陳景偉，仝瑞曉，孫曉換，范麗潔，杜惠蘭

(1.河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊 050091;2.河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050091)

原發(fā)性痛經(jīng)是婦科常見(jiàn)病、多發(fā)病，嚴(yán)重者可影響患者生活質(zhì)量，因此備受關(guān)注。由于人體研究的限制性，建立動(dòng)物痛經(jīng)模型對(duì)研究痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制和防治具有重要意義。目前原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型多采取雌激素聯(lián)合縮宮素誘發(fā)扭體反應(yīng)，常用雌激素為已烯雌酚和苯甲酸雌二醇，由于藥物利潤(rùn)低及副作用大等原因，這兩種藥物臨床已經(jīng)很少應(yīng)用;縮宮素多為腹腔注射，但應(yīng)用劑量報(bào)道不一，目前有每只2 U［1］、2 U/kg［2］、20 U/kg［3］，有必要摸索最佳劑量。據(jù)報(bào)道相同方法建立的痛經(jīng)模型，小鼠扭體次數(shù)約為大鼠的6 倍［4］，因此本研究采用目前臨床廣泛應(yīng)用的補(bǔ)佳樂(lè)聯(lián)合縮宮素誘發(fā)扭體反應(yīng)，不同條件下，組間比較，篩選最佳條件，建立近交系小鼠痛經(jīng)模型，為原發(fā)性痛經(jīng)的研究建立一種理想、實(shí)用的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)近交系BALB/c 雌性小鼠82 只，6 ～8 周齡，性周期4 ～5 d，體重(18 ±2)g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK(冀)2008-1003］，室溫20 ～23℃，相對(duì)濕度:45% ～60%，12 h 光照/黑暗交替飼養(yǎng)。自由獲取食物和水，實(shí)驗(yàn)于河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行［SYXK(冀)2011-0047］。

1.2 實(shí)驗(yàn)器械及藥品

補(bǔ)佳樂(lè)(戊酸雌二醇片)，規(guī)格:每片1 mg，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司產(chǎn)品，批號(hào):222A;縮宮素注射液，規(guī)格:10 U/mL，上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)120509;0.9% 生理鹽水，規(guī)格:每瓶500 mL，石家莊四藥有限公司，批號(hào)120731608;蒸餾水(自制)。

1.3 補(bǔ)佳樂(lè)混懸液配制

補(bǔ)佳樂(lè)低劑量組(0.5 mg/kg):1 mg 補(bǔ)佳樂(lè)片研碎，溶于40 mL 蒸餾水中，配成濃度為1∶40 的混懸液作為補(bǔ)佳樂(lè)低劑量備用;補(bǔ)佳樂(lè)高劑量組(1 mg/kg):1 mg 補(bǔ)佳樂(lè)片研碎溶于20 mL 蒸餾水中，配成濃度為1∶20 的混懸液作為補(bǔ)佳樂(lè)高劑量備用。

1.4 不同濃度縮宮素配制

用10 U/mL 的縮宮素，稀釋10 倍制成濃度為1 U/mL 的縮宮素備用;稀釋2 倍制成濃度為5 U/mL的縮宮素備用;及10 U/mL 縮宮素備用。

1.5 補(bǔ)佳樂(lè)劑量的篩選

20 只雌性近交系BALB/c 小鼠隨機(jī)分為2 組，分別灌胃不同劑量補(bǔ)佳樂(lè)，低劑量組(0.5 mg/kg)，每只小鼠灌胃容量為體重(kg)×20 mL(相當(dāng)于人臨床用藥量的10 倍);高劑量組(1 mg/kg)，每只小鼠灌胃容量為體重(kg)×10 mL(相當(dāng)于人臨床用藥量的20 倍)，連續(xù)12 d，于末次給藥后1 h，分別腹腔注射縮宮素2 U/只，觀察扭體反應(yīng)并記錄扭體反應(yīng)潛伏期及扭體次數(shù)。篩選補(bǔ)佳樂(lè)給藥最佳劑量。

1.6 補(bǔ)佳樂(lè)用藥周期的篩選

12 只雌性近交系BALB/c 小鼠，每天灌胃補(bǔ)佳樂(lè)0.5 mg/kg，連續(xù)15 d，并于每天給藥后1 h，腹腔注射縮宮素每只2 U，記錄30 min 內(nèi)扭體潛伏期及扭體次數(shù)。篩選最佳給藥周期。

1.7 縮宮素劑量的篩選

30 只雌性近交系BALB/c 小鼠隨機(jī)分為3 組，每組連續(xù)灌胃補(bǔ)佳樂(lè)0.5 mg/kg 共12 d 后，于末次給藥后1 h 腹腔注射不同濃度縮宮素。每只0.4 U組腹腔注射1 U/ mL 縮宮素0.4 mL，每只1 U 組腹腔注射5 U/mL 縮宮素0.2 mL，每只2 U 組腹腔注射10 U/mL 縮宮素0.2 mL，篩選縮宮素最佳劑量。

1.8 腹腔注射縮宮素時(shí)間的篩選

20 只雌性近交系BALB/c 小鼠隨機(jī)分為2 組，每組連續(xù)灌胃補(bǔ)佳樂(lè)0.5 mg/kg 共12 d 后，分別于末次給藥后0.5、1 h 腹腔注射縮宮素每只2 U 誘發(fā)扭體反應(yīng)，并記錄30min 內(nèi)的扭體潛伏期及扭體次數(shù)。篩選腹腔注射縮宮素的最佳時(shí)間。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，兩樣本比較用t檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析，以P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量補(bǔ)佳樂(lè)對(duì)扭體反應(yīng)的影響

補(bǔ)佳樂(lè)0.5、1 mg/kg 連續(xù)灌胃12 d，并于末次給藥后1 h 誘發(fā)扭體反應(yīng)，結(jié)果表明，0.5 mg/kg 組與1 mg/kg 組扭體潛伏期及扭體次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P ＞0.05)，見(jiàn)表1。因此確定較小有效劑量0.5 mg/kg 為適宜劑量。

表1 不同劑量補(bǔ)佳樂(lè)對(duì)扭體次數(shù)和扭體潛伏期的影響Tab.1 Effect of different doses of progynova on writhning frequency and latency in the mice

2.2 補(bǔ)佳樂(lè)用藥周期對(duì)扭體反應(yīng)的影響

補(bǔ)佳樂(lè)0.5 mg/kg，連續(xù)灌胃15 d ，每天觀察扭體反應(yīng)，結(jié)果表明，第3 天時(shí)扭體次數(shù)開(kāi)始增多;從第4 天開(kāi)始維持在高水平。第14 天扭體次數(shù)最多，明顯多于第1、2、3 天，但于其他時(shí)間點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)合小鼠動(dòng)情周期4 ～5 d，并且小鼠痛經(jīng)模型的建立時(shí)間以10 ～15 d 為宜［4］，因此選擇補(bǔ)佳樂(lè)連續(xù)給藥三個(gè)動(dòng)情周期即12 d 為給藥周期。見(jiàn)表2。

2.3 不同劑量縮宮素對(duì)扭體反應(yīng)的影響

連續(xù)灌胃補(bǔ)佳樂(lè)12 d 后，腹腔注射縮宮素每只0.4、1、2 U，誘發(fā)扭體反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，每只2 U發(fā)生的扭體次數(shù)明顯多于每只1、0.4 U，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P ＜0.01)。每只0.4、1 U 誘發(fā)的扭體次數(shù)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。每只2 U 扭體潛伏期明顯短于每只1、0.4 U，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P ＜0.01)，每只0.4、1 U 扭體潛伏期相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。見(jiàn)表3。因此以縮宮素每只2 U 誘發(fā)扭體反應(yīng)為最佳劑量。

表2 補(bǔ)佳樂(lè)用藥周期對(duì)扭體次數(shù)及扭體潛伏期的影響Tab.2 effect of progynova administration cycles on the writhing frequency and latency in the mice

表3 不同劑量縮宮素對(duì)扭體潛伏期和扭體次數(shù)的影響Tab.3 Effect of progynova at different doses on the writhing latency and frequency in the mice

2.4 不同時(shí)間腹腔注射縮宮素對(duì)扭體反應(yīng)的影響

分別于末次給藥后0.5、1 h 腹腔注射縮宮素每只2 U，均能誘發(fā)扭體反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明于末次給藥后1 h 后腹腔注射縮宮素誘發(fā)的扭體次數(shù)明顯多于0.5 h 組(P ＜0.05)，潛伏期明顯短于0.5 h 組(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。因此以末次給藥后1 h 腹腔注射縮宮素為最佳時(shí)間。

表4 不同時(shí)間腹腔注射縮宮素對(duì)扭體反應(yīng)的影響Tab.4 effect of progenova injected at different time points on the writhing in the mice

3 討論

目前痛經(jīng)在體動(dòng)物模型多采用SD 大鼠［5-8］、Wistar 大 鼠［9-11］、KM 小 鼠［12-14］及ICR 小 鼠［15-16］。利用近交系小鼠建立痛經(jīng)模型尚未見(jiàn)報(bào)道。近交系小鼠基因高度純化，且具有長(zhǎng)期遺傳的穩(wěn)定性和對(duì)實(shí)驗(yàn)的敏感性和一致性，因此對(duì)藥物反應(yīng)的結(jié)果比較一致，可以減少重復(fù)試驗(yàn)的次數(shù)，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，故本實(shí)驗(yàn)選用近交系小鼠。痛經(jīng)模型的建立需要致敏和致痛兩個(gè)步驟［17］，補(bǔ)佳樂(lè)是天然雌激素類藥物，每片含天然雌激素戊酸雌二醇1 mg，可刺激子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)［18］，并能提高子宮肌對(duì)縮宮素的敏感性［19］，目前臨床應(yīng)用極為廣泛，因此，本研究采用補(bǔ)佳樂(lè)作為致敏藥物;致痛藥物常選用縮宮素及前列腺素，而縮宮素應(yīng)用更為廣泛，并且縮宮素誘發(fā)的扭體次數(shù)明顯多于前列腺素PGF2a［4］?？s宮素可作用于子宮平滑肌引起子宮強(qiáng)烈而持續(xù)的收縮［5］，這種收縮與痛經(jīng)引起的子宮強(qiáng)烈收縮相似，因此常被用于痛經(jīng)模型的致痛藥物［15］。

本實(shí)驗(yàn)采用補(bǔ)佳樂(lè)聯(lián)合縮宮素建立近交系小鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型，并對(duì)所需的最佳條件進(jìn)行了摸索。結(jié)果表明補(bǔ)佳樂(lè)0.5 mg/kg 連續(xù)灌胃12 d，于末次給藥后1h 腹腔注射縮宮素每只2 U 為最佳方案，能快速誘發(fā)扭體反應(yīng)，扭體反應(yīng)80%集中在注射縮宮素后15 min 內(nèi)，成功建立原發(fā)性痛經(jīng)模型。實(shí)驗(yàn)周期短，成功率高，所需藥品容易購(gòu)得，為研究原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制及藥理作用的提供了理想模型。

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