王三煒,謝言青,金 葉,周志宏,劉 錄

(云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南云中營(yíng)養(yǎng)與健康研究院,云南 昆明 650500)

《中國(guó)藥典》中記載,沉香為瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有樹(shù)脂的木材,具有溫中止嘔,納氣平喘,行氣止痛的功效,多用于胃寒嘔吐呃逆,胸腹脹悶疼痛,腎虛氣逆喘急[1].沉香葉可一年采收兩季,已有研究表明沉香葉也具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、促進(jìn)腸推進(jìn)等生物活性[2],被廣泛用于中醫(yī)治療中.市面上也有許多與沉香葉相關(guān)的保健茶：沉香葉腎茶,沉香葉保健品等.

據(jù)文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道沉香葉提取物具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛活性,但研究不夠深入,所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)痛刺激(熱板法、醋酸扭體)模型和小鼠耳廓腫脹抗炎模型綜合評(píng)價(jià)沉香葉醇提物的抗炎鎮(zhèn)痛效果,并且初步探討沉香葉鎮(zhèn)痛抗炎的作用機(jī)制,為沉香葉的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),為沉香葉的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ).

1 材料

沉香葉由云南中醫(yī)藥大學(xué)楊竹雅教授鑒定為瑞香科沉香屬的白木香 (Aquilariasinensis(Lour.)Gilg)的葉;另取沉香葉粉末 550 g,用12倍量(6 600 mL)的75%乙醇回流提取3次,每次 2 h,合并提取液、減壓蒸餾、真空干燥得到沉香葉醇提物粉末,加生理鹽水配制成低(0.2 g 生藥/mL)、中 (0.4 g 生藥/mL)、高劑量 (0.8 g 生藥/mL).

購(gòu)買斯貝福(北京)生物科技有限公司提供的SPF昆明級(jí)小鼠180只,體重18～22 g,雌雄各半,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010;飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心,使用普通小鼠飼料喂養(yǎng),自由飲水,溫度20～25 ℃,濕度40%～70%.

熱板儀(成都泰盟科技有限公司);電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);超純水(成都優(yōu)譜,UPTL-1-20T);氯化鈉注射液(雙鶴藥業(yè)批號(hào)：210630);雙氯芬酸鈉(Macklin生產(chǎn),批號(hào)：D829756,純度≥99.0%);冰醋酸(風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)：20110103);二甲苯(天津化學(xué)公司,批號(hào)：20080613).小鼠體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)所用到的試劑盒：小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)/48T、小鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)/48T、小鼠白細(xì)胞介素4(IL-4)/48T、小鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)/48T、小鼠前列腺素E2(PGE2)/48T、小鼠β-內(nèi)啡肽(β-EP)/48T、小鼠緩激肽(BK)/48T均為江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 觀察沉香葉醇提物對(duì)小鼠耳腫脹的影響

取體重18～22 g 的健康小鼠50只,雌雄各25只,隨機(jī)分組為5組(模型對(duì)照組M、陽(yáng)性對(duì)照組Y和沉香葉醇提物低 D、中Z、高劑量組G)每組10只.按模型對(duì)照組M(生理鹽水)、沉香葉醇提物低D、中Z、高劑量組G、陽(yáng)性組(雙氯芬酸鈉/Y)灌胃給藥(體積為 10 mL/kg).末次給藥 1 h 后,給每只小鼠右耳的正反兩面涂抹二甲苯約 20 μL 致炎,左耳作為空白對(duì)照,致炎15～20 min 后拖頸處死,用直徑 8 mm 打孔器剪下左右兩圓耳,分別稱重.

左右耳重量之差即為腫脹度.將每組取下的右耳放入EP管中,用ELISA法檢測(cè)制備的組織勻漿上清液中的 TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4 含量.

2.2 觀察沉香葉醇提物對(duì)小鼠醋酸扭體的影響

按上述方法與劑量分組、適應(yīng)給藥、飼養(yǎng),于末次給藥后 1 h,腹腔注射0.6%冰醋酸生理鹽水(10 mL/kg).注射醋酸后觀察記錄 20 min 內(nèi)小鼠扭體次數(shù),并計(jì)算抑制率[(空白組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/空白組扭體次數(shù)×100%].

扭體反應(yīng)觀察結(jié)束后迅速摘取小鼠眼球取血,分離血清,用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中PGE2、β-EP、BK的含量.

2.3 觀察沉香葉醇提物對(duì)小鼠熱板的影響

在(50～55)℃的熱板預(yù)選出痛閾值在10～25 s 的雌性小鼠50只,間隔 10 min 重新測(cè)定1次,取2次平均痛閾值作為給藥前小鼠的痛閾值.按上述方法與劑量分組、適應(yīng)給藥、飼養(yǎng),于末次給藥后測(cè)定0.5、1、1.5、2和 2.5 h 的痛閾,記錄并比較各組結(jié)果.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 沉香葉醇提物對(duì)小鼠耳廓腫脹的影響

見(jiàn)表2及圖1,各組涂抹二甲苯之后均會(huì)出現(xiàn)紅腫,其中沉香葉醇提物低劑量組(D)、中劑量組(Z)、高劑量組(G)與模型組(M)相比小鼠耳腫脹程度可見(jiàn)明顯減輕,其腫脹度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

表2 沉香葉醇提物對(duì)小鼠二甲苯耳廓腫脹的影響

圖1 小鼠耳廓腫脹度

表3及圖2、3、4、5示,沉香葉醇提物中劑量組(Z)、高劑量組(G)與模型組(M)相比較均能降低小鼠耳組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量,能提高IL-10、IL-4的含量,其中除沉香葉低劑量組(D)與模型組(M)相比,小鼠耳組織中TNF-α的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其余所有含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

表3 沉香葉醇提物對(duì)小鼠耳組織中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4的含量

圖2 小鼠耳組織中TNF-α含量

圖3 小鼠耳組織中IL-1β含量

圖4 小鼠耳組織中IL-4含量

圖5 小鼠耳組織中IL-10含量

3.2 沉香葉醇提物對(duì)小鼠醋酸扭體的影響

0.6%冰醋酸生理鹽水經(jīng)腹腔注射后,沉香葉醇提物低劑量組(D)、中劑量組(Z)、高劑量組(G)與模型組(M)相比出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時(shí)間有一定的延長(zhǎng),且扭體次數(shù)也隨著劑量增加而減少,高劑量組的扭體抑制率可達(dá)到61.32%.見(jiàn)表3及圖6.

表3 沉香葉醇提物對(duì)小鼠醋酸致痛扭體的影響

圖6 小鼠醋酸扭體致痛反應(yīng)

表4及圖7、8、9示,沉香葉醇提物低劑量組(D)、中劑量組(Z)、高劑量組(G)與模型組(M)相比能降低小鼠血清中PGE2和BK含量和提高β-EP含量,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

表4 沉香葉醇提物對(duì)小鼠扭體血清中PGE2、β-EP、BK的含量

圖7 小鼠血清中PGE2的含量

圖8 小鼠血清中β-EP的含量

圖9 小鼠血清中BK的含量

3.3 沉香葉醇提物對(duì)小鼠熱板的影響

表5及圖10、11、12、13、14示,沉香葉醇提物低劑量組(D)與模型組(M)比較在 2 h 以前無(wú)顯著性差異.沉香葉醇提物中劑量組(Z)、高劑量組(G)都在給藥 1 h 后痛閾值提高,與模型組(M)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).

表5 沉香葉醇提物對(duì)小鼠熱板痛閾的影響

圖10 小鼠熱板致痛30 min反應(yīng)

圖11 小鼠熱板致痛60min反應(yīng)

圖12 小鼠熱板致痛90 min反應(yīng)

圖13 小鼠熱板致痛120 min反應(yīng)

圖14 小鼠熱板致痛150 min反應(yīng)

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)利用經(jīng)典痛刺激(熱板法、醋酸扭體)模型和小鼠耳廓腫脹抗炎模型,通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)沉香葉的抗炎鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行研究.通過(guò)二甲苯致小鼠耳腫脹抗炎模型表明沉香葉醇提物中劑量、高劑量組具有抗炎作用,與模型對(duì)照組比,沉香葉醇提物低、中、高劑量對(duì)小鼠耳腫脹具有抑制作用,可不同程度的減少小鼠耳組織中的小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)和小鼠白細(xì)胞介素1β(IL-β)的含量(P<0.05),提高小鼠白細(xì)胞介素4(IL-4)和小鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)的含量(P<0.05),推測(cè)其作用機(jī)制是通過(guò)抑制耳組織中的致炎因子TNF-α、IL-1β的生成和通過(guò)提高抗炎因子IL-10、IL-4的含量來(lái)抑制炎癥的發(fā)生,說(shuō)明沉香葉是通過(guò)正負(fù)反饋雙向調(diào)節(jié)起到抗炎作用的[5-6].通過(guò)醋酸扭體模型和熱板模型實(shí)驗(yàn)表明,沉香葉醇提物具有一定的鎮(zhèn)痛作用,低、中、高劑量均能抑制小鼠扭體次數(shù),通過(guò)小鼠血清中研究發(fā)現(xiàn),沉香葉醇提物各劑量組能降低醋酸扭體小鼠的扭體次數(shù)和血清中小鼠前列腺素E2(PGE2)和小鼠緩激肽(BK)的含量(P<0.05),也均能提高小鼠血清中小鼠β-內(nèi)啡肽(β-EP)的含量,結(jié)果表明其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能與抑制血清中的致痛物質(zhì)PGE2、BK的含量和促進(jìn)鎮(zhèn)痛物質(zhì)β-EP的釋放有關(guān)[7].