國 蓉，張 森，袁建輝，李肖玨，周姝含，李守軍，陳燕燕*

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 阜外醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科；2.小兒心臟外科一病區(qū)，北京 100037

瘦素(leptin,LEP)是由脂肪細(xì)胞分泌,由肥胖基因編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物,被認(rèn)為是與能量平衡調(diào)節(jié)有關(guān)的激素[1]。大量研究表明,瘦素的多種生物學(xué)作用是通過結(jié)合細(xì)胞膜上靶瘦素受體(Ob gene receptor,Ob-R),啟動(dòng)相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的[2-4],但瘦素在心肌能量平衡調(diào)節(jié)中的作用尚不清楚。而低氧誘導(dǎo)因子-1a(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)通過與低氧心肌中存在的特定低氧反應(yīng)元件(hypoxia response element,HRE)結(jié)合來激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[5],對心臟的正常發(fā)育、結(jié)構(gòu)重構(gòu)和功能具有重要作用。

嬰兒體重過輕是先天性心臟病手術(shù)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。雖然既往研究對紫紺型先心病嬰兒的營養(yǎng)和生長狀況進(jìn)行了調(diào)查,但尚未明確其與血清瘦素水平之間的關(guān)聯(lián)。瘦素及其受體在心肌能量平衡調(diào)節(jié)中的作用也尚不清楚。

臨床數(shù)據(jù)檢測到HIF-1α通過與胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞的HRE結(jié)合,直接激活和調(diào)控Ob-R的轉(zhuǎn)錄[6-8],但這并非是腫瘤細(xì)胞所特有的。瘦素及其受體參與了低齡低體質(zhì)量紫紺型先心病的發(fā)生發(fā)展過程。因此,本研究目的是探討紫紺型先心病患兒瘦素及其受體的表達(dá)和HIF-1α的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患兒:本研究納入了2019年1月至2020年10月在阜外醫(yī)院先心病外科接受手術(shù)治療的52例6月齡以下的先心病患兒,根據(jù)動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)分為紫紺組30例[PaO2<90 mmHg(1 mmHg=0.133kPa),女性12例,男性18例];非紫紺組22例(PaO2≥90 mmHg,女性9例,男性13例)。參與研究者均簽署知情同意書,該研究得到阜外醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和支持。具體分組情況:所有患兒均經(jīng)臨床評估和實(shí)驗(yàn)室檢查(包括胸部X線、心電圖、超聲心動(dòng)圖和心導(dǎo)管測壓)確診。無一例患兒伴有發(fā)育異常或重度肺動(dòng)脈高壓(表1)。

表1 紫紺和非紫紺型先心病患兒的年齡、BMI、瘦素水平Table 1 Age, BMI and leptin levels in children with cyanotic and acyanotic groups

1.1.2 動(dòng)物:SPF級(jí)Sprague-Dawley雄性大鼠,4周齡,體質(zhì)量80～120 g,[北京華阜康生物科技股份有限公司提供,動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(京)2020-0004]。

1.1.3 試劑(盒):人瘦素(LEP)ELISA試劑盒和ECL超敏發(fā)光液 (賽默飛世爾科技(中國)有限公司);地高辛和 Trizol(默克化工技術(shù) (上海) 有限公司);水合氯醛 (北京雷根生物技術(shù)有限公司);甲醛緩沖液(上海聯(lián)邁生物工程有限公司);蘇木精-伊紅染色(北京艾普希隆生物科技有限公司);BCA蛋白質(zhì)含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 患兒入組情況:計(jì)算患兒入院時(shí)BMI值(體質(zhì)量/身高2),晨起6點(diǎn)至8點(diǎn)采集血液,動(dòng)脈血?dú)夥治鰷y定PaO2。手術(shù)中,在主動(dòng)脈阻斷后立即從右心室流出道獲取心肌組織。本研究經(jīng)阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過,所有患者均簽署知情同意書。

1.2.2 動(dòng)物的分組及處理:將大鼠分為常氧組、低氧組[置于10% O2(低氧) 艙內(nèi)維持4周];和地高辛干預(yù)組[于低氧第14天至第21天腹腔注射地高辛(2 mg/kg)]。

1.2.3 收集標(biāo)本,測定右室肥厚指數(shù):模型建立后從股動(dòng)脈取血樣本(0.5 mL),在血?dú)夥治鰞x中進(jìn)行分析。然后打開胸腔后立即取出心臟,并將其解剖成右心室(right ventricle,RV)、左心室+室間隔(left ventricle+ventricular septum,LV+S),通過測定重量以獲得右室肥厚指數(shù)(RV/LV+S)。

1.2.4 HE檢測組織學(xué):分離心臟,用3.7%甲醛緩沖液固定,石蠟包埋,連續(xù)切片用蘇木精-伊紅(HE)染色。在HE染色切片上,示蹤100～200個(gè)心肌細(xì)胞核清晰的心肌細(xì)胞輪廓。常規(guī)光鏡檢查和奧林巴斯圖像分析儀系統(tǒng)用于組織學(xué)分析。

1.2.5 RT-qPCR檢測基因表達(dá):取心臟組織80～100 mg,轉(zhuǎn)移到消毒好研磨缽中,加液氮研磨成粉末,參照 Trizol 法提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度法測定RNA的濃度,擴(kuò)增Ob-R的引物序列,上游為: 5′-CA-GATTCGATATGGCTT AAATGG-3′, 下游為: 5′-GTTAAAAT-TCACAAGGG AGGCA-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物的長為 474 bp。擴(kuò)增內(nèi)參照 β-actin 基因的引物序列,上游為 5′-CGTAAAGACCTC-TATGCC AA-3′,下游為 5′-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為473 bp。PCR的反應(yīng)條件為: 94 ℃ 45 s,57 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,紫外照相并行圖像分析。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá):取80～100 mg心臟組織,按照說明書方法提取總蛋白,BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。加入5×上樣緩沖液,煮沸后經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電(SDS-PAGE,8%)分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉,孵育一抗β-actin(1∶5 000)、LEPR(1∶2 000)、HIF1-α(1∶1 000),4 ℃過夜,TBST洗膜3次,二抗常溫孵育1.5 h(1∶10 000),TBST洗膜3次,電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色曝光,經(jīng)Image J軟件處理并分析圖像。

1.2.7 ELISA檢測血清瘦素和VEGF水平:4 ℃、3 000×g,離心20 min,取血清保存在-80 ℃。用ELISA試劑盒測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清瘦素水平與BMI正相關(guān)

與非紫紺型相比,紫紺型先心病患兒的BMI水平明顯降低(P<0.001)(表1)。

紫紺組VEGF平均水平高于非紫紺組(P<0.05)。而血清瘦素水平無差異。經(jīng)BMI校正(瘦素/BMI)的血清瘦素水平在紫紺組高于非紫紺組(P<0.05)。先心病患兒的血清瘦素水平與BMI呈顯著正相關(guān)(r=0.335,P=0.018 6)(圖1)。

圖1 先心病患兒瘦素水平與BMI呈正相關(guān)Fig 1 Correlation between leptin levels and BMI in children with CHD

After 4 weeks of hypoxia (Hyp), HIF-1α and Ob-R were quantitatively detected by Western blot; Ob-R.Ob gene receptor receptor; *P<0.05 compared with the ayanotic group.

2.2 紫紺心肌HIF-1α過表達(dá)與低氧促進(jìn)的Ob-R表達(dá)

紫紺組HIF-1α蛋白表達(dá)增加。作為陽性對照,HIF-1α過表達(dá)后VEGF mRNA表達(dá)也明顯增強(qiáng)。隨著HIF-1α蛋白的過表達(dá),Ob-R蛋白及mRNA表達(dá)水平也相應(yīng)增加(圖 2)。

2.3 HIF-1α抑制劑可降低心肌組織Ob-R的表達(dá)

低氧組心肌組織Ob-R mRNA表達(dá)較常氧組顯著升高, 地高辛組Ob-R mRNA表達(dá)水平較低氧組下降。地高辛明顯抑制低氧組HIF-1α的表達(dá)。隨著HIF-1α的表達(dá)下調(diào)后,Ob-R的蛋白水平也明顯低于對照組 (圖3)。抑制Ob-R的表達(dá)的同時(shí)既增加了紫紺大鼠體質(zhì)量 (P<0.05)(圖4),又改善了右室心肌重塑程度 (圖5)。

Hypoxic rats were given digoxin (2 mg/kg), and saline was used as a control; after 4 weeks of hypoxia, Ob-R was quantified by Western blot (7 rats in each group);*P<0.05 compared with the normoxia group; Hyp.hypoxia;Ob-R.Ob gene receptor receptor;# P<0.05 compared with the hypoxic group.

Hypoxic rats had significant body mass loss compared to normoxic rats, but weight loss was improved after hypoxic rats received digoxin.No significant differences were observed between hypoxic and hypoxic controls; Hyp.hypoxia; *P<0.05 compared with the normoxia group; # P<0.05 compared with the hypoxic group.

A.Hyp rats in normoxia group; B.hypoxia group; C.Hyp rats in hypoxia control group had obvious right heart enlargement, disordered arrangement of myocardial cells and myocardial fibers, broken, missing, and blank areas; D.while Hyp-digoxin group the arrangement of myocardial cells was more regular, and the morphology of RV was also improved than before; RV/LV+S.weight ratio of right ventricle to left ventricle plus septum ;*P<0.05 compared with the normoxia group; # P<0.05 compared with the hypoxic group.

3 討論

瘦素參與了多種疾病的發(fā)病機(jī)制[5,9-10],先天性心臟病患兒生長遲緩的原因是多因素的。在紫紺型先天性心臟病中,許多患兒表現(xiàn)出明顯的脂肪減少。在本研究中,紫紺組的體質(zhì)量、BMI明顯低于非紫紺組,紫紺組和非紫紺組的瘦素濃度相似可能是意想不到的,但經(jīng)BMI校正過的瘦素水平呈現(xiàn)顯著差異。先心病患兒循環(huán)系統(tǒng)中血清瘦素與BMI呈顯著正相關(guān)。

由于Ob-R的變化對瘦素刺激的敏感性至關(guān)重要[11],Ob/Ob-R軸參與了紫紺型先心病患兒的能量代謝。闡明Ob-R調(diào)節(jié)機(jī)制有助于了解先心病患兒心肌組織能量代謝的情況。在本研究中,Ob-R在心肌組織中的表達(dá)與HIF-1α的表達(dá)高度相關(guān);低氧導(dǎo)致Ob-R mRNA和蛋白的表達(dá)增加。

既往研究通過對Ob-R啟動(dòng)子區(qū)域的篩選,發(fā)現(xiàn)位于HIF832/-828區(qū)域的3個(gè)潛在的HRE是結(jié)合HIF-1α和增強(qiáng)Ob-R表達(dá)的關(guān)鍵元件[12-14]。臨床資料還檢測到瘦素、Ob-R和HIF-1α在乳腺和結(jié)腸疾病中的相關(guān)性,進(jìn)一步支持瘦素和Ob-R都是HIF-1α的靶基因,但本研究創(chuàng)新性的證實(shí)了在心肌中表達(dá)的相關(guān)性。紫紺組Ob-R表達(dá)顯著增加,證實(shí)了Ob/Ob-R軸參與了心肌的能量代謝,其內(nèi)在機(jī)制作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

地高辛是臨床常用的正性肌力藥物,也是HIF-1α的特異性抑制劑[15]。對于Ob-R高表達(dá)的患者,特異性的HIF-1α抑制劑可能有利于改善低齡紫紺型先心病患兒的能量代謝,如果HIF-1α調(diào)節(jié)Ob-R的表達(dá),HIF-1α的下調(diào)可能會(huì)削弱這種作用。地高辛動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,阻斷HIF-1α的表達(dá)可以下調(diào)Ob-R的表達(dá),不僅可以改善紫紺大鼠體質(zhì)量,還可以改善右室重構(gòu)。

綜上所述, Ob-R在心肌組織中顯著表達(dá),HIF-1α可直接調(diào)節(jié)Ob-R的表達(dá),Ob/Ob-R系統(tǒng)可能是進(jìn)一步改善低齡紫紺型先心病患兒預(yù)后的新途徑。