曹威榮， 王燕飛， 張若男， 賈 浩， 劉 璇， 張利環(huán)

（1.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 朔州 036002；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801）

黃羽肉雞抗病力和對(duì)劣質(zhì)飼料的適應(yīng)性強(qiáng)，易飼養(yǎng)，具有較高的繁殖性能，肉質(zhì)風(fēng)味與口感也較佳。我國(guó)黃羽肉雞種類繁多，其中黃麻肉雞體型圓潤(rùn)、整體發(fā)育勻稱、雞皮較薄、皮下脂肪適中，肉中富含較高蛋白和維生素A，具早熟易肥、肉質(zhì)緊實(shí)滑嫩等特點(diǎn)，因此在全國(guó)被廣泛養(yǎng)殖（阿卜杜熱合曼·達(dá)尼亞爾，2018）。 食用動(dòng)物攝取的抗生素，以及產(chǎn)生的食物中的抗生素殘留， 已被公認(rèn)為人類耐藥性迅速增加的主要原因之一 （Davies 等，2010）。 濫用抗生素飼喂食用動(dòng)物，會(huì)直接選擇對(duì)抗生素有抗藥性的微生物， 并把食用動(dòng)物的系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成抗生素抗藥性基因的貯存庫(kù)（Claesson 等，2012）。因此，減少食用抗生素的攝入量，消除食用動(dòng)物農(nóng)業(yè)中的抗生素殘留， 已成為食品安全和公共衛(wèi)生的首要任務(wù)。

目前，在養(yǎng)雞業(yè)中，飼料中抗生素的替代品包括纖維降解酶、益生菌、益生元、共生元和植物生物元素等（Sopkova 等，2017）。 其中益生菌生產(chǎn)成本低，在不同種類的宿主動(dòng)物中應(yīng)用范圍廣，具有優(yōu)勢(shì)（Gaggia 等，2010）。益生菌被定義為在機(jī)體內(nèi)定植一段時(shí)間后可改善腸道微生態(tài)并對(duì)宿主動(dòng)物產(chǎn)生積極影響的活性微生物 （Sanders 等，2008）。干酪乳桿菌、 嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌一起被稱為“健康三益菌”。 乳酸菌是一種非致病性和毒素性的革蘭氏陽(yáng)性發(fā)酵菌，無(wú)芽孢與鞭毛，菌落白色粗糙，區(qū)別于其他厭氧菌，大多數(shù)可以在氧氣存在下生長(zhǎng)。雙歧桿菌是定居于人胃腸道的微生物之一，雖不屬于乳酸菌， 但可以產(chǎn)生乳酸。 在飲用含有1×109CFU 的干酪乳桿菌溶液時(shí)， 益生菌因其特性對(duì)胃液、 水解酶和膽汁酸具有高耐受性并可在胃腸道中存活并停留3 d（Radicioni 等，2019）。 乳酸菌在腸道中因可分泌諸如細(xì)菌素的抗菌物質(zhì)而具有抗炎性和抑菌特性，產(chǎn)生的酸可降低腸道pH并防止產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖，有利于腸道健康。

RNA-seq 數(shù)據(jù)的高分辨率不僅可以探索基因表達(dá)， 還可以預(yù)測(cè)動(dòng)物中的可變剪接事件（Li等，2019）。 RNA-seq 可以反映出mRNA、smallRNA、noncodingRNA 等或者其中一些的表達(dá)水平，有助于查看突變/SNP 和基因表達(dá)隨時(shí)間的變化（Maher 等，2009），還可以查看miRNA、tRNA 和核糖體分析等（Ingolia 等，2012）。SNP 是一種基于核苷酸變異性的有效遺傳標(biāo)記， 在動(dòng)物遺傳學(xué)研究和育種中有著廣泛的應(yīng)用（Li 等，2019）。 可變剪接是真核生物中的一種正?，F(xiàn)象， 其帶來(lái)了重要的蛋白質(zhì)多樣性并允許基因產(chǎn)生不同的mRNA轉(zhuǎn)錄本， 這些轉(zhuǎn)錄本被翻譯成不同的蛋白質(zhì)（Li等，2020）。

本試驗(yàn)對(duì)肉雞回腸進(jìn)行了新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)掘和注釋、可變剪接和SNP 分析，以期為益生菌飼喂肉雞新基因的挖掘提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)， 進(jìn)而更好的探究其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌與雙歧桿菌凍干菌粉有效活菌數(shù)為1×1010CFU/g， 凍干菌粉購(gòu)自陜西瑞茂生物科技有限責(zé)任公司，復(fù)合菌制劑（干酪乳桿菌：嗜酸乳桿菌：雙歧桿菌=1:1:2）（Zhang 等，2022）。200 只1 日齡黃麻肉雞（公母各半，購(gòu)自太谷縣田建勝養(yǎng)殖場(chǎng)）隨機(jī)分為2 組，每組5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20 只。 對(duì)照組正常飲水，益生菌組飲用水中補(bǔ)充1%復(fù)合菌制劑，試驗(yàn)分為生長(zhǎng)前期（1 ～21 d）、后期（22 ～42 d）兩個(gè)階段。 基礎(chǔ)日糧配制參照NRC（1994）和《NY/T 33-2004 雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（表1）。 42 日齡時(shí)進(jìn)行肉雞屠宰試驗(yàn)，取回腸后用生理鹽水將其沖洗干凈，分裝后液氮速凍，并于-80 ℃保存。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 RNA-Seq 測(cè)序 從對(duì)照組和益生菌組隨機(jī)抽取3 個(gè)樣本 （編號(hào)為C1、C2、C3 和P1、P2、P3）送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，使用Illumina Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA sequencing，RNA-Seq）。

1.3 新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)掘 使用Cufflinks 軟件對(duì)Mapped Reads 進(jìn)行拼接，并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較，尋找原來(lái)未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)，發(fā)掘該物種的新轉(zhuǎn)錄本和新基因。

1.4 新轉(zhuǎn)錄本功能注釋 使用BLAST 軟件將發(fā)掘的新轉(zhuǎn)錄本分別與KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）、COGs （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）、GO （http://www.geneontology.org/）、NR（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/）、Swiss -Prot （ftp://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release）、Pfam（http://pfam.xfam.org/）等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)來(lái)獲得測(cè)序所得肉雞新轉(zhuǎn)錄本的注釋信息。

1.5 可變剪接分析及差異可變剪接基因分析使用rMATS（http://rnaseq-mats.sourceforge.net/index.html）對(duì)RNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行可變剪接分析。利用GO、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異可變剪接基因富集分析。

1.6 SNP 分析 使用Sentieon 進(jìn)行SNP 分析，得到SNP 信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果及與參考基因組比對(duì)分析 如表2 所示，樣本過(guò)濾后的Clean reads 數(shù)占Raw reads 的比例為98.26% ～98.91%， 且Clean bases 占Raw bases 的比例為96.16% ～97.48%；測(cè)序堿基平均錯(cuò)誤率均為0.026%以下；堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基所占百分比均在97.51%以上， 堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基所占百分比均在93.27%以上，GC 含量在樣本中所占比例為49.09% ～51.12%，沒(méi)有分離現(xiàn)象，說(shuō)明測(cè)序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，符合測(cè)序要求。

表2 序列質(zhì)量和比對(duì)信息匯總統(tǒng)計(jì)

測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)率為89.04% ～91.48%， 說(shuō)明不存在污染且比對(duì)基因組正確；在參考序列上有唯一位置的比對(duì)率為86.88% ～89.35%， 在參考序列上有多個(gè)位置的比對(duì)率為2.13% ～2.39%，說(shuō)明基因比對(duì)效果較好，且基因覆蓋均一度較好。

2.2 新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)掘及注釋 如圖1 所示，將測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組注釋信息進(jìn)行比對(duì)， 共發(fā)現(xiàn)1047 個(gè)新基因， 注釋到GO、KEGG、COG、NR、Swiss-Prot、Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因分別有276、196、323、567、250、247 個(gè)。

圖1 各數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的新基因數(shù)

如表3 所示， 將高通量測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組注釋信息進(jìn)行比較，共發(fā)現(xiàn)20176 個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，注釋到GO、KEGG、COG、NR、Swiss-Prot、Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)的新轉(zhuǎn)錄本數(shù)分別為13739、13488、17693、18764、17499、16655。

表3 各數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的新轉(zhuǎn)錄本數(shù)

如圖2 所示， 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的新基因共276 個(gè)基因在GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到歸類注釋。 分子功能主要集中在結(jié)合性、催化活性等多個(gè)分類中；在細(xì)胞組分分類中，主要集中于生物膜組分、細(xì)胞成分、細(xì)胞器等中；在生物學(xué)過(guò)程分類中，主要集中在細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、生物調(diào)控等中。

圖2 新基因GO 分類注釋圖

2.3 肉雞可變剪接分析及差異可變剪接基因分析 如圖3 所示， 其中SE 占可變剪接類型的比例最高， 達(dá)到70.11% ～70.28%，A5SS、A3SS、MXE、RI 分別占各個(gè)階段可變剪接事件總量的6.80% ～7.75%、1.04% ～1.19%、5.80% ～6.12%、4.49% ～5.18%。

圖3 可變剪接事件統(tǒng)計(jì)圖

如圖4 所示，共篩選到1131 個(gè)顯著的差異剪接基因， 在SE、A5SS、A3SS、MXE、RI 事件中鑒定到的差異剪接基因數(shù)分別為588、139、176、136、92。

圖4 差異剪切基因統(tǒng)計(jì)圖

如圖5 所示，在SE 中外顯子排斥有327 個(gè)，外顯子包含有410 個(gè)； 在A3SS 中外顯子排斥有99 個(gè)，外顯子包含有101 個(gè)；在A5SS 中外顯子排斥有72 個(gè)，外顯子包含有87 個(gè)；在MXE 中外顯子排斥有138 個(gè)，外顯子包含有117 個(gè)；在RI 中外顯子排斥有55 個(gè)，外顯子包含有58 個(gè)。

圖5 可變剪接事件數(shù)目外顯子納入和排斥統(tǒng)計(jì)圖

如圖6 所示， 對(duì)獲得的差異剪接基因進(jìn)行GO 富集分析，圖中展示了前20 個(gè)GO 條目，富集到了與代謝和免疫相關(guān)的GO 條目， 如大分子代謝過(guò)程的調(diào)控、 磷脂酰肌醇磷酸4-磷酸酶活性、細(xì)胞代謝過(guò)程、免疫反應(yīng)的正調(diào)控、大分子代謝過(guò)程的正調(diào)控。

圖6 差異剪切基因GO 富集柱狀圖

如圖7 所示，差異可變剪接基因KEGG 富集到了以下通路， 胞吞作用、MAPK 信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、GnRH 信號(hào)通路、 黏附連接、TNF 信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、ErbB 信號(hào)通路等。

圖7 差異剪切基因KEGG 富集氣泡圖

2.4 SNP 分析 由表4 可知， 轉(zhuǎn)換SNP 所占百分比為73.53% ～73.94%； 顛換型SNP 所占百分比為26.05% ～26.47%， 在各樣品中大多數(shù)堿基取代均為轉(zhuǎn)換大于顛換。

表4 SNP 類型統(tǒng)計(jì)

3 討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的是在特定發(fā)育階段或生理?xiàng)l件下細(xì)胞RNA 水平上基因的表達(dá)和變化情況，進(jìn)而查找探究基因的功能， 它在新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)方面有廣泛應(yīng)用（Chen 等，2011），還用于小菜蛾、帝王蝶等昆蟲(chóng)新測(cè)序基因組的基因注釋 （You 等，2013；Zhan 等，2011）。 Izadnia 等 （2019） 利用RNA-seq 技術(shù)鑒定羅斯708 和伊斯法罕雞兩種雞肝臟與剩余采食量（RFI）相關(guān)的關(guān)鍵基因和新的轉(zhuǎn)錄體。Liu 等（2020）在鷓鴣雞中37.6%的蛋白質(zhì)編碼基因中發(fā)現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄體。 Tang 等（2020）對(duì)來(lái)自Valgus-varus 畸形哈伯德肉雞和哈伯德肉雞的6 個(gè)雞脾臟樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了7943 個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本。 本研究共發(fā)現(xiàn)20176 個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，1047 個(gè)新基因， 新基因中共276 個(gè)基因在GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到歸類注釋。

目前， 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已成為分子生物學(xué)研究的常用工具， 廣泛應(yīng)用于檢測(cè)新的轉(zhuǎn)錄本（Huang等，2010）、差異基因篩選（Filichkin 等，2010）、可變剪接 （Lan 等，2014） 以及SNP 篩查（Martinez等，2017）等相關(guān)研究。 真核生物中存在著大量的可變剪接（Li 等，2016），動(dòng)物細(xì)胞中也存在著組織特異性（Montelli 等，2015）。Hu 等（2021）對(duì)北京鴨胸肌和腿肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)胸肌肌肉組織的可變剪接數(shù)量為32256 ～45707，腿部肌肉組織的可變剪接數(shù)量在不同時(shí)間點(diǎn)為35841 ～47889。Li 等（2015）發(fā)現(xiàn)，A3SS、A5SS、RI、SE 是20周齡青年雞和30 周齡產(chǎn)蛋雞肝臟中主要剪切的模式， 四類剪切事件占總數(shù)的96.5%，MEX 僅占3.5%。 Hu 等（2021）預(yù)測(cè)了漢中麻鴨不同生長(zhǎng)階段的骨骼肌可變剪接事件，在17、21、27 d 和6 個(gè)月大時(shí)的骨骼肌中可變剪接最多 （＞10000）。Daines 等（2010）利用RNA-Seq 數(shù)據(jù)與黑腹果蠅基因組比對(duì)，識(shí)別了至少4618 個(gè)基因（31%）發(fā)生了可變剪接， 確定了7776 個(gè)潛在的新剪切事件，最常見(jiàn)的帶注釋的事件是外顯子跳躍（SE）。 本研究中SE 的可變剪接類型的比例最高， 共篩選到1131 個(gè)顯著的差異剪接基因，并對(duì)差異可變剪接基因進(jìn)行GO 富集分析， 主要富集到代謝和免疫GO term。

SNP 是指在基因組上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富， 主要發(fā)生的有2 種， 即轉(zhuǎn)換和顛換。 黃育雯（2020） 在安格斯牛下丘腦和垂體研究中發(fā)現(xiàn)，堿基轉(zhuǎn)換的可能性超過(guò)了顛換。 Zhang 等（2019）檢測(cè)了大橫肉雞MSTN 基因的外顯子序列， 共檢測(cè)到5 個(gè)SNPs。 張蕾等（2019）利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)6 個(gè)高郵鴨卵巢組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)， 轉(zhuǎn)換類型總數(shù)極顯著高于顛換類型總數(shù)。 姚娜等（2012）發(fā)現(xiàn)， 西藏班戈絨山羊和遼寧絨山羊山羊兩品種間有5391 個(gè)SNP 位點(diǎn)。本研究在6 個(gè)樣品上分別得到了可能的SNP 位點(diǎn)，SNP 轉(zhuǎn)換類型總數(shù)大于顛換類型總數(shù)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)肉雞的回腸進(jìn)行了RNA-seq 測(cè)序分析，與參考基因組和參考基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)了1047個(gè)新基因，20176 個(gè)新轉(zhuǎn)錄本； 共篩選到1131 個(gè)顯著的差異剪接基因， 在SE、A5SS、A3SS、MXE、RI 事件中鑒定到的差異剪接基因數(shù)分別為588、139、176、136、92；SNP 中轉(zhuǎn)換類型總數(shù)大于顛換類型總數(shù)。 本研究為發(fā)掘復(fù)合益生菌作用于肉雞回腸中的可變剪接事件提供基礎(chǔ)， 為進(jìn)一步了解復(fù)合益生菌作用于肉雞回腸中新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)和SNP 位點(diǎn)提供了數(shù)據(jù)支撐。