(1山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,山東 臨沂 276000;2臨沂市人民醫(yī)院;3山東醫(yī)專附屬醫(yī)院)

β-溶血性鏈球菌(Beta-hemolytic streptococci,BHS)主要定植于呼吸道、皮膚、陰道等處,是最常見的社區(qū)感染性病原菌之一。紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素廣泛用于該菌感染的臨床治療,其耐藥問題也引起人們的廣泛關(guān)注。為了解BHS耐藥特性,本研究對其耐紅霉素、克林霉素特征進(jìn)行分析,并檢測對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因ermB、mefA,分析其耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性,為臨床醫(yī)生選擇合理抗菌藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源及鑒定 收集本院2020年6月-2021年12月從門診及住院患者痰液、咽拭子、膿性分泌物等標(biāo)本分離的BHS,共64株。將標(biāo)本接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基,置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中24 h,使用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及溶血性鏈球菌血清鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定。

1.2抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法測定其對紅霉素、克林霉素的耐藥性,挑取分純的新鮮菌落懸浮于生理鹽水中,震蕩混勻后使用麥?zhǔn)媳葷醿x,調(diào)整濁度為0.5麥?zhǔn)蠞舛?將菌液均勻涂布于整個哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基表面,待水分吸收后將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面,紙片中心距培養(yǎng)基邊緣不少于15 mm,貼上紙片后將平板倒置,放于37℃溫箱中培養(yǎng)。24 h后測量抑菌圈直徑,其結(jié)果判讀參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)M100-S29指南。質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619,購于美國菌種保藏中心。

1.3細(xì)菌處理 將細(xì)菌分純培養(yǎng)后,用無菌接種環(huán)刮取適量新鮮細(xì)菌,加入含有無菌去離子水的EP管中,制成懸液,振蕩混勻后100℃加熱10 min,高速離心10 min后使用移液槍小心吸取上清液(即為提取的DNA)。測定DNA濃度與純度后,置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增 采用軟件Primier.5設(shè)計部分耐藥基因引物,引物委托上海生工生物有限公司合成,利用PCR法對大環(huán)內(nèi)酯類藥物相關(guān)耐藥基因ermB、mefA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL,PCR擴(kuò)增體系為:2×Taq Master Mix 25μL;上下游引物各0.5μL,模板2μL,ddH2O 22μL;反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min,94℃、30s,退火45s,72℃延伸90s,30個循環(huán),72℃延伸7 min。將產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。耐藥基因引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 耐藥基因PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1藥物敏感性實(shí)驗(yàn)及耐藥表型 BHS對紅霉素耐藥率為85.9%,對克林霉素耐藥率為87.5%。其中82.8%對紅霉素、克林霉素均表現(xiàn)為耐藥。其中C群鏈球菌(GCS)對紅霉素耐藥率最高,其次是A群鏈球菌(GAS)。B群鏈球菌(GBS)、GCS對克林霉素耐藥率最高,其次是GAS。F群鏈球菌(GFS)對二者耐藥率較低。見表2。

表2 β-溶血性鏈球菌對紅霉素、克林霉素藥物敏感性(%)

2.2耐藥基因檢測結(jié)果 ermB基因陽性率為84.4%,其中GCS、GFS對該基因攜帶率最高均為100%。mefA基因陽性率為3.1%,均在紅霉素耐藥菌株中檢出。另有1株GBH同時攜帶ermB、mefA基因,7株紅霉素敏感菌株中檢出ermB基因,與耐藥表型不符。見表3,部分耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果如圖 1所示。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增引物結(jié)果

表3 β-溶血性鏈球菌對紅霉素耐藥基因分布情況(%)

3 討論

BHS可引起人類急性扁桃體炎、咽峽炎、丹毒、猩紅熱、產(chǎn)后感染等,也可合并其它細(xì)菌感染引起混合性感染。依據(jù)細(xì)胞表面C-多糖抗原的血清凝集原理,可將其分為A、B、C、D、F、G等不同亞型。青霉素是治療BHS的首選用藥,但對于對青霉素耐藥及過敏者,紅霉素及克林霉素為治療該菌感染的二線推薦用藥。隨著免疫抑制劑、廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用,BHS對紅霉素、克林霉素的耐藥性也引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。樊節(jié)敏等[1]報道的安徽地區(qū)GAS對紅霉素、克林霉素耐藥率分別為55.0%和70%。2018年CHINET中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測報告顯示,各組鏈球菌屬對紅霉素和克林霉素的耐藥率均在56%以上,其中A組BHS對上述兩藥的耐藥率可達(dá)90%以上[2]。本研究中BHS對紅霉素、克林霉素耐藥率分別高達(dá)85.9%和87.5%,與黃青等[3]報道類似。其中克林霉素的耐藥率較高,可能與大環(huán)內(nèi)酯類藥物存在的交叉耐藥有關(guān)。另外本研究中GAS對紅霉素耐藥率也達(dá)90%以上,與全國耐藥監(jiān)測報道數(shù)據(jù)相同。其中GCS對紅霉素耐藥率為100%,GBS、GCS對克林霉素耐藥率均為100%,高于張金一等報道[4]。

GBS對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥機(jī)制主要有:erm基因介導(dǎo)的核糖體糖蛋白甲基化,導(dǎo)致藥物與核糖體親和力下降,使菌株產(chǎn)生耐藥;mef基因介導(dǎo)的主動外排機(jī)制,該基因可誘導(dǎo)紅霉素主動排出細(xì)胞外,阻止紅霉素在菌株內(nèi)聚集,導(dǎo)致菌株對紅霉素表現(xiàn)耐藥。黃青等[3]報道的安徽地區(qū)ermB、mefA基因檢出率分別為45.2%、31.1%,其中GAS、GBS、GGS中ermB基因檢出率分別為46.1%、45.2%、60%。本研究中ermB基因檢出率為84.4%,mefA基因檢出率為3.1%,其中只有GCS紅霉素敏感菌株的ermB基因?yàn)殛幮?GAS、GBS、GGS、GFS在紅霉素耐藥及敏感菌株中均出現(xiàn)ermB陽性情況,與耐藥表型不符。這可能是由于紅霉素對BHS作用靶點(diǎn)發(fā)生突變導(dǎo)致甲基化為無效修飾或存在某些抑制ermB基因表達(dá)的因素有關(guān),具體耐藥機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。另有1株紅霉素耐藥的GFS同時攜帶ermB、mefA基因,說明BHS對紅霉素的耐藥由多個基因共同引起。

綜上所述,本地區(qū)BHS對紅霉素、克林霉素耐藥率較高,且存在多重耐藥現(xiàn)象。引起大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥與ermB基因無明確相關(guān)性,并存在多種耐藥基因共同參與的現(xiàn)象,這對臨床治療BHS感染帶來一定的挑戰(zhàn)。因此,對BHS感染者應(yīng)適當(dāng)減少紅霉素、克林霉素的使用,并依據(jù)藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥。