 min,取100 μL上清液依次分別加入到ECO代謝板的測(cè)試孔中[20]。將ECO代謝板置于OmniLog恒溫培養(yǎng)箱,28 ℃培養(yǎng)7 d,采用Biolog D5E_OKA_data.exe軟件收集煙葉葉際微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中代謝孔內(nèi)顏色變化值,收集后使用HemI軟件制作熱圖分析樣品葉際微生物的代謝功能[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)FLASH和Trimmomatie軟件進(jìn)行過(guò)濾優(yōu)化和雙端序列連接[21]。優(yōu)質(zhì)序列

使用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)對(duì)相似度≥97%的序列進(jìn)行OTU(operational taxonomic units)聚類(lèi),并在聚類(lèi)過(guò)程去除單序列和嵌合體[22]。真菌和細(xì)菌分別通過(guò)UNIT數(shù)據(jù)庫(kù)[23]和SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋[24]。采用QIIME V1.9.1軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)[25],運(yùn)用SPSS軟件對(duì)真菌和細(xì)菌的Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析。利用R軟件(Version 2.15.3)繪制真、細(xì)菌稀釋曲線圖、物種積累箱形圖、門(mén)屬水平相對(duì)豐度圖、借環(huán)境因子Spearman相關(guān)性圖,分析樣品微生物群落與多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 感赤星病與健康煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的差異

2.1.1 測(cè)序深度分析

本次測(cè)序共8組24個(gè)樣品,在真菌群落中,測(cè)序深度接近800、OTU數(shù)量接近300時(shí)曲線物種累積箱和趨于平緩(圖1-A、C)。在細(xì)菌群落中,測(cè)序深度和OTU數(shù)量均接近300時(shí)趨于平緩(圖1-B、D)。二者趨于平緩表明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋了樣品中絕大多數(shù)物種,抽樣充分,可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

A,真菌OTU測(cè)序深度;B,細(xì)菌OTU測(cè)序深度;C,真菌水平物種累積箱形圖;D細(xì)菌水平物種累積箱形圖。A, OTU sequencing depth of fungi; B, OTU sequencing depth of bacteria; C, Horizontal species accumulation of fungi; D, Horizontal species accumulation of bacteria.圖1 煙葉樣品真菌、細(xì)菌的OTU測(cè)序深度和水平物種累積箱形圖Fig.1 Box diagram of OTU sequencing depth and horizontal species accumulation for fungi and bacteria in tobacco samples

2.1.2 葉際真菌和細(xì)菌Alpha多樣性差異

腈菌唑處理前后感病煙葉與健康煙葉葉際真菌和細(xì)菌群落的覆蓋度指數(shù)分別在0.97、0.81以上,表明測(cè)序數(shù)據(jù)合理,可以真實(shí)、合理地反映真菌和細(xì)菌的群落分布。在真菌群落結(jié)構(gòu)中,施藥前后感病煙葉葉際真菌群落的多樣性和豐富度指數(shù)均低于健康煙葉。感病煙葉的多樣性指數(shù)在施藥5 d時(shí)升高,10 d時(shí)降低,15 d時(shí)升高,豐富度指數(shù)則一直保持上升趨勢(shì);健康煙葉的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均保持上升趨勢(shì)(表2)。

表2 煙葉葉際真菌和細(xì)菌Alpha多樣性差異(OTU水平)

在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中,施藥前后感病煙葉葉際細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)均高于健康煙葉,感病煙葉和健康煙葉的多樣性指數(shù)在施藥5 d時(shí)降低,10、15 d時(shí)升高。感病煙葉在施藥5 d時(shí)豐富度指數(shù)降低,而后保持上升趨勢(shì);健康煙葉豐富度指數(shù)一直保持上升趨勢(shì)(表2)。

2.1.3 施藥不同時(shí)期的群落多樣性與相對(duì)豐度的差異

真菌群落在門(mén)水平上,子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)為施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的優(yōu)勢(shì)菌群。施藥前后感病煙葉的子囊菌門(mén)相對(duì)豐度均高于健康煙葉,而擔(dān)子菌門(mén)與之相反。施藥前感病煙葉和健康煙葉的子囊菌門(mén)相對(duì)豐度分別為93.67%、63.90%,施藥后相對(duì)豐度均降低。施藥前感病煙葉和健康煙葉的擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度分別為2.52%、6.77%,施藥后感病煙葉的擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度在施藥5、10 d時(shí)降低,15 d時(shí)增加;健康煙葉擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度在施藥5 d時(shí)降低,10 d、15 d時(shí)增加(圖2-A)。

A、C分別為真菌門(mén)水平和屬水平;B、D分別為細(xì)菌門(mén)水平和屬水平。A and C are at the fungal phylum and genus level, respectively; B and D are at the bacterial phylum and genus level, respectively.圖2 感病與健康煙葉真菌和細(xì)菌群落組成相對(duì)豐度圖Fig.2 Relative abundance of fungal and bacterial community composition of diseased and healthy tobacco leaves

細(xì)菌群落在門(mén)水平上,變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)為施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的優(yōu)勢(shì)菌群,且施藥前后感病煙葉的變形菌門(mén)相對(duì)豐度均高于健康煙葉。施藥前感病煙葉和健康煙葉的變形菌門(mén)相對(duì)豐度分別為38.81%、6.04%,感病與健康煙葉施藥后5 d、10 d時(shí)相對(duì)豐度均降低,15 d時(shí)均增加。施藥前感病煙葉和健康煙葉的厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度分別為0.56%、16.33%,施藥后感病煙葉相對(duì)豐度增加,而健康煙葉施藥后相對(duì)豐度降低(圖2-B)。

施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的主要真菌菌屬為鏈格孢屬(Alternaria)、谷菌根菌屬(Archaeorhizomyces)、Boeremia、枝孢霉屬(Cladosporium)、Symmetrospora、亞隔孢殼屬(Didymella)、附球菌屬(Epicoccum),其中鏈格孢屬為優(yōu)勢(shì)菌屬,施藥前感赤星病煙葉中鏈格孢屬相對(duì)豐度(84.40%)遠(yuǎn)高于健康煙葉(36.48%)。施藥5 d時(shí),感病煙葉與健康煙葉中相對(duì)豐度降低的菌屬為鏈格孢屬(分別降低了5.52%、11.40%)、枝孢霉屬(0.80%、9.72%)、Boeremia(0.35%、5.29%)、Symmetrospora(1.57%、0.73%);而亞隔孢殼屬(0.37%、0.1%)相對(duì)豐度增加。施藥10 d時(shí),感病與健康煙葉中相對(duì)豐度降低的菌屬為枝孢霉屬(4.93%、2.37%),以及感病煙葉中的Boeremia(0.15%),健康煙葉中的附球菌屬(0.59%)、鏈格孢屬(6.13%);感病煙葉相對(duì)豐度增加的菌屬為鏈格孢屬(11.59%)、Symmetrospora(0.02%)、亞隔孢殼屬(0.02%);健康煙葉相對(duì)豐度增加的菌屬為谷菌根菌屬(4.15%)、Boeremia(0.09%)、Symmetrospora(5.89%)。施藥15 d時(shí),感病與健康煙葉中相對(duì)豐度降低的菌屬為鏈格孢屬(23.08%、8.43%),健康煙葉相對(duì)豐度降低的菌屬為枝孢霉屬(0.24%)、Symmetrospora(0.79%)、亞隔孢殼屬(0.03%)、附球菌屬(0.87%);感病與健康煙葉中相對(duì)豐度增加的菌屬為Boeremia(0.74%、0.20%),感病煙葉相對(duì)豐度增加的菌屬為亞隔孢殼屬(1.21%)、附球菌屬(0.60%),健康煙葉相對(duì)豐度增加的菌屬為谷菌根菌屬(1.21%)(圖2-C)。

細(xì)菌群落在屬水平上,施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的主要菌屬為科薩克氏菌屬(Kosakonia)、乳球菌屬(Lactococcus)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、魏斯氏菌屬(Weissella)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、馬賽菌屬(Massilia),甲基桿菌屬(Methylobacterium)、其中科薩克氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬,施藥前感赤星病煙葉中科薩克氏菌屬相對(duì)豐度(23.38%)遠(yuǎn)高于健康煙葉(3.47%)。施藥5 d時(shí),感病煙葉中相對(duì)豐度降低的菌屬為魏斯氏菌屬(0.1%)、假單胞菌屬(4.92%)、馬賽菌屬(2.01%),健康煙葉相對(duì)豐度降低的菌屬為科薩克氏菌屬(2.46%)、泛菌屬(1.90%);感病煙葉相對(duì)豐度增加的菌屬為科薩克氏菌屬(4.14%)、乳球菌屬(18.12%)、泛菌屬(6.04%)、甲基桿菌屬(0.22%),健康煙葉相對(duì)豐度增加的有假單胞菌屬(1.23%)、乳球菌屬(0.78%)。施藥10 d時(shí),感病與健康煙葉中相對(duì)豐度降低的菌屬為科薩克氏菌屬(25.84%、0.78%)、乳球菌屬(17.45%、0.78%)、泛菌屬(4.70%、0.22%),以及感病煙葉的甲基桿菌屬(0.11%);感病煙葉相對(duì)豐度增加的菌屬為鞘脂單胞菌屬(0.89%)、假單胞菌屬(8.05%)、馬賽菌屬(1.23%),健康煙葉相對(duì)豐度增加的菌屬為鞘脂單胞菌屬(0.22%)、甲基桿菌屬(0.56%)。施藥15 d時(shí),感病與健康煙葉中相對(duì)豐度降低的菌屬為鞘脂單胞菌屬(0.34%、0.11%)以及感病煙葉的乳球菌屬(0.67%)、假單胞菌屬(6.38%)、馬賽菌屬(1.01%),健康煙葉的鞘脂單胞菌屬(0.11%)、甲基桿菌屬(0.34%);感病煙葉相對(duì)豐度增加的菌屬為科薩克氏菌屬(12.42%)、泛菌屬(17.00%),健康煙葉相對(duì)豐度增加的菌屬為科薩克氏菌屬(3.92%)、泛菌屬(9.62%)、假單胞菌屬(2.46%)、馬賽菌屬(0.11%)(圖2-D)。

2.1.4 環(huán)境因子對(duì)煙草葉際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

在試驗(yàn)開(kāi)展期間該地區(qū)長(zhǎng)時(shí)間有小雨。自動(dòng)氣象站測(cè)量結(jié)果顯示,在施藥前0 d、施藥后5 d、10 d、15 d時(shí)的降雨量分別為13.60、19.00、11.30和25.40 mm;溫度分別為18.32、18.97、17.51和16.54 ℃;空氣相對(duì)濕度分別為82.49%、83.81%、78.99%和90.98%;病情指數(shù)分別為44.44、48.14、63.58、70.55(表3)。

表3 環(huán)境因子與病情指數(shù)

本文對(duì)葉際真菌和細(xì)菌top50的菌屬進(jìn)行Spearman相關(guān)分析,結(jié)果顯示,在真菌屬水平上,取樣時(shí)間與粉褶蕈屬(Entoloma)、青霉菌屬(Penicillium)、擬孔菌屬(Fomitiporia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、木霉屬(Trichoderma)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、亞隔孢殼屬(Didymella)、枝孢霉屬(Cladosporium)的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān);與浪梗霉屬(Polythrincium)的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān);與谷菌根菌屬(Archaeorhizomyces)的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。溫度與粉褶蕈屬(Entoloma)、青霉菌屬(Penicillium)、擬孔菌屬(Fomitiporia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、木霉屬(Trichoderma)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、枝孢霉屬(Cladosporium)的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān),與浪梗霉屬(Polythrincium)的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)。相對(duì)濕度和降雨量與擬孔菌屬(Fomitiporia)的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)。病情指數(shù)與Plectosphaerella、畢赤酵母菌屬(Pichia)、黑團(tuán)孢屬(Periconia)的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān);與尾孢菌屬(Cercospora)、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉菌屬(Aspergillus)、Boeremia的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān),與鏈格孢屬(Alternaria)呈極顯著正相關(guān)(圖3-A)。

*, P<0.05; **, P<0.01.圖3 腈菌唑處理后葉際真菌(A)和細(xì)菌(B)群落的Spearman相關(guān)分析熱圖Fig.3 Heat map of Spearman correlation analysis based on phyllosphere fungal (A) and bacterial (B) communities after myclobutanil treatment

在細(xì)菌屬水平上,取樣時(shí)間與紅球菌屬(Rhodococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān);與Quadrishaera、Aureimonas、西地西菌屬(Cedecea)、阿克曼菌屬(Akkermansia)、沙雷菌屬(Serratia)的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)。溫度與Quadrishaera、Aureimonas、西地西菌屬(Cedecea)、阿克曼菌屬(Akkermansia)、沙雷菌屬(Serratia)的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。相對(duì)濕度和降雨量與Quadrishaera、金色單胞菌屬(Aureimonas)、西地西菌屬(Cedecea)、沙雷菌屬(Serratia)、泛菌屬(Pantoea)的相對(duì)豐度均呈顯著正相關(guān)。病情指數(shù)與鏈球菌屬(Streptococcus)、未經(jīng)鑒定的腸桿菌科(undentified-Enterobactericeae)的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(圖3-B)。

2.2 腈菌唑?qū)Ω谐嘈遣∨c健康煙葉葉際微生物代謝功能的差異

本文采用Biolog-ECO微孔板對(duì)施藥前后煙葉樣品進(jìn)行代謝功能分析,Biolog ECO微孔板中含有羧酸類(lèi)、氨基酸、糖類(lèi)、雙親化合物、聚合物和胺/氨基化合物共31種碳源。施藥前,感病煙葉葉際微生物對(duì)α-丁酮酸、L-蘇氨酸的代謝較弱;對(duì)葡萄糖-1-磷酸鹽、4-羥基苯甲酸、α-環(huán)式糊精、D,L-α-甘油的代謝程度一般,對(duì)其他碳源代謝均可高效代謝,尤其是對(duì)α-D-乳糖、D-甘露醇、D-半乳糖酸內(nèi)酯、γ-羥基丁酸、L-天冬酰胺酸、吐溫40、吐溫80。健康煙葉葉際微生物對(duì)α-丁酮酸的代謝較弱,對(duì)2-羥基苯甲酸代謝程度一般,對(duì)其他碳源代謝均可高效代謝。施藥5 d時(shí),感病煙葉葉際微生物對(duì)α-丁酮酸代謝程度增加,對(duì)D-葡糖胺酸、α-環(huán)式糊精代謝程度保持不變,其余碳源代謝程度均降低;健康煙葉葉際微生物對(duì)所有碳源代謝程度均降低。施藥10 d時(shí),相較于施藥前和施藥5 d時(shí),感病煙葉葉際微生物對(duì)α-丁酮酸代謝程度增加,對(duì)其余碳源代謝均降低;健康煙葉相較于施藥前,α-丁酮酸代謝程度增加,其余碳源代謝程度均降低,相較于施藥5 d時(shí),α-D-乳糖、D-半乳糖醛酸、苯乙基胺等11種碳源代謝程度保持不變,D-纖維二糖、D-木糖、丙酮酸甲酯等14種碳源代謝程度增加,對(duì)其余碳源代謝程度均降低。施藥15 d時(shí),相較于施藥前,感病煙葉葉際微生物對(duì)α-丁酮酸代謝程度增加,其余碳源代謝程度均降低,相較于施藥10 d時(shí),D-纖維二糖、α-D-乳糖、D-葡糖胺酸等8種碳源代謝程度均增加,2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、α-丁酮酸代謝程度均降低,其余碳源代謝程度均增加;健康煙葉相較于施藥前,所有碳源代謝程度均降低,相較于施藥10 d時(shí),苯乙基胺、L-精氨酸、L-苯基丙氨酸等6種碳源代謝程度增加,D-木糖、L-絲氨酸、D-半乳糖醛酸等10種碳源代謝程度不變,其余碳源代謝程度均降低(圖4)。

顏色值分別代表微生物代謝碳源的程度,122～<192為代謝程度低,192～262為代謝程度一般,262以上為代謝程度高。The color values represent the degree of the microbes metabolizing carbon sources. The value 122-<192, 192-262 and >262 represent the leaf microbes metabolized in Biolog ECO microplate poorly, moderately, effectively, respectively.圖4 煙葉葉際微生物代謝功能聚類(lèi)熱圖Fig.4 Cluster heat map of phyllosphere microbial metabolic function in tobacco leaves

3 討論

葉際微生物在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡和葉片健康方面均具有不可忽視的作用[26-27]。已有研究發(fā)現(xiàn)煙草赤星病危害期其葉際優(yōu)勢(shì)真菌為鏈格孢屬,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有泛菌屬和假單胞菌屬[11]。本文采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)應(yīng)用腈菌唑前后感赤星病煙葉和健康煙葉葉際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)施藥前后感病和健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌菌群均為子囊菌門(mén),其次為擔(dān)子菌門(mén);優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群為變形菌門(mén),其次為厚壁菌門(mén)。感赤星病煙葉和健康煙葉施藥前后的真菌有鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬、Boeremia、Symmetrospora等菌屬,優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈格孢屬。施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的主要細(xì)菌有泛菌屬、假單胞菌屬、鞘脂單胞菌屬等,其中優(yōu)勢(shì)菌屬為泛菌屬。這與前人對(duì)于感赤星病煙葉采烤后優(yōu)勢(shì)真菌菌群和感赤星病煙葉成熟期優(yōu)勢(shì)真菌與細(xì)菌菌群的研究結(jié)果一致[12,28]。進(jìn)一步證實(shí)鏈格孢屬為赤星病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌,泛菌屬、假單胞菌屬為葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。本文研究發(fā)現(xiàn),感病煙葉的真菌鏈格孢屬相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于健康煙葉,說(shuō)明煙草感赤星病時(shí),鏈格孢屬占據(jù)主導(dǎo)地位;其余真菌(枝孢霉屬、Symmetrospora、亞隔孢殼屬等)和細(xì)菌(泛菌屬、假單胞菌屬等),在煙草亞隔孢葉斑病和煙葉霉?fàn)€病危害期均出現(xiàn)[29-30],為此,推測(cè)這些菌屬為煙葉上的習(xí)居菌。

藥劑的使用會(huì)改變?nèi)~際微生物群落結(jié)構(gòu)[31]。研究發(fā)現(xiàn),施用菌核凈會(huì)使煙葉葉際細(xì)菌中鞘脂單胞菌屬、黃色桿菌屬和沙雷氏菌屬的相對(duì)豐度降低[14];高效氯氰菊酯在推薦使用劑量范圍內(nèi)使用會(huì)引起植物葉際真菌生物量的降低和細(xì)菌生物量的增加[32];白僵菌的施用也會(huì)使水稻葉際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變[33]。本文發(fā)現(xiàn),施藥后感病煙葉和健康煙葉葉際病原真菌鏈格孢屬的相對(duì)豐度均降低,說(shuō)明腈菌唑能有效防治煙草赤星病的發(fā)生。本文通過(guò)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),病情指數(shù)與鏈格孢屬呈極顯著正相關(guān),表明病情指數(shù)越大,鏈格孢屬的相對(duì)豐度越高,而病情指數(shù)與尾孢菌屬、鐮孢菌屬、曲霉屬、Symmetrospora的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān),推測(cè)這些菌屬與鏈格孢屬之間存在潛在的競(jìng)爭(zhēng)作用,但其具體機(jī)理及這些真菌是否參與侵染有待進(jìn)一步研究。除靶標(biāo)病原菌外,腈菌唑會(huì)影響煙葉包括附球菌屬、枝孢霉屬、Symmetrospora、亞隔孢殼屬等在內(nèi)的多種病原真菌,同時(shí)也會(huì)影響包括假單胞屬、泛菌屬在內(nèi)的多種非致病細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化,這與前人研究結(jié)果類(lèi)似[12]。此外,腈菌唑作為三唑類(lèi)殺菌劑的典型代表,已在多種作物上登記,本文研究結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了腈菌唑的廣譜性。

高多樣性和豐度水平的葉際微生物群落可能有助于提高葉際環(huán)境的功能冗余,維持宿主植物的健康水平[34]。本文利用Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)用作表征微生物群落多樣性和衡量微生物群落豐富度,研究發(fā)現(xiàn),感赤星病煙葉的葉際真菌群落多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均低于健康煙葉,且存在顯著性差異,結(jié)果與煙草靶斑病[35]等真菌性病害的相關(guān)葉際微生物多樣性與豐富度研究結(jié)果一致,推測(cè)真菌性病害的發(fā)生均會(huì)降低葉際菌群的豐富度與多樣性,也進(jìn)一步證明菌群高豐富度和多樣性更有利于維持宿主植物的健康水平。腈菌唑應(yīng)用后感病煙葉真菌的多樣性先升高,后降低,而后升高;豐富度一直保持上升趨勢(shì),而細(xì)菌多樣性和豐富度均先降低,而后升高。健康煙葉真菌多樣性和豐富度一直保持上升趨勢(shì),而細(xì)菌多樣性先降低,而后升高,豐富度則一直保持上升趨勢(shì)。說(shuō)明藥劑處理顯著改變了葉際微生物群落多樣性與豐富度,本文研究結(jié)果與前人研究發(fā)現(xiàn)施用拮抗菌群、殺菌劑會(huì)改變感野火病、赤星病煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果類(lèi)似[15,36]。

葉際微生物群落對(duì)碳源代謝活性的強(qiáng)弱能反映代謝功能的強(qiáng)弱。本文利用Biolog-ECO技術(shù)研究分析了施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉對(duì)常見(jiàn)31種碳源的碳源利用差異,體現(xiàn)煙葉葉際微生物整體活性和微生物群落生態(tài)功能,發(fā)現(xiàn)施藥前感病煙葉對(duì)α-丁酮酸、L-蘇氨酸利用較弱外,還有少數(shù)幾個(gè)碳源利用程度較低。而健康煙葉除了對(duì)α-丁酮酸的代謝較弱,對(duì)2-羥基苯甲酸代謝程度一般,對(duì)其他碳源代謝均可高效代謝。說(shuō)明感病煙葉葉際微生物對(duì)于碳源的代謝能力低于健康煙葉,健康煙葉的生物活性高于感病煙葉。腈菌唑處理后,相較于施藥前,感病煙葉與健康煙葉的碳源利用降低,隨著時(shí)間的增加,對(duì)碳源的利用又逐漸升高,健康煙葉恢復(fù)對(duì)碳源利用能力比感病煙葉強(qiáng)。表明腈菌唑能快速降低感赤星病煙葉與健康煙葉葉際微生物的代謝活性,很大程度上改善了煙葉葉際微環(huán)境,但對(duì)于健康煙葉的活性影響比感病煙葉小,隨著施藥時(shí)間的增加,代謝活性緩慢增加,表明腈菌唑在煙葉上的持效期有限,其用于赤星病防控時(shí)可適當(dāng)增加藥劑施用次數(shù)。

4 結(jié)論

赤星病發(fā)生期,感病煙葉和健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)菌屬均為鏈格孢屬、科薩克氏菌屬,但赤星病煙葉中鏈格孢屬、泛菌屬相對(duì)豐度高于健康煙葉,而真菌和細(xì)菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均低于健康煙葉。腈菌唑施用后降低了赤星病煙葉和健康煙葉葉際主要優(yōu)勢(shì)菌屬鏈格孢屬的相對(duì)豐度、增加了科薩克氏菌屬相對(duì)豐度;感赤星病煙葉葉際真菌多樣性和豐富度指數(shù)先降低,而后增加,健康煙葉中多樣性和豐富度指數(shù)均增加。施藥前赤星病煙葉對(duì)碳源的代謝能力低于健康煙葉,健康煙葉能高效代謝幾乎所有碳源。施藥后二者碳源代謝程度均降低,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),碳源代謝程度逐漸恢復(fù)。