譚 天，史天悅，吳長鋒，彭洪尚

（1.中央民族大學(xué) 理學(xué)院 光子系統(tǒng)工程軟件教育部工程研究中心,北京 100081；2.南方科技大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系,廣東 深圳 518055）

1 引言

高分辨率的光學(xué)成像技術(shù)一直是推動生物學(xué)發(fā)展的主要手段，在生物分子解構(gòu)[1]、光遺傳[2]和細(xì)胞形態(tài)學(xué)[3]等方面發(fā)揮著不可替代的作用。然而，生物組織的折射率分布不均勻，組織的散射會引起嚴(yán)重的光學(xué)像差，使得照明光無法高保真度地聚焦，從而限制了組織成像的深度和信噪比。隨著成像深度的增加，生物組織產(chǎn)生的光學(xué)像差階數(shù)也逐漸增加[4]，以至于照明光被多次散射而完全丟失其光場信息。這導(dǎo)致實(shí)現(xiàn)生物組織深處的非侵入性的高分辨顯微成像變得愈發(fā)困難。因此，它也成為光學(xué)研究領(lǐng)域公認(rèn)的難點(diǎn)之一[5]。

生物組織對光的影響主要表現(xiàn)為散射和吸收，兩者均與光的波長密切相關(guān)。研究表明在生物組織中存在具有較低散射系數(shù)和吸收系數(shù)的“近紅外窗口”,可以緩解生物組織對于入射光線的影響[6]。雖然，目前對于近紅外一區(qū)熒光材料的研究逐漸完善[7]，但仍難以滿足人們對成像深度的需求。近年來，由于近紅外二區(qū)熒光成像具有更深的組織穿透率，故其作為一種新興技術(shù)逐漸在成像中得到廣泛應(yīng)用[8]。在近紅外二區(qū)窗口（NIR-II，1 000～1 700 nm），Dai 課題組開發(fā)了小動物成像系統(tǒng)[9-10]和光片顯微系統(tǒng)[11]。由于抑制了激發(fā)和發(fā)射光在生物組織中的散射，生成的圖像明顯比傳統(tǒng)可見光和近紅外一區(qū)窗口的圖像更清晰。當(dāng)前，近紅外二區(qū)成像面臨的主要問題是性能優(yōu)異、生物相容性好的熒光探針比較匱乏[12-13]。因此，開發(fā)高效的NIR-II 熒光探針是活體熒光成像的熱點(diǎn)之一。

自適應(yīng)光學(xué)（Adaptive Optics，AO）正在被引入至成像系統(tǒng)中，以校正成像過程中產(chǎn)生的各類光學(xué)像差[14]。AO 方法是一種光電儀器和計算方法相結(jié)合的方法，由3 個主要組件組成：測量像差的傳感器，補(bǔ)償像差的校正器[15-17]以及根據(jù)傳感器測量值計算校正器所需信號的控制器。光學(xué)像差可以使用專用波前傳感器進(jìn)行直接測量，也可以從圖像中間接確定。人們將這兩種方法分別稱為“直接波前測量AO”[18-19]和“間接波前測量AO”[20-21]。在生物成像領(lǐng)域，相比于直接波前測量AO，間接波前測量AO 不需要依賴波前傳感器和在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)置“引導(dǎo)星”標(biāo)記，可以顯著降低實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜度和對于目標(biāo)的侵入性。因?yàn)闆]有專用的波前傳感器，在確定存在的像差大小和所需的校正方面，間接方法明顯慢于基于傳感器的方法。但是，由于顯微鏡和生物組織產(chǎn)生的像差能夠相對靜態(tài)地持續(xù)數(shù)小時之久[22]，故間接方法在生物顯微成像領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用。與非線性熒光相結(jié)合，Cui 小組[23,24]和Judkewitz 小組[25]分別提出了新的間接波前測量辦法。IMPAC[23]和F-SHARP[25]，各自實(shí)現(xiàn)了小鼠大腦中達(dá)400 μm深度的雙光子成像。上述工作引發(fā)了廣泛關(guān)注，但這兩個工作并不能推廣到頭骨比較厚的應(yīng)用場景[26]。如何進(jìn)一步抑制生物組織的散射，提高高分辨率系統(tǒng)在生物組織內(nèi)的成像深度仍有待于人們探索。

本文制備了生物相容性好、熒光亮度高的近紅外二區(qū)熒光探針，在808 nm 激光激發(fā)下，發(fā)射波長覆蓋990～1 300 nm，可以有效地抑制生物組織的散射對激發(fā)光和熒光信號的影響。進(jìn)一步將基于間接波前測量的自適應(yīng)光學(xué)方法與激光掃描共聚焦系統(tǒng)相融合，以校正生物組織產(chǎn)生的光學(xué)像差，提高穿透組織成像的分辨率和對比度。比較了兩種常見的用于間接波前測量的控制算法，“遺傳算法（Genetic Algorithm，GA）”[27]和“動態(tài)自適應(yīng)散射補(bǔ)償全息術(shù)（Dynamic Adaptive Scattering compensation Holography，DASH）”[28]。實(shí)驗(yàn)表明，雖然DASH 算法被用于雙光子成像的像差校正時，具有比GA 算法更快的收斂速度和更高的信號提升能力，但在線性熒光成像中GA 算法的校正效果卻優(yōu)于DASH 算法。本文開展了一系列的仿體和活體實(shí)驗(yàn)，使用間接波前測量校正不同像差后，熒光信號強(qiáng)度提升為校正前的1.47、1.95 和2.85 倍，提升了系統(tǒng)的分辨率與對比度。本研究將近紅外二區(qū)熒光探針與自適應(yīng)光學(xué)像差補(bǔ)償技術(shù)相結(jié)合，為深層生物組織內(nèi)高分辨成像提供了新路徑。

2 材料與方法

2.1 近紅外二區(qū)熒光材料

在可見光和傳統(tǒng)的近紅外一區(qū)窗口（700～900 nm），生物組織具有很強(qiáng)的散射，在近紅外二區(qū)窗口（1 000～1 700 nm），光學(xué)散射顯著降低?？紤]到半導(dǎo)體聚合物具有良好的生物相容性和較高的量子效率（3%）[29]，本文選擇其作為熒光探針材料，如圖1 所示。熒光探針在700～900 nm 處有很強(qiáng)的吸收，在990 nm 處和1 118 nm 處具有兩個發(fā)射峰。因此，在808 nm 激光的激發(fā)下，可以實(shí)現(xiàn)近紅外二區(qū)發(fā)射，從而顯著降低生物組織對于激發(fā)光和熒光信號的散射。

圖1 半導(dǎo)體聚合物熒光探針的吸收與發(fā)射光譜Fig.1 Absorption and emission spectra of the semiconductor polymer fluorescent probes

2.2 熒光微珠的制備

將直徑為100 nm 的聚苯乙烯（PS）微球稀釋到0.5 wt%的水溶液中，利用超聲儀使其充分分散后用0.22 μm 的濾頭過濾。調(diào)配水和四氫呋喃（THF）體積比滿足5∶1，向PS 微球中快速注入1 mg/L 的半導(dǎo)體聚合物THF 溶液并渦旋10 s，之后攪拌6 h，以保證熒光探針的裝載。將熒光微珠在15 000 g 下離心30 min 后倒掉上清液并加水超聲，重復(fù)清洗1 次后制得的熒光微珠樣本用于成像實(shí)驗(yàn)。

2.3 電紡絲樣本制備

電紡絲由于具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)以及易于負(fù)載熒光材料的特性，可以模擬生物復(fù)雜的血管組織成像。使用1 mg/L 的半導(dǎo)體聚合物THF 溶液將電紡絲浸透后在黑暗通風(fēng)環(huán)境中晾干，之后用速干膠和玻片進(jìn)行封裝以制得由半導(dǎo)體聚合物標(biāo)記的電紡絲樣本。電紡絲樣本中典型電紡絲的直徑在8 μm 左右。

2.4 散射模型的制備

將0.2 g 的瓊脂糖與1.7 mL 純水混合后在90 °C 下恒溫攪拌，充分溶解后加入0.1 mL 全脂純牛奶并繼續(xù)加熱，待混合均勻后取出靜置凝固以制得具有一定散射系數(shù)的瓊脂散射模型。

2.5 活體小鼠樣本制備

對3 個月大的C57 小鼠使用異氟烷氣體進(jìn)行麻醉后用電動理發(fā)剪和脫毛膏取出頭部的毛發(fā)。通過尾靜脈注射100 μL、濃度為200 μg/L 的半導(dǎo)體聚合物溶液并通過腹腔注射10%的水合氯醛溶液以保證長時間麻醉。充分麻醉后使用手術(shù)剪剪去頭皮，并用3%的過氧化氫溶液清理骨外膜防止其對實(shí)驗(yàn)造成影響，最后使用生理鹽水清洗創(chuàng)口。

2.6 系統(tǒng)光路設(shè)計

設(shè)計的共聚焦成像系統(tǒng)如圖2（彩圖見期刊電子版）所示，808 nm 近紅外連續(xù)激光器（DL808-400，CrystaLaser，USA）發(fā)射的波長為808 nm 的近紅外光作為激發(fā)光。發(fā)出的激光首先經(jīng)過一個偏振片和4f 擴(kuò)束系統(tǒng)變?yōu)槠窆馇夜獍甙霃綌U(kuò)大為初始的8.3 倍，以更方便液晶空間光調(diào)制器（Spatial Light Modulator，SLM）對入射光束進(jìn)行調(diào)制。隨后擴(kuò)束的激光光束經(jīng)過一反射鏡反射后以特定的角度入射到SLM（PLUTO-2.1-NIR-135，holoeye，Germany）上。入射光經(jīng)過SLM 調(diào)制后通過一個4f 收束系統(tǒng)使得光斑半徑縮為擴(kuò)束后的0.42 倍。之后入射光先后經(jīng)過二向色鏡（Dichroic mirror，DM）、掃描振鏡（Galvo scanner，GS）（6210 H，Cambridge Technology，USA）、掃描透鏡（Scan lens）（SL50-3P，Thorlab，USA）、管鏡（Tube lens）（TTL200 MP，Thorlab，USA）、反射鏡和顯微物鏡（XLPlan N 25X，Olympus，Japan）聚焦于樣本上。通過掃描振鏡、掃描透鏡和管鏡組成的中繼光路可以實(shí)現(xiàn)聚焦光斑在樣本平面內(nèi)的掃描，最大掃描視場為1 320 μm×1 320 μm。樣本激發(fā)出的熒光信號通過物鏡、反射鏡、管鏡、掃描透鏡、掃描振鏡和二向色鏡后由一焦距為125 mm 的凸透鏡聚焦于光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）上，PMT 前放置一直徑為75 μm 的小孔以濾除目標(biāo)激發(fā)區(qū)域以外的雜散光。在光學(xué)上，SLM 與樣本表面的散射介質(zhì)共軛，通過在SLM上疊加一定的相位全息圖，以對散射介質(zhì)產(chǎn)生的像差進(jìn)行補(bǔ)償，從而緩解因散射介質(zhì)導(dǎo)致的入射光不聚焦的問題。

圖2 基于間接波前測量的近紅外激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)Fig.2 Near-infrared laser scanning confocal microscope based on indirect wavefront sensing

本文實(shí)驗(yàn)均采用808 nm 連續(xù)激光對樣本進(jìn)行激發(fā)，使用長通濾光片和 PMT 收集波長大于980 nm 的近紅外熒光信號后重建圖像。

相比于目前常用的雙光子、多光子成像采用的500～700 nm 左右的信號光，本系統(tǒng)采用近紅外一區(qū)激發(fā)、近紅外二區(qū)發(fā)射的單光子成像方式具有更好的穿透組織的能力，可以有效提升未校正時的信號強(qiáng)度，為波前整形提供良好的前置條件。

2.7 基于間接波前測量的光學(xué)像差補(bǔ)償方法

在穿透散射介質(zhì)的共聚焦成像中，由于散射介質(zhì)對于入射光的散射作用，會使聚焦光斑的質(zhì)量下降，并且隨著深度的增加，這種影響會愈加顯著，從而降低圖像的對比度并影響成像的分辨率。對此，研究人員提出了直接測量像差波前并在反演后使用SLM 對其進(jìn)行校正的直接波前傳感的方法[18-19]。但是該方法不僅需要引導(dǎo)星等來標(biāo)記從所需成像點(diǎn)發(fā)出的光，還會顯著增加系統(tǒng)復(fù)雜度。

基于間接波前傳感的方法不需要波前傳感器和引導(dǎo)星，其原理如圖3 所示。在經(jīng)過一輪完整的成像流程后，探測器將捕獲到的熒光信號傳遞至計算機(jī)，經(jīng)過特定的算法處理后對SLM 的相位校正作出控制并進(jìn)行第二輪成像，再一次接受從傳感器捕獲的熒光信號。經(jīng)過一系列的成像并對成像效果使用評價函數(shù)（Cost Function，CF）進(jìn)行測量，計算機(jī)最終會找到可靠的校正模式。

圖3 控制SLM 的反饋系統(tǒng)Fig.3 Feedback system for controlling SLM

當(dāng)聚焦光斑質(zhì)量提升時，成像熒光強(qiáng)度會顯著提升，同時因?yàn)楦〉墓獍邥?dǎo)致成像的展寬縮減，這會使得成像的整體銳度提升。所以本文選取了銳度函數(shù)作為對整體成像質(zhì)量的評判標(biāo)準(zhǔn)，具體如下：

其中：n為成像圖中采樣點(diǎn)的個數(shù)，f為由采樣點(diǎn)坐標(biāo)及其熒光強(qiáng)度建立的曲面函數(shù)。

遺傳算法（Genetic Algorithm，GA）是一種用于間接波前測量的經(jīng)典方法[27]。在迭代過程中使用評價函數(shù)對不同的相位矩陣調(diào)制下的成像圖進(jìn)行分析，選取評價函數(shù)較高的相位矩陣作為親代，對其加權(quán)平均后生成子代，最終得到可以很好校正像差波前的校正模式。該算法已用于波前整形并可以取得較好的優(yōu)化效果，但是目前還沒有將其用于近紅外二區(qū)單光子熒光共聚焦顯微鏡中的報道。

近年來，另一種高效的間接波前傳感的自適應(yīng)光學(xué)算法被報道。它在雙光子成像系統(tǒng)中具有極快的收斂速度并且可以實(shí)現(xiàn)較高的信號增強(qiáng)，被稱為動態(tài)自適應(yīng)散射補(bǔ)償全息術(shù)（Dynamic Adaptive Scattering compensation Holography，DASH）。該方法利用SLM 將入射光束分為兩束，一束為調(diào)制波前，一束為參考場。兩束入射光同時入射進(jìn)行干涉測量，使得迭代速度顯著增加[28]。本文嘗試將上述兩種波前整形方法應(yīng)用于近紅外二區(qū)單光子熒光共聚焦顯微鏡中，以檢驗(yàn)他們在該系統(tǒng)中對于像差的校正效果，選取效果更好的方法進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

由于本系統(tǒng)掃描振鏡的掃描頻率對單次成像有限制，單輪迭代的時間一般為45～60 s，若需要對動態(tài)散射介質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)償，可使用掃描頻率更快的掃描振鏡，將單輪迭代時間縮短至5 s 以內(nèi)。

3 結(jié)果與討論

3.1 系統(tǒng)像差測試與校正

在系統(tǒng)搭建過程中由于各光學(xué)元件和參數(shù)的不精確會產(chǎn)生系統(tǒng)像差，在全視場上成像時可以使用GA 算法進(jìn)行校正，補(bǔ)償結(jié)果可作為成像系統(tǒng)的系統(tǒng)像差。

對熒光微珠樣本直接進(jìn)行掃描共聚焦成像并使用GA 算法進(jìn)行校正，結(jié)果如圖4（彩圖見期刊電子版）所示。

圖4 系統(tǒng)像差的測試與校正。（a）未進(jìn)行校正時的樣本成像；（b）經(jīng)過系統(tǒng)像差校正后的樣本成像圖；（c）評價函數(shù)隨迭代輪次的變化曲線；（d）GA 算法計算得到的校正相位圖；比例尺：（a）（b）全視場圖中比例尺為200 μm，感興趣區(qū)域局部放大圖中比例尺為20 μmFig.4 Testing and correction of the system aberrations.(a) Imaging of samples without correction;(b) imaging of samples after systematic aberration correction;(c) curve of the evaluation function as a function of iterative order;(d) the corrected phase diagram calculated by GA；scale: 200 μm in the full field of view and 20 μm in the local magnification of the region of interest in (a) (b)

由圖4 可知，通過對系統(tǒng)像差校正前后的成像進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，在校正系統(tǒng)像差后，此前未被激發(fā)或信號強(qiáng)度較低的熒光微珠信號得到了較大的提升。通過對評價函數(shù)隨迭代次數(shù)的變化進(jìn)行分析（圖4（c）），GA 算法可以在2-3 代內(nèi)快速收斂至理想值，體現(xiàn)了GA 算法可以快速校正像差的特點(diǎn)。圖4（d）為最終迭代后施加在SLM 上的相位圖，可以認(rèn)為該相位圖能夠?qū)ο到y(tǒng)像差進(jìn)行校正。

3.2 體外電紡絲樣本的像差校正

為了對比GA 算法和DASH 算法在近紅外二區(qū)熒光共聚焦成像中的像差補(bǔ)償效果，在相同的像差條件下分別使用GA 算法和DASH 算法進(jìn)行相位圖校正。使用近紅外二區(qū)熒光共聚焦系統(tǒng)對電紡絲樣本進(jìn)行成像，選取成像較為清晰的區(qū)域作為目標(biāo)平面。在對目標(biāo)平面對焦之后，將載物臺向下平移30 μm。通過這種方式引入了一個30 μm 的空氣平板，可以在成像光路中引入了一個固定的像差。通過對比GA 算法和DASH算法的校正效果驗(yàn)證這兩種算法在近紅外二區(qū)單光子熒光共聚焦顯微鏡成像中的適用性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5（彩圖見期刊電子版）所示。

圖5 電紡絲像差校正結(jié)果。（a）引入一個30 μm 的空氣平板并僅進(jìn)行系統(tǒng)像差校正的成像圖；（b）在圖（a）成像情況下，使用DASH 算法進(jìn)行像差校正；（c）在圖（a）成像情況下，使用GA 算法進(jìn)行像差校正；（d）為（a）（b）（c）中感興趣區(qū)域的局部放大圖白線標(biāo)記處的熒光強(qiáng)度分布；（e）DASH 算法得到的校正相位圖；（f）GA 算法得到的校正相位圖；比例尺：（a）（b）（c）全視場圖中比例尺為200 μm，感興趣區(qū)域局部放大圖中比例尺為20 μmFig.5 Aberration correction results of electrospinning.(a) Image with a 30 μm air plate and performing only system aberration correction;(b) in the case of imaging in figure (a),aberration correction caculated by using DASH;(c) in the case of imaging in figure (a),aberration correction caculated by using GA;(d) fluorescence intensity distribution at the white line marker in partial enlarged pictures of the region of interest in figures (a) (b) (c);(e) the corrected phase map calculated by DASH;(f) the corrected phase diagram calculated by GA；Scale: 200 μm in the full field of view and 20 μm in the local magnification of the region of interest in (a) (b) (c)

在引入一個固定像差的基礎(chǔ)上，在SLM 上施加圖4（d）所示的相位圖，即只進(jìn)行系統(tǒng)像差的校正，成像結(jié)果如圖5（a）所示?？梢钥闯鲭娂徑z展寬較為嚴(yán)重且熒光強(qiáng)度較低。分別經(jīng)過DASH算法和GA 算法校正后，圖像的對比度和熒光強(qiáng)度得以提升，如圖5（b）和5（c）所示。對紅框中單根電紡絲進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析量化，結(jié)果如圖5（d）所示?？梢钥闯?，由于兩種算法校正效果的差異，使得校正后的對焦平面略有不同。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩算法均可以實(shí)現(xiàn)對于外加像差的校正，DASH 算法顯著降低了電紡絲不正常的展寬，將其寬度由23.8 μm 降低至10.5 μm，但是信號強(qiáng)度卻沒有明顯提升。這可能與DASH算法得到的相位圖有關(guān)（圖5（e）），相比于GA 算法得到的相位圖（圖5（f）），DASH 算法產(chǎn)生了過多的雜散相位，導(dǎo)致部分入射光發(fā)散而無法參與激發(fā)。GA 算法在維持背景信號幾乎不變的情況下將熒光信號的峰值強(qiáng)度提升為初始的1.47 倍，并且將電紡絲的寬度由23.8 μm 降低至11.6 μm，顯著提高了熒光信號的強(qiáng)度和成像對比度與分辨率。

DASH 算法相比于GA 算法，對電紡絲展寬具有更好的校正效果。DASH 算法可以產(chǎn)生點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）更小的聚焦光斑，符合其適用于雙光子成像的特征。但GA 算法對于入射光全光束的調(diào)制使得其可以更加有效地利用入射光強(qiáng)，顯著提升激發(fā)熒光的信號強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)表明在近紅外二區(qū)單光子共聚焦成像中，GA 算法較DASH算法更適用。因此，本文使用GA 算法結(jié)合近紅外二區(qū)共聚焦系統(tǒng)來驗(yàn)證其對于各類散射介質(zhì)產(chǎn)生像差的校正效果。

3.3 仿體實(shí)驗(yàn)的像差校正

為驗(yàn)證GA 算法對散射介質(zhì)產(chǎn)生像差的校正效果，通過在電紡絲樣本上添加一定的散射介質(zhì)作為仿體進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過對比實(shí)驗(yàn)，本系統(tǒng)對厚度最大約500 μm 的瓊脂散射模型具有較好的校正效果。在電紡絲樣本與顯微物鏡之間添加厚度為480 μm 的瓊脂散射模型模擬在成像過程中生物組織對入射激發(fā)光的散射，先后進(jìn)行添加散射介質(zhì)成像、校正系統(tǒng)像差成像和校正全像差成像。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示，添加散射介質(zhì)后，由于其對入射光線的散射，激發(fā)光斑質(zhì)量極差，不止熒光強(qiáng)度大幅度下降，也產(chǎn)生了大量的背景噪聲，嚴(yán)重影響了成像質(zhì)量（圖6（b））。通過在SLM 上施加圖4（d）所示的相位圖以校正系統(tǒng)像差，成像質(zhì)量有一定的提升，但入射光散射導(dǎo)致的背景噪聲依舊十分嚴(yán)重（圖6（c））。最后使用GA 算法對整體成像的全像差進(jìn)行校正，結(jié)果如圖6 所示（d），對比只進(jìn)行系統(tǒng)像差校正下的成像，在提升了整體熒光強(qiáng)度的情況下顯著降低了背景噪聲。對圖6（a）～6（d）紅框區(qū)域白線標(biāo)記處的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行分析量化，結(jié)果如圖6（e）所示?？梢钥闯觯谔砑咏橘|(zhì)且未進(jìn)行任何處理時，電紡絲樣本的成像質(zhì)量極差，熒光信號被淹沒在背景噪聲之中。在進(jìn)行系統(tǒng)像差校正后，出現(xiàn)了一些熒光信號，但大量的背景噪聲導(dǎo)致成像中不能看到明顯的熒光強(qiáng)度峰值，成像的對比度很低，而在使用GA 算法對全像差進(jìn)行校正后，出現(xiàn)了明顯的熒光強(qiáng)度峰值且在峰值處的熒光強(qiáng)度提升為僅進(jìn)行系統(tǒng)像差校正的1.95 倍，顯著提升了成像對比度?？梢钥闯鼋?jīng)過像差校正后的電紡絲成像與初始的參考圖像相比具有近似的半高寬。說明本方法有效減少了散射介質(zhì)的影響，由于SLM 對于入射光的調(diào)制使得入射光角度略微偏移，熒光峰值偏移約2.5 μm，該尺寸相比于全視場而言可以忽略。驗(yàn)證了該算法對散射介質(zhì)產(chǎn)生的像差具有良好的校正效果。

圖6 散射介質(zhì)像差校正結(jié)果。（a）直接成像圖；（b）添加散射介質(zhì)后的成像圖；（c）添加介質(zhì)后進(jìn)行系統(tǒng)像差校正后的成像圖；（d）添加介質(zhì)后進(jìn)行全像差校正后的成像圖；（e）圖（a）-（d）局部放大圖中白線標(biāo)記處的熒光強(qiáng)度分布；（f）GA 算法計算得到的校正相位圖；比例尺：（a）（b）（c）（d）全視場圖中比例尺為200 μm，感興趣區(qū)域局部放大圖中比例尺為20 μmFig.6 Aberration correction results of scattering medium.(a) Direct imaging;(b) image after adding scattering medium;(c) image after system aberration correction;(d) image after total aberration correction;(e) distribution of fluorescence intensity at white line markers in partial enlarged pictures of (a)-(d);(f) the corrected phase map calculated by GA;Scale: 200 μm in the full field of view and 20 μm in the local magnification of the region of interest in (a) (b) (c) (d)

3.4 活體小鼠腦部成像實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)本系統(tǒng)在活體成像中對于生物散射組織的校正效果，對保留了完整顱骨的小鼠顱內(nèi)血管進(jìn)行成像。在僅校正系統(tǒng)像差和校正全像差兩種情況下對活體小鼠顱骨以下具有較明顯信號的血管進(jìn)行成像，經(jīng)過測量，該血管位于顱骨以下320 nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7（彩圖見期刊電子版）所示。由于顱骨對于入射光的散射致使激發(fā)光斑質(zhì)量不佳，整體成像的熒光信號強(qiáng)度不佳（圖7（a））。使用GA 算法進(jìn)行校正后，被顱骨散射而無法參與熒光激發(fā)的光線被重新聚焦，使得激發(fā)起的熒光強(qiáng)度大幅度提升（圖7（b）），對圖7（a）和7（b）白線標(biāo)記處的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7（c）所示。結(jié)果顯示全像差校正后的熒光強(qiáng)度較只進(jìn)行系統(tǒng)像差校正時提升了2.85 倍。證明該方法用于活體生物成像時對活體組織產(chǎn)生的像差具有校正能力。圖7（d）為評價函數(shù)隨迭代輪次的變化曲線?？梢姡啾扔隗w外成像實(shí)驗(yàn)（圖4（c）），其上升速度較慢，需要約9-10 代才收斂至理想波前。這說明該算法對于復(fù)雜像差的校正需要迭代更多的輪次。

圖7 活體小鼠顱內(nèi)成像。（a）僅進(jìn)行系統(tǒng)像差校正的小鼠顱內(nèi)血管成像圖；（b）進(jìn)行全像差校正后的小鼠顱內(nèi)血管成像圖；（c）圖（a）（b）中白線標(biāo)記處的熒光強(qiáng)度分布；（d）評價函數(shù)隨迭代倫次的變化曲線；比例尺：（a）（b）中比例尺為200 μmFig.7 Intracranial imaging results of living mice.(a) Image of intracranial blood vessels in mice with only systematic aberration correction;(b) image of intracranial blood vessels in mice with full aberration correction;(c) the fluorescence intensity distribution at the white line markers in (a) and (b);(d)curve of the evaluation function as a function of iterative order;scale: 200 μm in (a)(b)

4 結(jié)論

為了改善成像過程中由于系統(tǒng)和散射介質(zhì)等產(chǎn)生的光學(xué)像差對最終成像質(zhì)量的影響，本文介紹了兩種基于間接波前測量的光學(xué)像差補(bǔ)償方法，并將其與近紅外二區(qū)共聚焦成像系統(tǒng)相結(jié)合，利用液晶SLM 對入射激發(fā)光波前進(jìn)行整形從而實(shí)現(xiàn)對于系統(tǒng)、介質(zhì)等產(chǎn)生的光學(xué)像差的補(bǔ)償。該方法可以在數(shù)次迭代內(nèi)顯著提升穿透介質(zhì)后成像的信號強(qiáng)度及成像對比度與分辨率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GA 算法相比于DASH 算法在近紅外二區(qū)共聚焦線性熒光成像中具有更好的校正效果，在穿透空氣平板、瓊脂散射介質(zhì)和小鼠顱骨的成像中，信號強(qiáng)度分別提升為僅進(jìn)行系統(tǒng)像差校正的1.47倍、1.95 倍和2.85 倍。本研究為進(jìn)一步開展活體小鼠顱內(nèi)非侵入式熒光成像提供了有意義的參考。